呼吸内科开展荧光支气管镜检查
&&&&&& 近期，呼吸内科引进了国际先进的电子荧光支气管镜（奥林巴斯BF-F260），开展荧光支气管镜检查，已成功为多位肺癌患者进行了检查，提高了早期中央型肺癌的确诊率。
&&&&&&&自发性荧光支气管镜检查是一种新型的检查技术，主要是利用人体细胞自发性荧光和电脑图像分析技术开发的一种新型纤维支气管镜。检查时，在荧光光源照射下，患者黏膜下的早期肿瘤组织会发射出不同于正常组织的荧光，在荧光下正常组织表现为绿色，而不典型增生、原位癌及浸润癌则表现为棕色或红棕色，从而能清楚辨别可疑部位，进行活检或刷检，显著提高了气管黏膜早期癌变的诊断率和定位诊断，是对传统内镜检查技术的突破。此项检查在发现癌前病变和原位癌方面有独特的优势，已在欧美、日本等广泛应用。自发性荧光支气管镜技术的引进，将大大提高我院对早期肺癌及癌前病变的诊断阳性率，具有巨大的社会效益与经济效益。
&&&&&&& 自发性荧光支气管镜术前准备同普通气管镜检查，即先用普通气管镜检查气管-支气管，发现异常后切换至自发性荧光系统，总体检查时间约5-15分钟。检查过程不需特殊用药，所用激光不会产生灼伤，无严重并发症。对异常病变的探查直径最小可至1mm，其阴性预测值高于0.85，对中度异型增生以上的癌前病变确诊几率较高。每个患者诊断率可提高37%-75%，每个活检区诊断率可提高25%-67%。
&常规气管镜图像
荧光气管镜图像
&&&&&&&适应证：如果痰细胞学有中至重度不典型增生或6个月内胸片无病灶但怀疑有癌变者；高度怀疑肺癌的患者，确定病变部位，指导活检；早期（I、II期）肺癌患者术后，怀疑复发者；监测气管内肿瘤的治疗效果，指导腔内肿瘤治疗的定位；指导手术切除范围。
&&&&&& 部分病人不适合LIFE检查，如3个月内接受过光动力治疗或预防性的化学治疗、6个月内接受过放疗或细胞毒性化疗、妊娠、急性支气管炎、未控制的高血压、出血性疾病、已知或怀疑有肺炎、不稳定性心绞痛、对局部麻醉药过敏等患者。（呼吸内科&&赵京明）
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奥林巴斯bx51m(lympusbx51m)荧光显微镜的使用技巧心得
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【公告】共聚焦显微镜经验交流贴（第一帖有OLympus FV1000离线软件使用方法），使用过的战友，请进此贴获取积分！---长期有效&[精华]
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这个帖子发布于4年零323天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
作为形态学技术，目前，激光共聚焦显微镜的应用越来越多，但是问题也越来越多。此贴最主要的目的是聚集有共聚焦使用经验的战友，方便大家的讨论，其次才是共聚焦显微镜的统计。人多力量大，有关共聚焦的问题也好知道向哪些战友求助，交流和讨论！注意：只是
单纯拷贝贴、重复贴、不按格式发帖者，不奖励积分，不投票鼓励。格式如下：编号：（1）显微镜型号：（2）实验室名称：（3）实验室地点：（4）相关资料：（5）你的经验感受：多少写两句（6）其他加分说明：（1）一定要加编号，并完成1.2.3项的，加1分；重复的仪器不加分！（2）如果能提供经验感受的，即第5点，则至少再追加1分；每个战友得分最多5分。（3）相关资料的内容：在我看来就是战友觉得有用的，而且与共聚焦有关的，比如使用方法，技巧等。 （4）哈哈，想想就兴奋，有那么多的战友用过共聚焦显微镜，如果有问题需要讨论的话，岂不是很热闹，问题解决会更快了。呵呵，还是那句话，我为人人，人人为我，人多力量大，三个臭皮匠赛过诸葛亮！
