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这个帖子发布于8年零226天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我的蛋白是大肠杆菌重组表达的，80KD左右，在包涵体中，接有histag，用Ni柱纯化挂不上柱，后预测了一下等电点为5.4左右，故采用了阴离子交换柱纯化，柱子是GE的1ml的HiTrap Q FF，starting buffer为20nm的Tris,PH9.0,结果是蛋白挂不上柱，把样品中尿素透析后还是挂不上柱。不知道问题出哪了，请各位大虾指教，不胜感激！
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我觉得用ni柱是最方便，最容易的。一般都是阴离子挂不住了，然后就换到NI柱了。你的蛋白太大了80kD，虽然理论上小于500kd都可以用阴离子柱，但是我的经验的确超过50kd，挂阴离子的确不那么容易的。我建议你还是用Ni柱，要注意的一点是你的buffer中不要加入ARG之类的可以和NI相互作用的小分子，NI柱按照mannul，仔细处理应该问题不大的。
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谢谢yunerwenyu！我一开始就是用Ni柱纯化的，我们实验室也有完整的protocol,但试了几次都挂不上柱的，后来才考虑用离子交换的，问一下ARG是什么？
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你这个是包涵体的离子交换纯化，你的蛋白溶解在8M脲中，对吧？ 如果是这样，Starting Buffer 和Elution Buffer里面都要含有8M脲的，这样才能在变性条件下上离子交换柱纯化蛋白，这些介质在8M尿素里应该没关系。你想，如果你的蛋白是变性的，而上样里面没有尿素，蛋白都沉淀了，怎么挂柱？如果Ni柱实在不行，包涵体洗涤后溶解在含8M脲的Starting Buffer内，离子交换纯化
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panrong 谢谢yunerwenyu！我一开始就是用Ni柱纯化的，我们实验室也有完整的protocol,但试了几次都挂不上柱的，后来才考虑用离子交换的，问一下ARG是什么？Arg：Arginine因为复性buffer里面通常含有Arg.本来想问一下您有没有带His-Tag的蛋白来验证Ni column没问题，不过您说实验室有完整的protocol应该是没问题了；20 nm Tris？是笔误吧？请问您在做阴离子交换之前conductivity是多少？希望不是很高。我有段时间做cation exchange也是发现蛋白没挂柱，后来降低了cond就好了。 PI 5点多，除了his外还有没有其它氨基酸？算上没有？供您参考～
amberly edited on
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conductivity，是盐浓度的意思吧？坦白的说，我纯化蛋白也有几百个了，（包括复性），我一直觉得蛋白很少有不挂ni柱的。考虑蛋白是包含体，histag被降解掉的可能性非常的小，还是怀疑你的ni柱有问题的。建议你象amberly兄所说的作个正对照。尤其是变形的条件下，应该更加容易挂柱才对。1、pH最好在8左右。2、上样的时候，一定要让填料和你的蛋白样品用磁子搅拌半个小时（我怀疑你是直接将蛋白流过了柱子，这样效果很差）。
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riboenzyme 你这个是包涵体的离子交换纯化，你的蛋白溶解在8M脲中，对吧？ 如果是这样，Starting Buffer 和Elution Buffer里面都要含有8M脲的，这样才能在变性条件下上离子交换柱纯化蛋白，这些介质在8M尿素里应该没关系。你想，如果你的蛋白是变性的，而上样里面没有尿素，蛋白都沉淀了，怎么挂柱？如果Ni柱实在不行，包涵体洗涤后溶解在含8M脲的Starting Buffer内，离子交换纯化之前试过的，starting buffer 和elution buffer里都含有8M脲 ，发现蛋白挂不上柱，怀疑脲有影响，后来就用starting burrer 透析了样品，去除脲的影响，蛋白仍挂不上柱，透析时蛋白有沉淀，离心后上清还是有目的蛋白的，用上清上样。starting buffer 是20mM的tris，笔误了
关于丁香园Resource Q柱蛋白不挂柱，求助
