western blot的抗体怎么选择?关于一抗二抗以及怎么稀释
有单抗尽量用单抗 如果要买磷酸化的就买磷酸化的抗体 一般一比一千稀释二抗根据一抗来选择呗 一般一比两三千稀释
为您推荐：
其他类似问题
扫描下载二维码& 【讨论帖】western blot 中抗体的重复应用问题
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
【讨论帖】western blot 中抗体的重复应用问题
信誉分 102
可用分 4116
阅读权限 255
注册 状态 离线
【讨论帖】western blot 中抗体的重复应用问题
我因为做western blot 总是没结果，就严格按照cell signa的说明书进行操作，将多抗用5%的BSA稀释成10ml后4度冰箱孵育过夜，但是依然无结果。我将稀释后的 抗体准备重复使用，但是原来未稀释前在-20度时抗体不结冰，现在稀释后则结冰，这样用时反复冻融会不会影响结果。还是抗体在稀释后应放4度保存？
另外我想问一下这样的抗体一般可用几次。
如果是在室温下孵育的抗体可不可以重复用，上次我用此抗体，连原来做出来的都未出结果。
信誉分 100
可用分 3626
阅读权限 255
注册 状态 离线
抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。
信誉分 101
可用分 6575
阅读权限 255
注册 状态 离线
抗体可重复使用3次一般没有问题，可以-20储存，且夏天最好放-20储存，这样可以保存时间长一点。
信誉分 104
可用分 4391
阅读权限 255
注册 状态 离线
本人建议：
稀释的抗体可以在4度下放1个月左右，不会影响抗体的效果，前提是加入0.2％的NaN3防腐，绝对可行，本人曾经用一个磷酸化抗体也是CS公司的p-erk用了2个月，到后来是牛奶都很淡了，照样信号很强的
信誉分 100
可用分 4861
阅读权限 255
注册 状态 离线
本人曾经用一个磷酸化抗体也是CS公司的p-erk用了2个月，到后来是牛奶都很淡了，照样信号很强的
==============================================================================================================
我个人认为是不是即使牛奶很淡了，目的蛋白含量仍然很高，所以不影响结果呢？牛奶里的beta-Casein, alpha-Casein 等都是高磷酸化的蛋白，而且在牛奶里含量都很高。
信誉分 100
可用分 4096
阅读权限 255
注册 状态 离线
你好：我很理解你的心情，因为我也出现过这种情况，我这几个月光做western blot 了，我在这里谈谈经验,希望对你有帮助，你近期的一个帖子我也回答了，你注意查看一下：
1。做western blot 时转膜是一个分水岭，用丽春红染色后（5‘）看条带有无或是否清晰，你所说的没结果到底是怎么个没结果。如果膜上没有条带或条带不清晰，那肯定是蛋白制样和转膜的问题。如果条带清晰而没有结果，就应该依次排除一抗，二抗，和ECL的问题，你抽几微升二抗点在一个新的小NC膜上，等二抗干了以后，连同要杂交的NC膜同时曝光显影，如果小膜上有黑点，而你要杂的蛋白没有条带，那肯定是一抗有问题，如果小膜上没有黑点，那二抗和ECL两者有一个有问题或都有问题。你也可以设计其它方法检测你的实验试剂和步骤是否没有错误。
2。封闭液最好用脱脂奶粉配，一抗用5％BSA加0。02％的叠氮钠在4度至少可以保存一个月，禁止反复冻融，二抗也用脱脂奶粉配，4度可以保存一个星期。
3。具体实验方法参见分子克隆第二版。
信誉分 100
可用分 4233
阅读权限 255
注册 状态 离线
看到有这么多的人回应，真是太感动了，最近在放假期间，实验室的人特别少，我每天做实验感觉都与世隔绝了。我现在是用立春红染色，可见不清晰的条带，但是暴光后，底片上什么都没有。另外我想问的是用BSA稀释的抗体加入叠氮钠后是否会影响抗原与抗体的反应，且问一下，10ml的抗体可用几次？并且问一下Western的结果如何分析，难道一定要做内参照吗？
信誉分 100
可用分 4861
阅读权限 255
注册 状态 离线
帮您查了一下，到处也没有找到叠氮钠防腐的机理。
叠氮钠是“弱氧化剂”，因为两个N 之间的三键，导致该化合物有夺电子的能力。而电子是一些细菌病毒复制再生所必须的。查了一下PUBMED，只有叠氮钠影响酶功能的文章，没有说到影响抗原抗体结合。
信誉分 103
可用分 5056
阅读权限 255
注册 状态 离线
如果担心叠氮钠对后面的影响，可以考虑过滤除菌。优点是不用担心叠氮钠的影响，缺点是保存的过程中也要注意无菌。
另外，如果样品中目的蛋白含量很低，转移后用丽春红并不一定能染出条带，特别是真核表达的产物，一般表达量不高，蛋白量少。我有几次真核表达产物转印后，丽春红染未见条带，接着做下去，结果仍然出来了。
信誉分 101
可用分 7048
阅读权限 255
注册 状态 离线
抗体我用western blot C液稀释后，使用大概有5～6次，每次用完回收放于4度保存。最近再用只是显色浅，还能用。关注今日：18 | 主题：205156
微信扫一扫
扫一扫，下载丁香园 App
即送15丁当
