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[求助] 请问Western的内参都有哪些，分子量都是多少，谢谢！
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请问Western的内参都有哪些，分子量都是多少，谢谢
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Actin一直被认为是等量表达，用于western也比较多，近2-3年发现β-Tublin（球管蛋白），而不是Actin，才是在不同的组织细胞中普遍等量表达的蛋白，因此逐渐取代Actin，而被广泛应用于Western bloting，作为equal loading control（等量蛋白上样内参）。分子量大约50KD。
国内我知道有一家华特生公司有买β-Tublin的，我实验室就在用这个，效果要比Actin好，100ul 298RMB
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过去做WB，最常用的内参是actin，一种具有收缩能力的微丝蛋白，虽然有研究表明actin作为管家蛋白并非想象的那么优秀，在某些因素下表达也有可能不稳定，但在许多杂志的文章中，actin还是被认可的，也就是说还是可以用的，actin在WB的条带位于43KD左右。这个我们实验室用的是SANTA CRUZ公司的产品。另一种内参是beta-tublin，球管蛋白，楼上介绍的比较详细，我们实验室用的也是华特生公司（辽宁）的单克隆抗体（鼠），在WB的条带位于~51KD。还有一种比较好的内参是GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，在我们实验室这个蛋白作为内参的表达也很稳定，我们用的是康成生物（KANGCHEN）的单抗（鼠），在WB的条带位于36KD左右。很明显，这三种内参在WB的条带分别在30+、40+和50+，其实都可以被认可，就看楼主的目的条带在多少KD，别太近就行了（除非你用远红外成像做双标）
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能否告知华特生公司订货的方式，我在网上查不到这家公司啊，谢谢了！
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有人知道吗，谢谢！
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我们实验室是在沈阳联星公司购买的，联星长春公司和哈尔滨公司也有卖的。我有沈阳联星公司的电话024-866279
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已有文献报道在缺血情况下GAPDH和actin作为内参是不稳定的，所以看来选择何种内参要以你的试验来定了，一定要排除外界刺激对内参的影响才行，目前看来beta-tublin较为稳定，不知哪位知道国外那家公司的tublin抗体较好泥？
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marker一下，学习了，谢谢
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>> WB总蛋白内参定量
V3 Western Blot 流程与 总蛋白定量归一化技术张姣 时代联想生物科技有限公司Times-LegendTimes-Legend 传统Western Blot流程Times-Legend Bio-Rad V3 Western Blot流程<
br />Times-Legend V3免染Western Blot流程动画演示4 Times-Legend V3免染Western Blot流程Stain-free image of post-transfer gel Stain-free image of pre-transfer gel Total protein normalization蛋白分离15-20分钟TGX胶电泳凝胶蛋白可视化1分钟紫外激活成像，确认蛋白 的质量和分离情况蛋白转印3-7分钟TBT转印Stain-free image of the blot Chemi image of target protein确认转印1分钟印迹膜成像 gel and blot蛋白定量软件自动总蛋白归一化定量5 Times-Legend Western Blot 蛋白归一化定量目标蛋白 内参ABCABC光密度读值 看上去光密度读值10050200100 100 200归一化因子 1:1:2实际上100501006 Times-Legend 使用看家蛋白定量并不可靠7 Times-Legend 看家蛋白的线性范围窄看家蛋白通常是高丰度蛋白，其信号通常会接近动态线性范围 的上限：当我们要检测低丰度蛋白，从而上样量很大的时候， actin、tubulin、GAPDH抗体产生的信号已经不能反映上样量 的差异了。Coomassie total protein measurementGAPDHJ Proteome Res. 2011 Mar 4;10(3):1416-9.GAPDH线性范围仅在5ug以下8 Times-Legend 信号过饱和是WB定量可靠性的挑战 信号过饱和Dittmer A and Dittmer J Beta-actin is not a reliable loading control in western blot analysis Electrophoresis (2006). 