产品名称：基因敲除敲进模式小鼠
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&基因敲除敲进模式小鼠定制- 百奥赛图基因敲除敲进模式小鼠定制&的 详 细 说 明
& 基因敲入及基因敲入小鼠 & 基因敲入(Knockin)是根据实验要求，在目的基因位置引进特定的突变或外源基因。比如在目的基因上引入点突变(模拟人类遗传疾病模型)；或将报告基因(如EGFP，mRFP，mCherry，mYFP，Thy1.1或LacZ等)通过同源重组的方式引入目的基因的特定位点，从而可以通过报告基因的表达跟踪目标基因的表达。也可以用报告基因取代小鼠本身的基因，使敲除/敲进同时发生。 服务流程 A. 打靶载体构建：（1-2个月） 包括：基因结构分析、筛选策略设计、探针设计/构建和证实、打靶载体构建（体内重组工程）、核实（同源臂、Neo原件盒、报告基因）、制备电转用DNA；Southern杂交探针设计和优化。 B. ES细胞培养和电转（2-3周） & ES细胞的培养和将打靶载体电转进ES细胞。 C. 阳性克隆的分离和筛选（3-5周） 通过PCR和Southern杂交对抗生素抗性ES细胞和阳性ES细胞的筛选； 对阳性ES细胞进行核型分析； D. 阳性ES细胞扩大培养和显微注射（2-3个月） &将核型正确的阳性ES细胞显微注射/转移到囊胚中，将囊胚植入代孕母鼠，嵌合体小鼠的出生 E. &嵌合体小鼠与野生型C57BL/6小鼠交配得到F1代小鼠，通过基因型检测确认得到杂合子（2-3 月） 。 F. 小鼠运输。 需要您提供的信息 您只需告诉我们基因名字和您的特殊要求。如果您没有相关的经验，我们会免费为您提供咨询，根据您的需求为您提供最佳的设计方案。 我们给您的终产品 不少于两只的F1杂合子小鼠以及相关实验数据。我们会提供给您相关的检测方法和最终检测报告，您也可以自己进行核实检测，也可以在我们的帮助之下完成。 服务说明 在您的课题进行过程中，我们会每两个周为您发送一次课题进展汇报，内容包括课题进展的每一步结果（包括电泳图、PCR结果、酶切结果和杂交结果等），让您清楚的了解自己课题的进展情况，就如同自己的学生在做lab meeting 一样。
本公司还供应上述产品的同类产品：基因嵌入小鼠,条件性敲除小鼠,全基因敲除小鼠
北京百奥赛图公司提供基因敲除模式小鼠定制化服务
北京百奥赛图基因生物技术有限公司 (Beijing Biocytogen Co., Ltd.) 是由具有多年模式动物研发经验的留学生团队，在美国创立Biocytogen生物公司并成功运营后，于2009年11月成立，位于北京经济技术开发区的高科技生物技术企业。 公司的目标是为国内外客户提供专业、快速的基因敲除模式动物开发与服务。
公司充分利用其快速整合中美两国优势资源的能力，建立起由“独特的基因打靶载体构建技术”、“传代稳定的C57BL/6遗传背景的小鼠胚胎干细胞”、“精确的显微注射系统”组成的基因敲除小鼠开发与服务平台, 和以CRISPR/Cas9/TALEN技术为核心组建的基因敲除/基因嵌入模式动物开发与服务平台。截止2014年底，以两大平台为依托，已经和正在开发基因敲除/基因敲入小鼠近600种，基因敲除/敲进大鼠50余种，基因敲除/敲进细胞系40余种，灵长类动物4种（与科研院所合作）、斑马鱼5种，成为国际上基因敲除/嵌入模式动物开发最具实力公司之一。
公司凭借其独特的技术开发平台、规范的技术操作系统、严格的质量评价体系以及一支开发经验丰富、专业知识互补、执行力强的骨干人才队伍，在成立五年多的时间里，已经建立起国内外广泛的技术服务网络。服务群体不仅包括以哈佛大学，NIH, 东京大学，牛津大学，北京大学，清华大学，中科院动物所，中科院神经所等为代表的国内外科研学术机构，也包括以协和医院、北大医院等为代表的科研实力强大的综合性医院，更包括以强生、罗氏、GSK、默克等为代表的国际顶尖医药企业。
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基因敲除小鼠技术
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3秒自动关闭窗口陈栋1& 焦学龙1& 高学军1& 王磊2& 石宝昌2& 崔海宁2（1青岛大学医学院附属医院普外科&& 山东青岛& 266003）（2海南医学院附属医院普外科&& 海南海口&& 517010）&
&&&&&&& 放射性肠道损伤是放、化疗治疗腹部及盆部肿瘤病人的常见并发症，肠道干细胞凋亡是导致损伤的主要原因[1-2]。Slug是转录因子家族中编码锌指蛋白的基因，具有凋亡抑制作用，可保护细胞免受细胞毒性损伤[3]。我们前期的研究发现，Slug过表达能保护体外IEC6细胞免于射线损伤[4]，但Slug敲除后能否促进体外、体内肠道干细胞损伤还不明确。