14:43:13&&&来源：&&&评论：&&
Resource Q柱蛋白不挂柱，求助 敢问各位高手，我的蛋白等电点是5.14，用Resource Q柱纯化，蛋白不挂柱，缓冲液用过ph8.0,8.5,9.0的Tris,甘氨酸都不挂柱，敢问各位高手有何高见？急啊。…
敢问各位高手，我的蛋白等电点是5.14，用Resource Q柱纯化，蛋白不挂柱，缓冲液用过ph8.0,8.5,9.0的Tris,甘氨酸都不挂柱，敢问各位高手有何高见？急啊。回复:
8月21号的贴子，过了这么久了。。。估计问题也解决了吧。。。
Resource Q柱，强阴柱，如果全穿透了，我会首先考虑buffer 的pH值是否准确，样品本身电导是否过高（盐），另外最好把柱体积（CV），上样量和流速等等参数说一下，还有，你蛋白如果pI是5.14,酸性蛋白，可以用低一个pI的阳离子SP，CM柱(5.14真是低呢)或高一个pI的Q柱，DEAE柱，buffer的pH远高于pI了，不会对蛋白活性有影响么？回复:
再补充一下，buffer的话6.0-8.0如果与填料没冲突可以用PBS，大于7.5可以用20mMTris,4.0-6.0用醋酸。如果用的预装柱，Q柱的负载量还是很不错的，平衡好后高浓度上样（进样时flow我一般喜欢调低），梯度洗脱或步进洗脱时速度可以比较快。这里没有Q柱的图，给个自己做的DEAE SepharoseFF的图吧：
多谢赐教。用25mMTris,2mMDTT,pH8.5的A液前几天做成功过一次，纯化效果特好，可是接着再做就又不行了，要不不挂柱，要么就是挂上点每个洗脱浓度都有峰全是目标蛋白跟杂蛋白混杂，不知是什么原因，Buffer是同一台ph计调的，上样量，速度等所有条件都跟前次相同。回复:
我用的是Resource Q 1 ml柱,上样量16ml和上样速度3.5ml/min,洗脱速度1.5ml/min.AKTA purifier。请帮我想一下问题在哪吧，实在是找不出为什么来。另外我觉得可能PH8.5确实对蛋白有影响，我做成功的那次接着做分子筛离心后管底有大量的沉淀。回复:
离子交换的重复性一直是个问题，要每次获得好的结果很难
1.上样量16ml虽然可以，不过我倾向于浓缩后上浓一点的样，可适当调低上样速度，但是要注意小预装柱换流速（从高换到低）时基线会上抬，出现像锯齿一样的波形，从低打到高不会出现
2.pH值相差0.4pKa都会有很大影响，一定要准，否则一定重复不出来。pH计我们是定时交由中心室校对，pH标准品标明有效期，切勿混淆，污染。
3.同一预装柱使用次数的问题。第一次使用当然是没问题，但是使用三四次以后效果明显降低了。可能是我自己保养的问题，但是也涉及到柱子的清洗和的再生。1mL的预装柱是5个一盒卖的吧。如果蛋白量大，又要长期做的话，反复用一个小柱子是不适合的。我自己是用小kit盒摸了条件后优选出一个又订了空柱子和的。回复:
多谢赐教，如果我Buffer A里加了40mmol氯化钠的会影响挂柱吗？我这几次的尝试都是不挂柱，但能洗脱下来少量目标蛋白混的杂蛋白在胶上看比脱盐后多很多。回复:
既然你前面挂柱时每个洗脱峰都有目的蛋白，可能有盐存在会有一定的影响，可以把盐去掉，上样前测一下电导，流速调慢一点再试一下。另外你蛋白的状态不是很好，容易沉淀，杂蛋白与目的蛋白分不开，你看一下过分子筛时是不是在外水出峰，有可能目的蛋白和杂蛋白是一团东西。我碰到过这种情况，加了各种变性剂和去污剂都打不开。也碰到过一种蛋白挂阴、阳离子柱都不挂。回复:
多谢赐教，现在是杂蛋白挂柱，目标蛋白挂柱量较少，我就用的穿过浓缩后上分子筛，可他并不在外水体积处出峰，而是在柱子后三分之一处出峰。搞不清原因。回复:
既然不在外水出峰，应该蛋白状态还可以，估计重复不出来是什么细节没注意到，要不再试一下mono-Q看看，结合力挺强的。回复:
多谢赐教，现在能搞了，让杂蛋白挂柱，目标蛋白穿过。但是现在的问题是一经浓缩就沉。回复:
你好，我想请教您用过NI柱么？我在用NI柱的时候碰到不挂柱的问题，我也不知道什么原因，但是以上样后蛋白大部分都透过了，请赐教回复:
首先你表达的蛋白是带his tag 吗?即是克隆成功的吗?,然后就看你的的ph值，三ni柱有没有问题。我也是菜鸟，大家相互学习了。
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提供高盐环境、洗去高浓度盐离子的同时使DNA留在柱上、洗脱DNA,可以打电话给技术支持问一下哦.
请问，提供高盐环境，洗去高浓度盐离子的目的分别是什么？谢谢你！
高盐环境下DNA才会吸附在柱上。DNA溶液中含高浓度盐会影响进一步的酶切、连接等反应。
binding buffer 改变DNA pH等性质，以便结合柱子spw wash buffer洗掉杂质elution buffer洗脱DNA