27, .稀释抗体浓度、减少孵育时间和曝 光时间都无助于actin信号的最终过 曝。Suzuki O, Koura M, Noguchi Y, UchioYamada K, Matsuda J Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative western blots. 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It is easy and fast. The stain-free is fantastic! It is convenient and requires little extra work. I will continue to use stain-free approaches as an alternative to housekeeping proteins.”我非常喜欢V3的操作流程，它简单快速。免染胶非常了 不起。我将继续用免染的方法来代替看家蛋白定量。Fur-Chi Chen, Tennessee State University, US31 Times-Legend 用户声音“We have been routinely using the Stain Free gels and ChemiDoc MP for imaging gels as well as normalizing western blots. We primarily used SyproOrange in the past, but the stain free gels have essentially replaced that need, as well as saving an hour of post-staining.”“我们已经将免染胶和ChemiDoc MP作为western blot定量的常规方法。我们之前曾采用SyproOrange，但是现在免染技术已经完全 取代了SyproOrange。”Ryan B. Jensen Ph.D. Assistant Professor of Therapeutic Radiology32 Times-Legend 使用V3及免染总蛋白发表的文献DNA Repair 2013 Apr 1;12(4):306-1133 Times-Legend 耶鲁医学院Ryan B. Jensen的采访34 Times-Legend 使用V3及免染总蛋白发表的文献35 Times-Legend 使用V3及免染总蛋白发表的文献PLoS ONE ):e8178436 Times-Legend 使用V3及免染总蛋白发表的文献37 Times-Legend 使用V3及免染总蛋白发表的文献Mol Cell Proteomics 2014 Nov 20;13(11):297585. Epub 2014 Jul 20.38 Times-Legend 使用V3及免染总蛋白发表的文献Sumoylation of Rap1 mediates the recruitment of TFIID to promote transcription of ribosomal protein genes Published in Advance March 23, 2015 （IF13）39 Times-Legend 使用V3及免染总蛋白发表的文献Nat Med. ):270-5. doi: 10.1038/nm.3765. Epub 2015 Feb 2.40 Times-Legend SummaryA fundamental impact on the western blot data quality and increase people’s confidence in western blottingTimes-Legend Times-Legend
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标题: [转帖]毕业在即，总结western blot经验
摘要: [[转帖]毕业在即，总结western blot经验] 做了五个月的Western Blot ，有一点点小心得，给新手点经验．蛋白提取：１． 总蛋白提取（胞膜，胞浆，胞核）： 组织匀浆后,15000g, 4度, 20分钟后,取上清 Buffer:NP40 750ul, 脱氧胆酸钠0 5克, SDS 0 1克, 加1*PBS 至100ml
再加入 关键词:[条带 浓缩胶 二抗 内参 转膜 显影液 一抗 分离胶]……
做了五个月的Western Blot ，有一点点小心得，给新手点经验．
蛋白提取：
１． 总蛋白提取（胞膜，胞浆，胞核）：
组织匀浆后,15000g, 4度, 20分钟后,取上清.
Buffer:NP40 750ul, 脱氧胆酸钠0.5克, SDS 0.1克, 加1*PBS 至100ml. 再加入PMSF(7.4mg/ml) 0.1ml. (现用现加)
7.4mg/ml PMSP异丙醇溶液: 取A mg PMSF 加 A/7.4 ml 异丙醇.工厂-20度储存
２．组织膜蛋白提取：所在操作冰上进行
（1）取组织，用PBS冲洗干净组织上的血液. 加入 10ml Buffer A , 用剪刀尽可能剪碎组织,于冰上充分匀浆。每次30秒,重复3-5次.