&&&&&&& 为研究Slug对放射性肠道损伤的作用，本研究首先建立Slug基因敲除小鼠模型，旨在为今后的研究做准备，也为放射性肠道损伤的预防治疗提供新思路。
&&&&&&& 1. 材料和方法
&&&&&&& 1.1主要材料
&&&&&&& Slug基因敲除打靶载体由上海南方模式生物研究中心构建，各种限制性内切酶、T4、DNA连接酶、Taq酶及PCR试剂等购自TaKaRa及NEB公司，DNA marker购自晶美生物工程公司，质粒抽提试剂盒及凝胶回收试剂盒购自Qiagen公司。细胞培养所需试剂为Invitrogen公司产品。引物合成和测序由上海英骏生物技术有限公司完成。ES细胞株Tc-1由美国国立卫生研究院的王中向博士惠赠。C57BL/6J小鼠由南方生物模式研究中心提供。
&&&&&&& 鼠尾基因组DNA裂解液，PCR相关试剂，Southern印迹相关试剂购自TaKaRa公司。[&-32P]dATP购自亚辉公司，硝酸纤维素膜购自S&S公司。
&&&&&&& 1.2 小鼠胚胎的获取与处理
&&&&&&& 引颈处死妊娠14天的雌鼠，75%酒精消毒，打开腹腔、取出有胚胎的子宫。在PBS中将胚胎从子宫中解剖出来，去除卵黄囊、羊膜和胎盘，将胎鼠在新的PBS中洗两次。将胚胎的头和内脏去除，用消毒剪刀将胎鼠剪成小的碎片。将胎鼠碎片转移到15 ml离心管，1000 rpm离心2 min。将上述处理的胚胎碎片弃上清，加入5 ml 0.25%EDTA-胰酶，37℃处理30 min，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，反复吹打，1000 rpm，离心2 min。弃上清，加入滋养层细胞培养液并将细胞转移到150mm培养皿中，置于含5%CO2的培养箱中培养2-3天，通常第三天胚胎成纤维细胞长满培养皿，该细胞即是原始小鼠胚胎成纤维细胞。
&&&&&&& 1.3小鼠ES细胞的培养
&&&&&&& ES细胞每2-3天按照1：3的比例传代一次。培养ES细胞的培养皿在接种培养层细胞前用0.1%明胶处理。传代过程：弃去原培养基，加入1.5 ml 0.25%胰酶消化5 min后，加入含有15%血清的DMEM高糖培养基中和胰酶反应。用吸管轻轻吹打，直至成为单细胞悬液。将细胞悬液按1：3的比例转移到新的含有饲养层的35 mm细胞培养皿中，补加相同培养基。将细胞悬液摇匀后，放入5%CO2、37℃培养箱中培养。每日换液，细胞长满继续传代。
&&&&&&& 1.4 ES细胞的电转及加压筛选
&&&&&&& 采用电转方法转染ES细胞，其条件参照文献[5]。
&&&&&&& 1.5鼠尾基因组PCR
&&&&&&& 提取高质量鼠尾基因组，将DNA重悬于50&l TE中，37℃过夜溶解，可用作Southern印迹实验。基因组DNA的粗提：剪鼠尾约0.5 cm放入Ep管中，加入100&l SA液，置于95℃，50 min。加SB液100&l于Ep管内，震荡20次，3000 rpm离心10 min，取70&l上清备做PCR分析。RT-PCR引物（F：Forward,上游引物；R：Reverse,下游引物）
&&&&&&& Slug 1 F:GGAAATTCTGCGGGAAAGGG& R:AGGACGGCGGGAGTGTTGGA；Slug 2& F:GCTATCTTGCCC
ACCCTACTC R:GTCACCCAGTCCCTGAACCT；Slug 3& F:AAATTCTGCGGGAAAGGGAT& R:CCAGGGTGAA
CTTGCTGTGAT；Slug4& F:CCAAGAGCAGGAGCAAGAAA& R:ATCAGGTCTAATGTTAGCATCCC；（注：4对引物为解决Slug第三个外显子敲除问题设计，其中Slug1为413bp，Slug 2为551bp ，Slug 3为205bp，Slug 4为319bp）。基因型鉴定引物：Slug WT1:GTT CTG CTT TTG TCA CTA GAC ACT TGT TTT CTG CC& Slug WT2:TGG TTT CCC CTC GGA CCT GTA GGA AG
&&&&&&& 1.6 Western blot 分析
&&&&&&& 提取组织或细胞中总蛋白，参照说明书检测细胞内Slug蛋白表达。
&&&&&&& 1.7 Southern印迹鉴定基因敲除小鼠