【求助】westeren blot抗体的选择
页码直达：
问题已解决悬赏丁当:10
各位前辈好，我目前想检测一个蛋白，病人的相应基因在近C端有错义点突变，目前不知道蛋白是如何改变。商品化抗体没有流式抗体。有western blot抗体，有针对n－terminal的，有c－terminal的，也有polyclonal的全长的。请教的问题是，这种情况做western blot有意义吗？如果做western blot，该如何选择抗体呢？谢谢：）
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
抗体的选择是根据实验目的来的。既然是C端有突变那么就用N末端的吧，能检测到所有的目的蛋白（C末端和全长的都无法检测所有），但是无法区分突变和正常。首选CST的WB抗体。供参考。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
不是要看蛋白的表达变化吗？做WB当然有意义了，可以看一下gene突变后对于下游蛋白表达到底有什么影响。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
wanliheng 抗体的选择是根据实验目的来的。既然是C端有突变那么就用N末端的吧，能检测到所有的目的蛋白（C末端和全长的都无法检测所有），但是无法区分突变和正常。首选CST的WB抗体。供参考。非常感谢wanliheng前辈的答疑。我现在就是想区分突变和正常，但是我不知道点突变会不会被wb检测到。 另外，这种情况有木有其他方法验证基因点突变后引起功能缺失呢？谢谢
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
betty_bxm edited on
qq 不是要看蛋白的表达变化吗？做WB当然有意义了，可以看一下gene突变后对于下游蛋白表达到底有什么影响。非常感谢qq前辈的答疑。但是我的问题就来了，我该如何选择抗体呢？而我有个担心是点突变导致的氨基酸改变会不会在wb检测出来？有木有其他的方法验证这个蛋白的功能在patient是缺失了呢？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
谢谢各位的回复，你们的帮助对我非常有用，祝一切顺利！对于我的问题，经过多方咨询，我现在总结一下。c端错义点突变不一定能够影响蛋白表达。如果蛋白表达受到影响，为了区分突变和野生型蛋白，最好选择突变位点为抗原的抗体，然而往往是不会那么巧的。当然不排除突变位点以外为immunogen的抗体也能区别开来的可能，看运气老！另，可以结合蛋白功能，做功能试验。希望与我有共同疑惑的同道们可以获得一些思路。如有其他的idea敬请赐教?
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
qq 不是要看蛋白的表达变化吗？做WB当然有意义了，可以看一下gene突变后对于下游蛋白表达到底有什么影响。 谢谢您的回复，虽然没有正面回答到我的问题，但给予我很大鼓励。非常感谢！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园小木虫 --- 500万硕博科研人员喜爱的学术科研平台
&&查看话题
如何选择western-blot一抗抗体？
如何选择western-blot一抗抗体？
请教一下达人。。
我要分析的是水稻叶片的几丁质酶。。如何来选择一抗和二抗呢？
研究生必备与500万研究生在线互动！
扫描下载送金币
浏览器进程
登录小木虫
打开微信扫一扫
随时随地聊科研Western blot 最新攻略
& Western blot 最新攻略
导言&&&&&&&一提起Western
blot，大家会不禁联想到Southern
blot和Northern
blot。其实它们的名字也是个有趣的故事。1975年，Edwin
Southern教授发明了DNA杂交检测技术，故命名为Southern
blot。之后，James
Alwine、David
Kemp和George
Stark三位教授又发明了RNA杂交检测技术，因与Southern
blot相似，故命名为Northern。George
Stark这位牛人教授在两年后又开发出类似的蛋白质检测方法。1981年，Neal
Burnette将其命名为Western blot。为什么当时没叫Eastern blot呢？这无从考证，不过科学家们还真是挺有创意的。
&&&&&&&30年来，
Western blot技术已成为蛋白质研究中最常用的工具。它的标准流程如下：蛋白质首先通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再通过电泳转移到固相支持物上，固相支持物包括硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜。首先将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的非特异性吸附，这样固定的蛋白质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作用。最后通过放射、生色或化学发光的方法进行定位。