（2）离心机 1000rpm，4℃ 离心 10min 后，所得上清液转入超速离心管。(去掉大块组织及结缔组织)
（3）100000g，4℃ 离心 1hr, 弃去上清.(此为胞浆蛋白,若只提取胞浆蛋白,可用10000rpm, 4度, 30分钟离心，取上清即可 )。沉淀用适量的 Buffer B重悬，4度过夜后，分装至 EP管，Eppendorf 台式离心机 10000rpm，4℃ 离心 30min。
（4）收集所得上清液即为膜组份。
Buffer A： 0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。
Buffer B 20mM HEPES（PH 7.5），10% 甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM，PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。
所得蛋白分装EP管（每管约50ul），取一管测蛋白浓度，其它放入-70度深冻冰箱保存。
如果要定量的话，最好能立即根据浓度，加入上样缓冲，煮沸，4度保存。反复冻融蛋白会降解，浓度不准。
考马斯亮兰Ｇ２５０测蛋白浓度：
考马斯亮兰Ｇ２５０配方：G250 0.4克, 95%乙醇100ml, 85% 磷酸 200ml, 加水至2000ml,过滤后使用。
BSA标准液：0.5mg/ml BSA, 双蒸水配制。
配制标准液(浓度分别为0，10，20，30，40，50ug/ul)：
1 2 3 4 53 6
G250 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml
BSA ------ 20ul 40ul 60ul 80ul 100ul
ddH2O 100ul 80ul 60ul 40ul 20ul -----
待测蛋白配液：每管3ml G250，2ul样品，98ul ddH2O。（若加入样品后，液体没有变蓝色，则可再加2ul样品，ddH2O减为96 ul，标准液浓度可适当扩大。）
紫外分光光度计，595nm，用1号管调零，制出标准曲线, 标准方程及R值（R值应大于0.99, 否则操作误差较大）,测量待测蛋白OD值，算出蛋白浓度。（若加入2ul样品，则浓度值需除2，方为真正浓度； 若加4ul样品，则除4）
聚丙烯酰胺电泳：
1．自来水，洗涤剂清洗玻璃板，用ddH2O冲洗干净，立放于盒子内，60度烤箱烘干备用。
凝胶储备液（30% Acr/Bise）：
丙烯酰胺29克，双体甲叉双丙烯酰胺1克，加水至100ml。（有说要棕色瓶保存，3个月换新的，30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉）
10%APS：0.1克过硫酸铵，加 ddH2O至1 ml.(4度保存,一周内使用)，本人都是配新鲜的用。
10%SDS: 1克SDS,10 ml ddH2O. (不溶时,可加热50度左右助溶.)
TEMED: 原液即可.
0.5M Tris-HCl (PH6.8)；
1.5M Tris-HCl (PH8.8): 9.0855克Tris, 加入ddH2O溶解后,用HCL调PH至8.8,加ddH2O到50ML
配胶的浓度和方法书上都有，不详细说了！
本人做的是70KD 和17KD 的分子量，分别配了10%和12%的分离胶，4%的浓缩胶。摇动溶液充分混合（不要过于剧烈以免引入过多地氧气）灌入2/3的分离胶后（估计距梳子底1CM）应立即用ddH2O封胶。等到能看清水和胶的分界线，则可配浓缩胶。用面巾纸吸干水后，注入浓缩胶，至顶。插入梳子，不要有气泡。
蓝色字体是从别人贴子上看到的
这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。
分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）
PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在《分子克隆》上有详细的论述。容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜——最好用小指管配AP（写日期）保存在-20度，超过2周的AP扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP都别用。 胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS），封胶后切记，勿动。如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。
等浓缩胶凝的时间，就可以配蛋白了。按照想要的浓度加入LOADING BUFFER配制。本人按每孔总体积20ul, 终浓度1* RSB，含50ug蛋白混合样品，不足的体积用1* PBS补足。短暂离心后，沸水中煮5分钟，放室温，用时再短暂离心。回复
例如. 50ug/20ul，做2.5孔, 即50ul，125ug
1 2 3 4
蛋白浓度 10．33 ug/ ul 13．91 ug/ ul 14．87 ug/ ul 19．03 ug/ ul
所需体积 12.1 ul 9 ul 8.4 ul 6.6 ul
5*RSB 10 ul 10 ul 10 ul 10 ul
1* PBS 27.9 ul 31 ul 31.6 ul 33.4 ul
5*RSB: 1.89克 Tris-HCL(PH 6.8), 5克 SDS, 0.125克溴酚蓝, 25ML 甘油.(很粘稠)
Beta-巯基乙醇用时现加,按25%比例.
