抗pd-1抗体及其应用的制作方法
抗pd-1抗体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了以高亲和力与PD-1特异性结合的抗体或其功能性片段。还提供了编码本发明抗体或其功能性片段的核酸分子，用于表达本发明抗体或其功能性片段的表达载体和宿主细胞，以及本发明抗体或其功能性片段的生产方法。本发明还提供了包含本发明抗体或其功能性片段的免疫缀合物以及药物组合物，以及使用本发明的抗体或其功能性片段治疗多种疾病(包括癌症和感染性疾病、炎性疾病)的方法。
【专利说明】抗PD-1抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及以高亲和力与ro-i特异性结合的抗体或其功能 性片段。还提供了编码本发明抗体或其功能性片段的核酸分子，用于表达本发明抗体或其 功能性片段的表达载体和宿主细胞，以及本发明抗体或其功能性片段的生产方法。本发明 还提供了包含本发明抗体或其功能性片段的免疫缀合物以及药物组合物，以及使用本发明 的抗体或其功能性片段治疗多种疾病（包括癌症和感染性疾病、炎性疾病）的方法。
【背景技术】
[0002] 程序性死亡因子1 (programmed cell deathl，PD-1)是⑶28家族成员，并且是 在活化T细胞和B细胞表面上表达的免疫抑制性受体（Yao，Zhu et al. Advances in targeting cell surface signalling molecules for immune modulation. Nat Rev Drug Discov，):130-146)。该受体和其配体PD-L1和PD-L2相结合可以有 效降低免疫T细胞参与的免疫应答。肿瘤细胞通过高表达ro-Li逃逸机体内免疫监督 (Okazaki 和 Hon jo, PD-1 and PD-1 ligands ：from discovery to clinical application. International Immunology，) :813-8242007)。阻断 PD1 与 PD-L1 的相互作用可 以显著提高CD8+细胞毒T细胞的活性，以杀伤肿瘤细胞。
[0003] ro-Ι主要表达于⑶4+Τ细胞、⑶8+Τ细胞、ΝΚΤ细胞、Β细胞和活化的单核细胞 表面，主要受T细胞受体（TCR)或B细胞受体（BCR)信号的诱导表达，TNF可增强ro-1 在这些细胞表面的表达（Francisco，Sage et al.，The PD-lpathway in tolerance and autoimmunity. Immunol Rev， :219-242)。人Η)_1 由基因 Pdcdl 编码，位于 2q37. 3， 全长9. 6kb，由5个外显子和4个内含子组成，其上游包含663bp的启动子。ro-1分子结构 由胞外区、跨膜区和胞内区构成，胞外区的氨基酸序列和CTLA-4有24%的同源性，和CD28 具有28%的同源性，其基因主要有7个单核甘酸多态性位点。胞外区含有一个免疫球蛋白 可变区IgV结构域，胞内区含有两个基于酪氨酸的信号转导模体ITIM(免疫受体酪氨酸抑 制作用模体）和itsm(免疫受体酪氨酸转换作用模体）。在τ细胞被激活后，ro-i主要通 过ITSM模体，将酪氨酸磷脂酶SHP2集合，导致包括⑶3 ζ、PKC Θ和ZAP70等效应分子的去 磷酸化。
[0004] PD-1 配体有两个：PD-L1 和 PD-L2。PD-L1 又称 B7H1 或 CD274, PD-L2 称为 B7DC 或CD273。H)-L基因位于人的染色体9p24. 2位点，大小为42kb。这些配体和B7-1、B7-2、 IC0SL有21?27 %的氨基酸序列同源性和结构相似性：均包含一个免疫球蛋白样可变 区结构域、一个恒定区样结构域和一个跨模区和一个短的胞质尾巴，PD-L1的胞质尾巴比 PD-L2更保守。PD-Ll和F&D-L2表达于不同的细胞群体（Shimauchi，Kabashimaetal·， Augmented expression of programmed death-lin both neoplastic and non-neoplastic CD4+ T-cells in adult T-cell leukemia/lymphoma. Int J Cancer,)： )，这些细胞包括非造血组织以及各种肿瘤类型。