&&&&&&& 用XbaⅠ在50&l体系内消化提取的鼠尾基因组DNA，37℃过夜，然后进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后在紫外灯下照相，同时在凝胶边缘放置荧光尺记录迁移距离。在此步骤观察基因组DNA是否变成弥散状，如是则说明酶切成功。可以进行下一步实验。将胶进行修整，在Marker位置将上侧切角做标记，置于足够体积的0.25 M的HCl中浸泡，于摇床慢摇10-20 min，目的是使得较长片段断裂，有利于转膜。弃去盐酸，用去离子水冲洗2次，将凝胶置于足够体积的变性液中（1.5 MNaCl，0.5 M NaOH）浸泡45 min，摇床慢摇。目的是将DNA变性，有利于转膜。弃去变性液，去离子水冲洗2次，加入足够体积中和液（0.5 M Tris-Cl，pH，1.5 M NaCl），浸泡45 min，摇床慢摇。中间换液1-2次。目的是将pH值调回至适合转膜状态，同时继续增加盐离子浓度，有利于转膜。将凝胶置于20&SSC中，室温慢摇30 min。利用虹吸原理转膜，使得DNA从琼脂糖凝胶中转移到硝酸纤维膜上， 转膜完毕后用铅笔标记加样孔位置，2&SSC漂洗1 min，将膜夹在滤纸中间80℃干烤2 h。将烤干的膜置于含有预杂交液（10&Denhardt&s，4&SET,0.1%SDS,100&g/ml变性的鲑精DNA）的杂交瓶中，杂交炉温度为65℃，预杂交时间为1 h。在进行预杂交同时，进行探针的标记。将DNA探针和鲑精DNA于100℃加热5 min使其变性，迅速置于冰上预冷5 min，取50&l&-32P标记的DNA探针和100&l变性的鲑精DNA（10 mg/ml）加入新的预杂交液中。于杂交瓶中杂交过夜。将膜转移至漂洗液中（0.4&SET，0.1%SDS）中，于杂交瓶中洗三次，每次10 min。将膜置于滤纸间干燥，用保鲜膜包好夹在X光片中放进压片盒内，置于-70℃曝光1周后于暗室显片。
&&&&&&& 2. 结果
&&&&&&& 2.1 Slug嵌合体获得
&&&&&&& Slug打靶载体经NotⅠ线性化后，电转(600 V，25&F)入小鼠ES细胞内。电转后24小时更换含有G418和Gancyclovir抗性的培养基进行加压筛选。利用G418筛选可以得到含有新霉素基因(neomycin)的ES细胞，这种细胞发生了打靶载体的插入，但是G418筛选无法排除打靶载体随机整合入基因组进而获得抗性的细胞；潮霉素B则用来筛选不含有胸苷激酶(tk)的细胞，被杀死的细胞为打靶载体随机整合入基因组进而获得抗性的细胞。这样利用&正负筛选&可以使得中靶细胞得到最大程度的富集。ES细胞在正负筛选培养基中培养7天后，挑取仍然存活的抗性ES克隆，以进行扩增培养。扩增后的抗性ES细胞克隆分成两份一份冻存,以备确定中靶细胞序列号后进行扩增培养和后续的囊胚注射；一份用来提取基因组DNA，进行中靶细胞的筛选。我们对挑取的96个克隆通过PCR策略初筛，得到3株中靶细胞，经Southern印迹的进一步验证，确定得到中靶细胞2株，排除的1株证实为PCR过程中出现的假阳性导致。将Southern印迹确证的中靶细胞复苏，于24孔板内扩增之后，进行囊胚注射，获得Slug的嵌合体小鼠。
&&&&&&& 2.2 Slug敲除小鼠的获得
&&&&&&& 由于囊胚来源于黑色的C57BL/6J小鼠，ES细胞则来源于褐色的129Sv小鼠，这样囊胚注射后出生的嵌合体小鼠会出现黑色、褐色及黑褐相间的花色。褐色在小鼠毛色中占的比例越高，说明注射的中靶细胞整合入囊胚的比例越大，从而将突变基因稳定遗传下去的几率也就越高。8只受体雌鼠经胚胎移植后，共生小鼠22只，其中6只灰色雌鼠和2只黑色雄鼠利用PCR筛选无法扩增到预期的突变型，说明没有发生嵌合。剩余14只均可以扩增到预期的突变型，为嵌合体小鼠。14只嵌合体雄鼠中，2只为高度嵌合，毛色为褐色；4只中度嵌合，毛色为黑色褐色相间的花色；剩余8只均为低度嵌合，毛色为黑色。14只嵌合体雄鼠性成熟后，与野生型的C57BL雌鼠交配，其中2只褐色和1只花色嵌合小鼠可以将Slug突变基因传至子代，得到杂合子小鼠。
&&&&&&& 2.3 Slug敲除小鼠的确证
&&&&&&& 杂合子小鼠合笼交配后子代可育。我们对断奶后的子代利用Southern印迹、RT-PCR和Western印迹实验分别在DNA、RNA和蛋白水平证实了Slug的敲除（Fig.1）。成功得到了Slug敲除的纯合子小鼠。进一步的分析显示，Slug纯合子小鼠交配，可以得到后代，即：Slug敲除的小鼠可育。杂合子小鼠子代基因型符合孟德尔遗传定律。
&&&&&&& Figure 1.Generation of Slug-deficient mice.A ,Analysis of the homologous recombination at different levels.PCR analysis of genomic DNA from Slug wild-type(WT),heterozygous,and homozygous mice.B,RT-PCR analysis of Slug expression using total RNA.& C,Southern blot analysis of the homologous recombination to the targeting construct.