10* PBS: Nacl 4.25克,Na2HPO4. 12H2O 15.4g, NaH2PO4 2H2O 1.4g, 调PH到7.2-7.4,加ddH2O到500ml
约30分钟左右, 取下梳子,将胶板放入电泳槽内,加入1*电泳缓冲液, 冲洗加样孔. 微量进样器逐个加样,空泳道加入1* RSB. 两胶板之间的电泳液要满. 接好正负极, 开始电泳, 可先小电压,约50V ,大约跑过浓缩胶后再改为100V. 观察MARKER的情况, 适时终止电泳.
建议说目的带要跑到分离胶的2/3处比较好,但本人一直都在上1/3处,结果也还可以.
预染MARKER很重要,开始选了一个国产的,总是跑不好,后来换成NEB的,效果很好,而且也不贵,范围也比较广,把我要的7.,42.17全都包括在内.
如果浓缩胶跑的好的话, 几个孔的蛋白会跑成一条直线.
注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液
未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护.梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡,可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生,梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用枕头插入加样孔中纠正但要避免枕头刺入胶内.
10* 电泳缓冲液: Tris7.58克, 甘氨酸36克, SDS 2.5克, ddH2O定容到250ML.
不好溶,可用搅拌器.
可重复使用,每次加一些新的进去.但本人每次都是配新的,也不麻烦.
跑完电泳后,取出胶,可以一块做考马思亮蓝R250染色约30分钟, 脱色液脱色, 看看蛋白条带跑的如何,上样量如何.
另一块可用做转膜. 放入转移缓冲液中摇30分钟左右（有次着急只晃了10分钟，结果也挺好的）。开始用的PVDF膜, 0.45um, 用国产的MARKER后,总是染的不清楚, 而且无论时间长短, 最后一块滤纸都会被染色. 后来换了NEB后,PVDF也不容易上色(可能和PVDF的质量有关,我买的虽然也是MILLIPORE,但好像比较便宜20CM*10CM才50块钱). 丽春红染色也很少能看清条带,后来发现,染色后用甲醇洗,比较容易看出来,但是很难洗掉红色，不知道有没有影响。后来换成NC膜，0.22um ，效果挺好的，MARKER易染上，丽春红也易着色，还一洗就掉。能比较清楚的了解转膜效果。
不同转膜仪和电源转膜的条件不同，我用的是BIO-RAD 的半干转（电压不过25V的那款），电源是BIO-RAD的PC200，70KD的我转50分钟，20V，17KD的转20V，30分钟左右，条件不是很稳定，有时半路打开盖子看看MARKER转的情况，但膜和胶的位置一定不能窜。也有人说用恒流，说1.2-2MA/CM2我看了一下，我的胶大约都是5*3左右大的，20V一般电流会是60-30MA之间，要是这样算的话,最高就30MA, 我不太清楚.
如果用PVDF膜，先用甲醇浸泡一段时间，我一般是5分钟，但也有人说不过30秒，不清楚。换了NC膜就直接放入转移缓冲液中的，晃30分钟左右。
滤纸开始是买的那种专用滤纸，上面三张，下面三张，后来有人说这种滤纸是做湿转用的，应当用那种比较厚的，上下各一张，我也不知道，后来就换成普通滤纸了，上下大约各15张左右，有时着急还反复用过，效果也还可以，估计问题不大。
因为这款半干转膜仪说明书上说不会短路，所以一般滤纸》膜》胶. 他们之间一定不要有气泡.。膜上要做好标记，识别正反面和上下,切个小角是常用的方法, 有MARKER也方便记.
转膜后的胶可用考染看看转膜情况.
考马斯亮蓝R250: R250 0.25克, 甲醇50ML, 冰乙酸40ML, 加水到100ML.
脱色液: 乙酸 50ML, 甲醇225ML(可用乙醇), ddH2O500ML
10*丽春红(20ML): 2%丽春红(0.4克), 30%三氯乙酸(6克), 30%磺基水杨酸(6克). 用时加入9 倍的ddH2O
10*转膜缓冲液:
70KD分子量: Tris29克, 甘氨酸14.5克, SDS 1.85克, 加水到500ML.