H)-L1主要表达于T细胞、B细 胞、树突状细胞、巨噬细胞、间充质干细胞和骨髓来源的肥大细胞。PD-L1也表达于非骨髓来 源的细胞，如血管内皮细胞、上皮细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、肾小管上皮细胞、胰岛细胞，脑 部星状细胞和各类非淋巴系肿瘤如黑色素瘤、肝癌、胃癌、肾细胞癌，亦表达于免疫特赦部 位的细胞，如胎盘、眼睛。这表明ro-Ll在调节自身反应性T、B细胞和免疫耐受方面具有一 定广泛性，并且在外周组织T和B细胞应答起作用。但是ro-L2表达区域却极其有限，仅在 巨噬细胞和树突细胞中存在，被认为主要在免疫呈递中起作用。
[0005] ro-i和ro-Ll相互作用以调节控制τ细胞的活化在肿瘤和病毒感染中得到了大量 验证。PD-L1表达于多种肿瘤细胞表面，这些肿瘤细胞包括：肺癌，肝癌，卵巢癌，宫颈癌，皮 肤癌，膀胱癌，结肠癌，乳腺癌，神经胶质瘤，肾癌，胃癌，食道癌，口腔鳞状细胞癌，头颈癌。 而且在这些癌症周边也发现了大量表达ro-Ll的⑶8+T细胞。临床统计显示，PD-L1在肿 瘤细胞上的高表达水平与癌症患者不良预后相关（Okazaki和Honjo 2007,同上）。
[0006] 多种慢性和急性病毒也通过ro-i和ro-Li信号逃避人体免疫监测。例如：hiv感 染者体内ro-Ι的表达水平与T细胞的耗竭程度密切相关，且可作为AIDS病情进展的标志 之一 (Trabattoni,Saresella et al. ,B7-H1 is up-regulated in HIV infection and is a novel surrogate marker of disease progression. Blood,) :)〇 此现象也同样适用慢性乙肝患者（Evans, Riva et al.，Programmed deathlexpression during antiviral treatment of chronic hepatitis B ：Impact of hepatitis B e-antigen seroconversion·，Hepatology，2〇〇8,48 (3) :759-769)。动物实验显不，PD-1 基 因剔除小鼠比正常小鼠更好地控制病毒感染；而将HBV特异型T细胞转移到HBV转基因动 物中会引发肝炎。 发明概述
[0007] 本发明涉及能够结合程序性死亡因子1 (pd-1)的抗ro-i抗体及其功能性片段。
[0008] -方面，本发明的抗体或其功能性片段包含选自氨基酸序列SEQ ID N0 :1，2, 3, 7， 8,9,13,14,15或任何所述序列之变体的重链CDR，和/或选自氨基酸序列SEQ ID NO :4, 5， 6,10,11，12,16,17,18或任何所述序列之变体的轻链CDR。
[0009] 在一些优选的实施方案中，所述抗体或其功能性片段的重链⑶R1XDR2和⑶R3的 氨基酸序列选自以下各氨基酸序列或其变体的组中的一组:_
【权利要求】
1. 能够结合程序性死亡因子l(PD-l)的抗体或其功能性片段，其包含选自氨基酸序列 SEQ ID NO : 1，2, 3, 7,8,9,13,14,15或任何所述序列之变体的重链⑶R，和/或选自氨基酸 序列SEQ ID NO :4, 5,6,10,11，12,16,17,18或任何所述序列之变体的轻链CDR。
2. 权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其中所述重链⑶R的⑶R1XDR2和⑶R3的 氨基酸序列选自以下各氨基酸序列或其变体的组中的一组：
和/或所述轻链CDR的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列选自以下各氨基酸序列或其 变体的组中的一组：
3. 权利要求1或2所述的抗体或其功能性片段，其重链⑶R1、⑶R2和⑶R3以及轻链 ⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列选自以下各氨基酸序列或其变体的组中的一组：