（5）本贴的最主要的目的是聚集有共聚焦使用经验的战友，方便大家的讨论，其次才是共聚焦显微镜的统计。
(6)请不要设置积分限制。谢谢 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------1.荧光的基础知识2. 关于FV1000的使用技巧。2.1 FV1000简版（离线版）软件下载和安装，以及中文使用说明和典型应用举例说明书下载。2.2 快速实现各种拍照参数跟上次一模一样2.3 荧光背景校正2.4 对比度和强度的调整 2.5 添加标尺和其他标记。2.6 截图（截取图片的某一个规则或者不规则的部分）2.7 导出tiff格式的图片2.8 时间序列图片导出为AVI动画2.9 colocalization
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编号：1（1）显微镜型号：Olympus FV1000（2）实验室名称：河南省高等学校组织再生重点开放实验室（3）实验室地点：河南。新乡（4）相关资料：FV1000中文说明书.pdf，FV1000系统-激光扫描共聚焦显微镜原理和应用（5）你的经验感受：调节荧光照片到自己满意的程度需要花费的时间太长，一个上午照不了几张片子，所以建议大家不要一次做太多片子。（6）其他：单激光器100元/小时，2个及以上150元/小时，校外分别为200元/小时和300元/小时
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占位,准备抽空把陈老师的有关荧光基础知识和自己对于olympus FV1000 共聚焦显微镜的一些使用经验做个阶段性总结.也欢迎大家讨论1.陈老师的荧光基础知识 荧光：,9~2#[|lq
荧光现象是物质在光的照射下所产生的发光现象。 05o 1
首先荧光是一种光致发光现象，荧光物质必须是在光的照射下才能发光。否则就是其他的发光现象而不是荧光。例如夜光物质，夜光表，虽然也需要先用光照射，但离开光照射后它还能继续发光，就不是荧光。这叫磷光。另外一个例子是作western blot时用化学发光，也是发光，但不是荧光。4xD`Z_U
其次，荧光物质发出的荧光与照射光的色彩不同。准确地说，是荧光物质发光的波长与照射光的波长是不同的。典型的荧光物质是在紫外线照射下能发出黄绿色的荧光。例如钱上的的荧光防伪标记，用紫外线照射后能发黄绿色的光。 xr1,D5
所以在使用荧光显微镜的照片，观察绿色荧光样品时，你会看到物镜下照射到样品的光是蓝色的光。观察红色荧光样品时，照射样品的却是绿色的光。但在目镜里却能分别看到绿色与红色的荧光图像。在荧光显微镜里，使用蓝色光照射样品后，样品发出的绿色荧光与照射样品的蓝色光混在一起，经过一个滤光片，把蓝色的照射光过滤掉，这样在目镜上就只看到绿色的荧光了。样品发出的荧光，虽然有一种颜色，但它并不是单色光，而是有一定波长分布范围的混合光。具体测量出每个波长下的相对光强，作一条光强-波长的关系曲线，这就是荧光光谱了。或者称之为发射光谱。它反映了这个物质发射的荧光的色彩成分。一般情况下，荧光物质的荧光光谱的波长范围并不会太大，所以它会形成某种明显的颜色。例如绿色或红色或黄绿色。通常这个波长范围是几十个纳米。\Pg~j\;F]
在荧光的光谱分布中，当然会有一个波长对应着最强的荧光强度，这个波长就是我们平时所说的荧光的波长，又叫最大发射光波长，通常荧光染料的参数中的荧光波长就是这个波长。荧光物质所发出的光实际上是这个波长上下几十纳米范围之内的。照射样品的光叫激发光。激发光的波长必须比荧光波长短。这是能量守恒的因素。短波长的光能量高，它只能激发出能量低一点的光。C(&!?&#-.