用时取10ML, 加20ML 甲醇, 加70ML 双蒸水
17KD分子量: Tris29克, 甘氨酸14.5克, 加水到500ML.
用时取10ML, 加50ML 甲醇, 加40ML 双蒸水
用5%的封闭液(伊利的高钙脱脂), 室温,摇床1小时.
5%封闭液: 1克脱脂奶粉, 20ML洗膜液.
洗膜液: 10*PBS 50ML, 450ML ddH2O, 0.5ML TWEEN-20
抗体孵育：
将膜上的封闭液洗去(轻轻晃晃就可)
一抗:用杂交液配置.浓度可根据点蛋白实验,及ECL要求来定.
4度,过夜.最好有那种4度摇床.我一般早上到实验室后,再摇床上再摇3个小时左右.
洗膜液洗3次,每次10分钟.
二抗: 用杂交液配置.室温,摇床,1小时.
洗膜液洗3次,每次10分钟.PBS洗5分钟.
如果一抗没有混浊,放置时间不长,可以重复使用,本人一般连作二天时,才会重复用,如果因为一抗的原因而不出结果,太不值了.
杂交液: BSA0.5克, 洗膜液50ML.4度保存,如有混浊,重配.
点蛋白试验:
在正式作WESTERN之前可先做这个,如果没有结果可能提蛋白中不含目的蛋白,也可能一抗与目的蛋白结合不好,或一,二抗结合不好.(之前拿一滴二抗和ECL试一下是否发光,以排除二抗的问题).若有结果,可能选择一个比较合适的一,二抗浓度.
取小块膜,放到24孔板中(PVDF先有甲醇泡,烘干),滴上不同浓度的蛋白(先加5UL,37度烘干,再加5UL,烘干),加封闭液,室温,摇床一小时, 洗去. 加不同浓度一抗,2-3小时, 室温,摇床.洗膜液洗3次,每次10分钟.不同浓度二抗一小时, 室温,摇床. 洗膜液洗3次,每次10分钟.PBS洗5分钟.显色
将膜上多余的水吸干,与胶相邻的一面向上,按ECL说明书配置发光液.点在膜上.
不同厂家ECL要求不一样,本人用的ECL二种液体1:1混合后,0.125/CM2, 放置2分钟,吸干(可以用微量加样器抽回来,可连续用下一张膜),放在保鲜膜上,包好,压片.
若肉眼可见发光,可压10-20秒; 若看不到,可压30分钟.(再长的时间没试过,一般30分钟不出,就重新再回一次ECL,重做一次,若再不出,就认为没有了.)
转完膜后的膜如果不能及时做,可放在洗膜液中,4度保存,最多放过2天,时间长了就不知道了.