4. 权利要求1至3中任一项所述的抗体或其功能性片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDN0:19,21，23或任何所述序列之变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQIDN0 :
20, 22, 24或任何所述序列之变体的轻链可变区。
5. 权利要求1至4中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述重链可变区为SEQ ID NO :19或其变体并且所述轻链可变区为SEQ ID NO :20或其变体，或者所述重链可变区 为SEQ ID NO :21或其变体并且所述轻链可变区为SEQ ID NO :22或其变体，或者所述重链 可变区为SEQ ID NO :23或其变体并且所述轻链可变区为SEQ ID NO :24或其变体。
6. 权利要求1至5中任一项所述的抗体或其功能性片段，其为嵌合抗体、人源化抗体或 全人抗体。
7. 权利要求1至6中任一项所述的抗体或其功能性片段，其包含选自氨基酸序列SEQ IDN0:33,35,36或任何所述序列之变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列SEQIDN0: 34, 37或任何所述序列之变体的轻链可变区。
8. 权利要求1至7中任一项所述的抗体或其功能性片段，其中所述重链可变区为SEQ ID NO :33或其变体并且所述轻链可变区为SEQ ID NO :34或其变体，或者所述重链可变区 为SEQ ID N0:35或其变体并且所述轻链可变区为SEQ ID N0:34或其变体，或者所述重链 可变区为SEQ ID NO :36或其变体并且所述轻链可变区为SEQ ID NO :34或其变体，或者所 述重链可变区为SEQ ID NO :35或其变体并且所述轻链可变区为SEQ ID NO :37或其变体。
9. 分离的核酸分子，其编码权利要求1至8中任一项所述的抗体或功能性片段。
10. 表达载体，其包含权利要求9所述的核酸分子。
11. 宿主细胞，其包含权利要求10所述的表达载体。
12. 产生抗ro-ι抗体或其功能性片段的方法，其包括：在允许产生所述抗体或其功能 性片段的条件下培养包含权利要求11所述的宿主细胞，以及回收这样产生的所述抗体或 其功能性片段。
13. 免疫缀合物，其包含与治疗剂偶联的权利要求1至8中任一项所述的抗体或其功能 性片段，优选地所述治疗剂为毒素、放射性同位素、药物或细胞毒剂。
14. 药物组合物，其包含权利要求1至8中任一项所述的抗体或其功能性片段，以及可 药用载体。
15. 用于通过消除、抑制或降低ro-ι活性来预防或治疗疾病或病症的方法，其包括向 有此需要的对象施用治疗有效量的权利要求1至8所述的抗体或其功能性片段，权利要求 9所述的核酸分子、权利要求10所述的表达载体、权利要求11所述的宿主细胞、权利要求 13所述的免疫缀合物或权利要求14所述的药物组合物，其中所述疾病或病症选自癌症、 感染性疾病或炎性疾病；所述癌症优选选自黑素瘤、肾癌、前列腺癌、乳癌、结肠癌、肺癌、 骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、 胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌、何杰金氏病、非何杰 金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织 肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病，其包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血 病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、儿童期实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、 膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统的赘生物、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤 血管发生、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细 胞淋巴瘤、环境诱发的癌症、其包括石棉所诱发的那些，和所述癌症的组合；所述感染性疾 病优选选自HIV、流行性感冒、疱疹、贾第虫病、疟疾、利什曼病、以下病毒引起的致病感染 ：