所以理论上只要比荧光波长更短的光就能激发出荧光。发红色荧光的物质，可以用紫外光，蓝光，绿光来激发它发出红色荧光。不过，这其中也是有某个波长的光是效率最高的。能激发出最强的荧光。这个就是最大激发光波长。这也是荧光染料参数中的激发光波长。荧光染料发出荧光，其色彩与激发光基本上无关。就是说，如果染料是发红色荧光的，你用蓝色光，紫外光，绿色光都能激发出红色荧光，也只能激发出红色荧光。专业点的说法，就是荧光的光谱与激发光无关。荧光光谱是样品发出的荧光在各个波长下的强度分布。其峰值就是最大发射光波长，或者叫最大荧光波长。X'OpR 
各种染料的荧光光谱基本上都是这个形状，一个简单的峰，有个最大波长，宽度大致在几十个纳米。所以荧光虽然不是纯的单色光，但也基本上是一种颜色。相比荧光光谱，激发光谱就稍微复杂点，一般不会是一个简单的峰，有时候会有几个峰，宽度通常能从紫外到荧光的波长。这个意义就是通常情况下，用什么光来激发是有很大宽容度的。只要波长比荧光波长短，就能激发出荧光来。这就是现在的显微镜，其滤光片系统与以前不同了，以前是激发滤光片与发射滤光片可以分别选择，可以用蓝光激发红光，但现在使用滤光片组，通用的是绿光激发红光，虽然能适应大多数染料，但偶尔遇到一个需要蓝光激发红光的，就没招了。除非另花几千块买个专用滤块。激发光谱与发射光谱基本上是分开不重迭的，所以通常会把两个光谱画在一个图片上，就成了这个样子的。两条曲线分别对应着激发光谱与发射光谱。当使用两种染料时，一般是分别拍摄红色与绿色荧光。先使用红色滤块拍摄红色荧光，此时，实际上绿色荧光也会有一点的，滤光片不可能把绿色荧光完全滤掉。拍摄绿色荧光时也一样会有一点红色荧光。 ]cS(2hP7
当两个染料的荧光强度差不多的时候，漏过来的一点点其他荧光对图像没啥影响。但是，如果两种染料的荧光强度相差太大时，就有问题了。|nnFjGC`~
例如红色荧光强度为1000，绿色荧光强度为1，滤光片过滤效率为1%。当使用绿色滤光片观察时，绿色荧光强度为1，红色的强度为，漏过来的红光比绿光还要强，这时候，镜下就能看到红色的荧光，这就是串色现象。由此可见，解决串色的办法，就是在制样时把强荧光的染料浓度降一点，让两种色彩亮度平衡。当两种染料荧光色彩很接近的时候，例如都是绿色荧光，但波长稍有重迭而不是完全重迭，理论上是可以通过拍摄两个波长下的荧光，然后通过计算把两种荧光给分开。现在的光谱型共聚焦显微镜有这个能力。要分别先作两个单染色的样品，分别扫描其光谱，计算出其校正的系数，然后对双染色的样品扫描两个波长下的图片，最后根据系数来对图片进行一些计算，分别得到两个分开的图片。这个功能在实际应用中未必有效，一般来说，两个样的荧光要足够强而且强度要平衡，才能作出有效的计算。如果荧光弱，计算误差会相当大，就得不到好的效果了。 详见：
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我所知道的一些olympus FV1000 共聚焦显微镜的一些使用经验 共定位计算背景扣除图片裁切 ZDC 至少间隔10s才会起作用
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楼主，继续把这个话题聊下去啊，我等着学习呢好的，我努力吧，从今天开始，两日一贴，以截图和视频的形式！一图胜千言！一影抵万语！
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第一帖：FV1000简版软件下载和安装，以及中文使用说明和典型应用举例说明书下载。。fv1000软件安装，是简单版（或者叫做离线版）的，后续的交流主要是简单版的应用，而且使用的图片全部都是Fv1000的oib或者oif这两种格式。（唯一的全功能版是在共聚焦显微镜的电脑上的，要使用一些比如colocalization的功能都需要完整版，简单版，只能用于加标尺（要求是Fv1000的oib或者oif这两种格式），背景校正，裁切，加文字等简单功能）软件下载地址：链接： 密码：38mt安装过程：解压后，选择autorun.exe，在弹出的对话框中选择第一个进行安装，安装过程中需要重启电脑。文件比较大，需要耐心。另外：（1）Fv1000中文说明书：（2）FV1000典型操作举例见附件
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第二贴：如何把拍照参数调整的跟上次一模一样。存图就是存参数，一定要保存为oib或者oif的格式，强烈建议用oib格式，简洁不容易出错。 当FV1000进行拍照的时候，会出现前一个人把各种拍照参数调整的跟自己需要的完全不一样。可是自己又不会调，怎么办。这个时候，如果你保存有一张你上一次拍过的oib或者oif格式的照片的话，那么，这个问题就非常easy的解决了，让你迅速设置好你以前的拍照桉树。见图：第一步：打开拍照的软件：第二步：打开一张你以前拍过的图（oib或者oif格式的）；第三步：有2种方法可以实现参数的重新设置（跟以前拍照的参数一模一样）：
方法1.见图tools---explore---然后在打开的窗口里找到你需要的图，右击，最底下的一个命令：load acquisition paramater，然后等待程序完成即可。方法2：见图.打开以前保存的图片，点击左上角的&&&&按钮，在弹出的菜单中选择&send scanning parameters of this image to the acquisition panel&然后就静静等待奇迹出现就行了。ps：中间可能会出现一个对话框，不用管它，单击OK就行。