&&&&&&& 3.讨论
&&&&&&& 利用基因工程小鼠研究基因功能是一种常用的实验策略。鉴于在ES细胞中发生同源重组的概率大大低于随机整合，我们筛选中靶细胞时采用的是正负筛选法，这种方法利用2种抗性基因，一正一反，将没有发生同源重组和发生随机整合的ES细胞杀死，来达到富集发生同源重组中靶细胞的目的。我们挑取了96个克隆，其中中靶细胞为2个，中靶概率2.1%。如此之高的中靶概率，使得采用Southern印迹直接筛选中靶细胞成为可能。对这96株细
胞我们全部进行了Southern印迹筛选，同时利用PCR策略进行了初筛,确定候选中靶细胞为3株。Southern印迹实验显示中靶细胞为2株，在PCR初筛的候选范围之内。这提示我们，对于Slug中靶细胞的筛选策略来说，PCR初筛过程中可能出现一定的假阳性，原因我们认为是挑取抗药单克隆过程中克隆挑取不纯，或者在基因组提取过程中出现了DNA的污染导致。而利用Southern印迹实验，则可以避免这一问题。这样我们在今后的中靶细胞筛选过程中就可通过PCR的方法初筛，将候选中靶细胞的范围缩小，然后再进行小规模的Southern印迹验证即可。但对于一些在PCR过程中容易出现假阴性的筛选策略来说，只能靠大规模的Southern印迹实验来筛选那些珍贵的容易在PCR过程中遗漏的中靶细胞。
&&&&&&& 选择敲除策略时，我们选择的是针对Slug第三个外显子进行的敲除，因为第三个外显子主要编码的是Slug位于N端的PH结构域，这主要考虑万一敲除不彻底进而产生截短体蛋白，那么该蛋白也已经丧失了介导其质膜定位的PH结构域，进而使得Slug丧失了原有的功能。结果表明对Slug敲除小鼠进行DNA，RNA和蛋白水平的验证，确实无法检测到野生型位点的存在。在转录水平，如果从第三个外显子内设计引物，在敲除小鼠内无法扩增到野生型条带，跨过第三个外显子的引物可以得到截短体的条带。这提示，在Slug的第三个外显子敲除之后，RNA水平还存在部分Slug缺失第三个外显子的RNA存在，但是这种RNA可能因为丧失了稳定性，无法进一步翻译成蛋白。
&&&&&&& 综上所述，我们将设计好的打靶载体电转至ES细胞，利用ES细胞内的同源重组机制将打靶载体置换入ES细胞基因组内，通过正负筛选得到中靶细胞，进而将经过PCR和Southern印迹验证的中靶细胞用囊胚注射技术植入囊胚。受孕母鼠所生嵌合体小鼠可以成功将携带的Slug突变基因传代至杂合子。Slug敲除小鼠可以存活，可生可育。Slug小鼠杂合子代符合孟德尔遗传定律，肉眼观察敲除小鼠无明显缺陷性表型，具有生育能力。
[1]Hendry JH, Booth C, Potten CS.Endothelial cells and radiation gastrointestinal syndrome. Science. 6):1411.
[2]Lindsay KJ, Coates PJ, Lorimore SA, Wright EG.The genetic basis of tissue responses to ionizing radiation. Br J Radiol. -6.
[3]Wu WS, Heinrichs S, Xu D, Garrison SP, Zambetti GP, Adams JM. Slug antagonizes p53-mediated apoptosis of hematopoietic progenitors by repressing puma. Cell : 641-653
[4]迟绍云;焦学龙;王宝泉;刘春生;王蕾;陈栋.Slug减轻照射鼠肠上皮细胞损伤及作用机制.基础医学与临床.):39-42
[5]《基因打靶技术》杨晓，黄培堂，黄翠芬主编.科学出版社，2002.
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