肝炎病毒（甲型、乙型和丙型）、疱疹病毒（例如^、批￥-1、祖￥-6、批￥-11和01^、埃巴二氏 病毒）、腺病毒、流感病毒、黄病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病 毒、腿腺炎病毒、轮状病毒、麻疫病毒、风疫病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革热病 毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和虫媒病毒性脑炎病毒， 以下细菌引起的致病感染：衣原体、立克次氏体、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑 膜炎球菌和conococci、克雷伯氏菌、变形菌、沙雷氏菌、假单胞菌、军团菌、白喉、沙门氏菌、 杆菌、霍乱、破伤风、肉毒中毒、炭疽、鼠疫、钩端螺旋体病和莱姆氏病细菌，以下真菌引起的 致病感染：假丝酵母（白色假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、光滑假丝酵母、热带假丝酵母等）、 新型隐球酵母、曲霉（烟曲霉、黑曲霉等）、毛霉目的属（毛霉属、犁头霉属、根霉属）、申克 氏孢子丝菌、皮炎芽酵母、巴西副球孢子菌、粗球孢菌和加膜组织胞浆菌，及以下寄生虫引 起的致病感染：痢疾内变形虫、结肠肠袋虫、福纳氏虫、棘变形虫、吸吮贾第虫、隐孢子虫、卡 氏肺囊虫、间日疟原虫、田鼠巴贝虫、布鲁斯锥虫、克鲁兹锥虫、多氏利什曼虫、鼠弓浆虫和 巴西日圆线虫；所述炎性疾病优选选自急性播散性脑脊髓炎、阿狄森病、强直性脊柱炎、抗 磷脂抗体综合征、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、关节炎、贝切特病、大疱性类天 疱疮、腹部疾病、恰加斯病、克罗恩病、皮肌炎、1型糖尿病、肺出血-肾炎综合征、移植物抗 宿主病、格雷夫斯病、格-巴二氏综合征、桥本病、超IgE综合征、特发性血小板减少性紫癜、 红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、天疱疮、恶性贫血、多肌炎、原发性胆汁性肝硬变、银 屑病、类风湿关节炎、斯耶格伦综合征、颞动脉炎、血管炎和韦格纳肉芽肿病。
【文档编号】A61P33/00GKSQ
【公开日】日
申请日期:日
优先权日:日
【发明者】陈博, 武海
申请人:上海君实生物医药科技有限公司, 苏州君盟生物医药科技有限公司PD-1抗体国内有卖吗？_百度知道
PD-1抗体国内有卖吗？
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内目前比较少部依靠进口价格昂贵
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出门在外也不愁PD-1抗体国内运用 生物315专访国内专家周启明--百度百家
PD-1抗体国内运用 生物315专访国内专家周启明
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随着PD-1抗体在临床上不断取得令人兴奋的佳绩，越来越多的癌症患者关注这一领域。那么，PD-1是否能让所有肿瘤患者获益？生物315抱着切实帮助咚友的初衷，坚持为咚友传播抗癌科普知识和国内外抗癌技术资讯。
【编者按】随着PD-1抗体在临床上不断取得令人兴奋的佳绩，越来越多的癌症患者关注这一领域，并期望通过采取免疫治疗获益。那么，PD-1是否能让所有肿瘤患者获益？国内PD-1运用如何？生物315抱着切实帮助咚友的初衷，坚持为咚友传播抗癌科普知识和国内外抗癌技术资讯。在此，生物315特邀请深圳市南山医院肿瘤科主任周启明博士为广大肿瘤患者科普PD-1抑制剂临床相关知识。