&&&&&&Western从技术上理解并不困难，但问题在于耗时长，步骤多，重复性不佳。好在近几年，尤其是这五年来，市场上涌现出不少新产品、好东西，让Western blot的流程快了不少，在这个讲求效率的年代，速度快、效率高是多么重要啊。同时，生物通也陆续发布了不少Western方面的攻略和心得体会，能帮助大家解决一些常见的问题。在此，我们将这些好物和攻略整理成专题，推荐给大家。
&&&&&&SDS-PAGE可不比琼脂糖凝胶电泳，准备的试剂多，耗时也长，一般来说，从配胶到电泳大概要花2个小时。到了夏天还老是头疼，怎么还没凝呢？如今，使用预制胶，一撕开包装即可电泳，耗时大约在35分钟-1个小时，无论如何，也节约了一半时间。重复性当然比手工配制的要好。有时，生怕蛋白没分开，有时，又怕小蛋白跑出去了，这时，蛋白Marker可就是必备良品啊。
谁可小看“蛋白标准”
蛋白Marker是要是用来指示蛋白条带所对应的分子量大小，只有标准量精确无误了，实验结果才有说服力，除此之外，蛋白标准还有表示转移成功或者蛋白在凝胶上的电泳程度等等的作用，所以选择正确的蛋白Marker也是Wb实验成功的必要条件之一。
预制胶――轻松应对蛋白电泳
现在，SDS-PAGE已经成为实验室的最常规实验了。不过可别小看了这个实验，它比核酸电泳可复杂多了，需要准备的试剂多，耗时也长，而且每一次跑出来结果可能都不一样。有时只是为了补一张漂亮的电泳图片，却花了好几天时间，横竖还是不满意。这时，你就可以考虑一下预制胶了。本文对市场上最热销的几种预制胶进行了分析和对比，帮您选择最适合的产品。
转膜和封闭
&&&&&&转膜可谓Western blot中的关键一步。转膜效率的高低，直接影响了Western的结果。在过去，转膜大约需要1小时；如今，新型转印仪的出现，让转膜时间一缩再缩。3分钟，出去喝杯水的时间，已经转好了。不服不行吧，科学技术就是生产力啊。
3款快速转印系统大比拼
近几年，一些新产品的出现，让Western
blot的效率提高了不少，快速转印系统正是其中之一。2007年，Invitrogen率先推出了iBlot快速蛋白转印仪，将蛋白转印时间缩短至7分钟，让人耳目一新。之后，赛默飞世尔科技也推出了一款半干式的快速转印仪。今天，Bio-Rad在全球同步上市Trans-Blot Turbo全能型蛋白转印系统，更是将转印时间缩短至3分钟。
转膜经验谈
如何做这个“海绵―几层滤纸―胶―膜―几层滤纸―海绵”的“三文治夹心”，在分子克隆上已经有详细的介绍。这里我们就来谈谈一些需要注意的细节。
全自动的Western Blot――恭喜你，解放啦!
&&&&&&对于传统的Western blot而言，结果的重复性一直是个挑战，因为缺乏标准化的操作，且多个操作步骤引入了实验可变性。如今，全自动Western blot分析的出现，让结果的重复性更好。整体的定量也大大改善了，因为省去了转印步骤，从而避免了蛋白转移的不一致。当然，省时省力那就不必说了，不过，就是不省钱。
一台名叫Simon的仪器
美国proteinsimple公司推出了一种Simple Western 分析，彻底改变了整个Western blot。此分析在一台名为Simon的仪器上开展，Simon将所有实验步骤自动化，包括蛋白上样和分离、免疫印迹、洗涤、检测以及数据的定量分析，让研究人员从繁重的劳动中解放出来，同时避免了可能影响实验重复性的人为因素。
一个简单的流程
一个定量的分析结果
抗体孵育和检测
显色篇：八仙过海，各“显”神通
各大厂家都在不断开发更方便更灵敏的新产品，“idea是生产力”嘛，因此生物通这里介绍一些能把我们从日常操作中解脱出来，获得“升级版”效果WB产品。
化学发光仪ChemiDoc XRS应用心得
我们实验室从05年开始采用Bio-Rad的ChemiDocXRS进行化学发光的检测，目前已经形成一套较为成熟的技术路线，取得大批的实验数据。本文将就Western
Blotting的关键步骤及使用ChemiDocXRS的一些心得体会与大家一起分享。
如何优化抗原和抗体的浓度
每一个Western
blot都涉及到抗原和抗体的相互作用，因此，抗体浓度并不是一成不变的，优化很重要。一抗和二抗浓度取决于每个抗体的特异性和抗原的特异性，以及样品中存在的抗原量。
如何挽救Western阴性结果
blot是最常用的实验方法，但意义并不寻常，其结果的有无往往决定着下一步实验的走向。当您辛辛苦苦地花费近两天时间提蛋白、电泳、转印、杂交之后，显色时却得到了“白板”一块，伤心沮丧之时，千万不要轻言放弃！
Western的三大常见问题
Blot已经成为实验室中检测蛋白质的常规手段。不过想要得到一张条带清晰、没有杂带、背景干净的图片，还是具有一定挑战性的。我们常常会遇到没有条带、背景过高等问题，没关系，。
Western Blot为什么必须要用内参？
严谨的Western
Blot实验设计中要求有良好的参照体系，这对实验结果分析是非常有用。内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western
Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。
版权所有 生物通
Copyright& 2000-, All Rights
联系信箱：