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第三贴：背景校正 olympus FV1000提供了三种背景校正方式：第一种：是选定一个ROI（region of interest）以后，以ROI的荧光平均值作为背景，然后软件会自动减去背景。第二种：是选择一张没有阳性表达的部位作为背景图片，然后进行扣除；第三种：是--我也忘记了。详见下图--点击图片可以查看大图，上面字体清晰的。
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第四贴：对比度和强度的调整 点击看大图
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第5帖 添加标尺和其他标记等 点击看大图工具介绍各种工具的使用
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第6帖 截图（从图片中截取一个规则或者不规则的区域）点击看大图其实很简单：方法：根据上一帖的方法选好ROI以后，点击图片上的crop image按钮即可。
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第7帖 导出tiff格式的图片，用于发表文章图片格式很多，发表论文推荐用Tiff格式：TIFF(Tagged Image File Format)是广泛地应用于对图像质量要求较高的图像的存储与转换，与JEPG不同，TIFF文件可以编辑然后重新存储而不会有压缩损失。第一步：需要导出的oib图像上右键后弹出菜单，选择：export；第二步：在弹出的export界面上选择：（1）图片命名和图片格式，推荐tiff；（2）选择导出的图片是否带有标尺等ROI（建议选择ALL ROI）；（3）选择需要导出的通道（4）选择导出方式：RGB color；如果需要几个通道颜色叠加的图片，则需要“and merge channel （Amount method）”前面打钩。需要注意的是，重叠图像是所有通道的叠加，如果你有3个或3个以上通道需要两两叠加，则需要多次导出。点击看大图
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第8帖 时间序列图像导出为AVI动画 点击看大图 第一步，打开oib格式的原图第二步，加上需要的信息 第三步，export 导出为AVI即可即可。
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杨柳吹风 版主，能教授一下colocalization的功能吗？谢谢！第9帖 colocalization这个需要全功能软件才能操作。点击看大图
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杨万万 版主，求教：放大倍数20倍，原始像素，怎么计算添加标尺的长度？非常感谢！[图片]一般来讲如果是共聚焦显微镜的话，由于里面有一个可以放大的功能，所以即便知道是20倍镜头知道图片大小，也是无法计算标尺的。但是，如果你手头有你所使用的共聚焦显微镜的专有格式的原始图片的话，比如奥林巴斯的oib格式，你可以在奥林巴斯的软件上打开这个原始图片，直接添加标尺后重新导出图片就行了，具体操作见第一贴。如果你没有这种专有图片，那么最简单也最准确的办法就是到到你拍照的地方，按照你原来拍照的参数重新拍一张，一定要加上标尺，不需要拍你原来的图片你的目的是要标尺，所以随便拍一张就行了。至于你说的计算出标尺，这个我还不会，论坛里有很多相关讨论。你再看看吧祝你好运
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fengliangwwe 祝你好运版主你好，请问倒置的共聚焦显微镜拍组织的荧光切片怎么样？跟正置的共聚焦相比呢？比如Zeiss的LSM700倒置共聚焦，这台显微镜能拍组织的荧光切片吗？如果是载玻片上的组织进行的免疫荧光染色结果的话，应该是没有问题的。正置和倒置的区别：通俗的讲，最大的区别在于倒置的载物台上方空间大,允许放一些大的物件，比如培养板观察细胞等。其他区别：正置显微镜的物镜转换盘朝向是向下的，载物台在物镜下方。当观察物体时，把被观察物放于载物台，物镜从上方靠近载玻片进行观察，工作距离比较短，观察切片等适合用正置显微镜。倒置显微镜 的物镜是向上的，载物台在物镜上方。当观察活体细胞时最适合用这种显微镜，因为正置生物显微镜的工作距离很短，观察培养皿里面的活体细胞根本没办法观察。用倒置显微镜就不一样了，只需把培养皿放于载物台上就能进行观察，因为倒置显微镜的光路是饭的，聚光镜在上面，其工作距离长，可以轻松观察到培养皿里面的活体细胞。
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zmt137328 版主，网盘密码错误。能发给我一份吗？邮箱谢谢 我刚刚试过，密码没有问题。
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lgf198 楼主请问Z轴叠加图像怎么导出成一张图像 我只知道在FV1000的主机上可以完成，就是3D重建。但是离线软件没有这个功能。