生物315专访：周启明博士
周启明博士
国内最早一批接触PD-1抑制剂抗肿瘤疗法的医生之一，自2010年起，开始关注并开展PD-1抑制剂的相关研究，是国内少有的具有PD-1临床研究相关经验的专家。目前主持广东省、深圳市肿瘤临床研究项目（筛选PD-1抗体的获益人群课题）。
对PD-1抗体治疗前筛选有咨询需求的患者可通过“咚咚肿瘤科APP”咨询周启明博士，深圳本地患者还可预约周启明博士面对面咨询。
PD-1抑制剂是一种革命性抗癌药
“PD-1抑制剂是一种革命性抗癌药，相信其是今后肿瘤治疗的方向。”周启明博士认为。恶性肿瘤是一个严重威胁人类生命健康的世界难题，尤其在中国，一旦病情确诊，80%是中晚期，而依靠传统的肿瘤治疗方法，多数恶性肿瘤不能得到治愈。而PD-1抑制剂疗法是当前备受瞩目的新一类抗癌免疫疗法，旨在利用人体自身的免疫系统抵御癌症，通过阻断PD-1/PD-L1信号通路使癌细胞死亡。
根据美国相关研究数据显示，PD-1抑制剂带来的临床抗癌效果是前所未有的。它可以控制50%的恶性黑色素瘤病人的癌症进展。周启明博士接触过的一名恶性黑色素瘤患者，使用三次时开始启效，目前使用了五次，病情迅速得到了控制。
据了解，对于顽固的非小细胞肺癌病人，多年来医学上束手无策，PD-1抗体也对20%的病人有临床控制效果。
虽然PD-1抑制剂抗癌作用广谱，但其并非合适所有肿瘤患者。周启明博士介绍，根据临床研究数据，这种疗法对肾癌、胃癌、淋巴瘤、膀胱癌、肠癌等癌症的临床疗效也较好，但对于自体免疫性疾病的患者，不适合采用。
而对于那些疗效显著的癌种，也并非所有分期的患者都适用。周启明博士指出，是否适用还需要看是否有治疗指征，目前一般是晚期患者使用。
那么，如何知道自己是否适用PD-1抗体？使用前需要做哪些检测？治疗时需要注意哪些问题？PD-1抗体有哪些副作用？如何处理？国内PD-1抗体运用情况如何？
根据周启明博士的医学经验介绍，生物315总结了以下相关信息，希望对咚友们有所帮助：
1.&目前来看，PD-1抗体对哪些癌症的疗效比较好？
恶性黑色素瘤效果是最好的，肾癌、肺癌、淋巴瘤、膀胱癌、肠癌等效果也较明显。目前FDA已经批准了黑色素瘤和非小细胞肺癌进入临床使用。
2.哪些患者不能进行PD-1抗体治疗？
有自体免疫性疾病的患者不适合使用，移植患者和间质性肺炎的也应谨慎使用。
3.&患者在使用PD-1抗体治疗之前需要做一些检测？
需要做病理和免疫组化检测，主要看淋巴细胞和配体表达。
4.&目前已经上市的PD-1抗体有两个-Keytruda和Opdivo，他们的效果有差别吗？患者该如何选择使用哪种进行治疗？
两者是不同公司的产品，Keytruda是默克的，Opdivo是贵施宝的，效果没什么差别。
5.&目前，有些患者想联合PD-1抗体和靶向药物治疗，您觉得合适吗？
由于两种疗法的作用机制不同，可考虑联合使用，具体如何联合使用，可根据有经验的医生评估来决定。
6.&使用PD-1之后常见的副作用是什么？可控吗？
常见的有皮疹、腹泻、肝炎和内分泌失调等，有些内分泌失调的副作用甚至有致命风险，因此，一定要找有经验的医生做治疗，及早发现并处理，防患于未然。
7. PD-1抗体一般要使用多少次之后评估效果？
一般是4次起效，用药约3个月之后评估效果。
8.PD-1抗体一旦使用多久可以停药？
一般到患者不能耐受为止，这里耐受主要指两方面，一是身体耐受不了；二是经济方面，由于这种药物价格昂贵，患者家庭需要有一定的承受能力。
9. PD-1抗体国内运用情况如何？
PD-1抗体在国内尚未批准上市，但在今年7月，Nivolumab已经获得了在中国开展相关三期临床研究的批准，有消息指出年底可能会有opdivo针对肺癌的临床试验。国内的企业百济神州、恒瑞、君实也有自己的pd1抗体在研发，百济神州的已经在澳大利亚进行了临床试验，也有消息说恒瑞的可能很快在国内临床。
另外了解到的是，国内有两个指定临床试验基地，中山大学附属肿瘤医院和中国医学科学院肿瘤医院。
我们会继续更新信息，欢迎关注我们。
温馨提示：下载生物315旗下产品“咚咚肿瘤科APP”，有专家，有干货，有权威，有态度！
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