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冷月游云 版主 您好 我需要共聚焦分析 装了您在/bbs/topic/210 ...这个全功能软件是厂家直接安装在显微镜旁的电脑上的，没有其他地方可以下载，只能在拍摄现场分析。
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意思就是不能这个软件进行图片分析了？我之前在论坛上看到说用image J分析，/bbs/topic/，但是我分析出的不对，结果pearson相关系数是1，其他的结果也不对，不知道是哪里出了问题，所以请问我还有其他的解决方法吗？IPP我的电脑装不上。试过很多次了。多谢您的回答。就olympus而言，确实是这样的。没有这个软件，你无法分析。Ipp你的电脑装不上，我也没有办法。Image J ，你还是好好看看教程吧，我也不会用这个软件。其他我就不知道了。只能祝你好运吧。
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gh 你好 请教一个问题：如果我只要求100倍即10X10镜下观察细胞，用普通6孔板养的细胞是否可以直接镜 ...还真没在意。不过恐怕不行的可能性大。可以试一下。
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汐岸 版主你好，我想用你说的软件把这两张图片融合一下，让细胞形态可以更清晰，应该怎么弄呢？照片中细胞形态不 ...上图，在外地，下周一才能上网！
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汐岸 图片在附件里。。。。。谢谢 细胞形态的那张白光照片没有拍好，啥也看不见，可能是你说的原因，也可能是白光太暗了，总之看不清，所以无法merge。merge的教程园子里好多，可以自己搜索看看。还有就是下载图片附件居然2个叮当，以后记得取消啊。
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汐岸 不好意思，新手。请问您提供的OLympus FV1000离线软件有merge功能吗？我找了半天教程 ...有！仔细看看第一贴关于该软件的说明，需要oib格式的共聚焦原图才能使用！
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谁人知1989
老师您好，为什么我添加的标尺的单位是Pixel啊？最下面的70μm是type上去的吗？必须是显微镜当时拍出来的原格式（.oib 或者.oif），才能直接加成微米。如果是.jepg,， .tiff啥的都不行
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冰凝果84 你好，选中的区域怎么才能知道长宽呢？提前画好标尺
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冰凝果84 那样的话，每张都得画标尺，长对应一个标尺，宽对应一个标尺？是的。其他方法我暂时想不到
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wanliheng edited on
那样的话，每张都得画标尺，长对应一个标尺，宽对应一个标尺？ 长或宽，一个标尺就行了，不需要长画一个标尺，宽也画一个。每一图像只需要一个标尺即可。
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火星萌萌 我想问一下如果用共聚焦直接导出的TIF格式的图片，可以用以上哪些方式修改？拍照参数改不了？背景校正也 ...可以试一下，印象中只能改改对比度和亮度。
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殷立彬 你好，我在导出图片的时候，ALL ROIs 这个选项是不能选的，请问您知道是什么情况吗？是软件的问题吗？我换了几台电脑都是这样，能把您的软件给我一份吗，？您分享的安装链接，下载后显示文件有错误，几次都是这样。把图截的更完整一些吧。我也没遇到这种情况。是否是你没有选择AOI呢，如果可能，把oib图像也截一个看看！
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诺诺猪林 楼主，您好！我们实验室的是Leica TCS SP5的显微镜，我拍的图片质量很差，不知道可以通过什么样的渠道可以学习呢？请问您有关于这个型号显微镜的资料吗？谢谢！拍照技术可以弥补很少甚少部分的图片质量，但最重要的还是自己的片子要拍好，就像给人照相，人长的好，稍微一拍就漂亮。要学习拍照技术，可以联系厂家，关键是自己要有机会练手，但是一般的共聚焦都有专人操作的。祝你好运吧加油！
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目镜下看到的荧光不是来自激光器，而是来自共聚焦的另一套荧光光源（类似于普通荧光显微镜的荧光光源，只是寿命更长而已）。电脑上显示的荧光图像的光源才是激光器。所以首先看看对应的激光器是不是打开了。如果打开了还不行。那么就看参数设置了最好的办法是调用上次拍照的参数，如果是奥林巴斯的可以参考首贴的链接。再不行，我就不知道了。请工程师吧祝好运
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