谢谢分享，但今天网络好象不好，不能投票，明天再投，再请请教一个问题，一抗是用杂交液配置的吗？我看到有地方写着是用封闭液配的。
Buffer:NP40 750ul, 脱氧胆酸钠0.5克, SDS 0.1克, 加1*PBS 至100ml. 再加入PMSF(7.4mg/ml) 0.1ml. (现用现加)
7.4mg/ml PMSP异丙醇溶液: 取A mg PMSF 加 A/7.4 ml 异丙醇.工厂-20度储存
这里德两个PMSF溶液没搞懂
我想弱弱的问个问题，为什么我再做WB最后一步ECL时，在压片前明明看到PVDF膜上有明显的荧光条带，但是在压片后，显影却什么都看不见呢，压片时间我试过很多从30S-10MIN，但是就是没有效果，这是怎么回事呢
我想弱弱的问个问题，为什么我再做WB最后一步ECL时，在压片前明明看到PVDF膜上有明显的荧光条带，但是在压片后，显影却什么都看不见呢，压片时间我试过很多从30S-10MIN，但是就是没有效果，这是怎么回事呢 ... WB实验步步关键，最后显影也不例外，并且往往是由于显影不好，出问题而导致功亏一篑，前功尽弃，这一点我以前也尝过苦头，呵呵。
基于你的这种情况，我觉得可能是显影液和定影液有问题的可能性比较大。质量完好的显影液和定影液看上去颜色是不会发黑的，色泽很好的那种。所以建议：
1.看看显影液和定影液颜色有没有变淡，或者变黑，如果有，说明显影液和定影液变质了。
2.建议用一张空胶片曝光，在放进显影液前在胶片的一角折起，然后进行显影和定影，最后观察胶片折过的地方有没有出现黑的折痕，如果没有出现折痕，也说明显影液和定影液变质了。
根据上述情况，建议最好重新配制显影液和定影液，并且过滤，用棕色瓶分装，并用黑色的塑料袋包扎，并于4度冰箱保存。一般来说，显影液和定影液用了3-4周后，就要重新更换，这样实验效果就很理想。
以上只是个人的一些见解，希望对你的实验有帮助。
请问你每次做WB的时候，荧光的mark可以曝光出来吗？二抗一般你用多久的啊？我每次做的时候就是mark显示不出来，很郁闷。还有就是我曝光10分钟不出来，我就认为没有了，需要半个小时吗
二次杂交的时候一抗二抗去除液是洗膜多久的啊 ，我洗5min,下次曝光的时候就会出现杂条带。
原来发光液要吸干啊，我一直都是自己摸索加上看帖子，没有师兄师姐带过。我只是吸取多余的，有时候怕条带不够亮，舍不得吸掉呢，今天我就试试。
学习了，谢谢。再请教一下，用提取组织的细胞外基质中的蛋白用什么方法好？裂解液有什么特殊的吗？
请教高手楼主一个问题，我最近用的一个抗体，蛋白质的分子量是15kDa,做了两次都发现不在15kDa的范围内出现，而是在140kDa，很是迷惑，对应Marker的15kDa处非常干净，希望高手多多指教，真是愁死我了，如能赐教，感激不尽
请教一个问题，请问在测蛋白浓度时所测量的是裂解液和蛋白的混合物的总浓度吗?不考虑裂解液的影响吗？那另外您觉得哪种方法定量最准确呢
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我有一个疑问：
加入ECL试剂之后，我一般就是直接把PVDF膜上的试剂吸干，然后将膜放入一个叫FuJiFilm的检测系统中，然后关上系统箱子的门，在电脑屏幕上点击scan按钮，显示器上就出现条带了。你所说的压片是什么意思？
Buffer:NP40 750ul, 脱氧胆酸钠0.5克, SDS 0.1克, 加1*PBS 至100ml. 再加入PMSF(7.4mg/ml) 0.1ml. (现用现加)
7.4mg/ml PMSP异丙醇溶液: 取A mg PMSF 加 A/7.4 ml 异丙醇.工厂-20度储存
这里德两个PMSF溶液没搞懂
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PMSF很难溶于水，用异丙醇来溶解
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我有一个疑问：
加入ECL试剂之后，我一般就是直接把PVDF膜上的试剂吸干，然后将膜放入一个叫FuJiFilm的检测系统中，然后关上系统箱子的门，在电脑屏幕上点击scan按钮，显示器上就出现条带了。你所说的压片是什么意思？
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是说最后的曝光在什么设备里，你用的是一种，还有一种就是用一个暗匣，把胶片放到里面去，盖上暗匣的盖子就可以曝光了，二者的作用都是一样的吧，不知说的对不对。
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我有一个疑问：
加入ECL试剂之后，我一般就是直接把PVDF膜上的试剂吸干，然后将膜放入一个叫FuJiFilm的检测系统中，然后关上系统箱子的门，在电脑屏幕上点击scan按钮，显示器上就出现条带了。你所说的压片是什么意思？
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你们这是荧光可以自动曝光的。我们做压片的，是没有这设备，只能黑屋子里摸索了。
我正在学习western，请问各位高手，在做组织蛋白western时，用的梳子是多大的啊？宽的和窄的对跑出来的条带弥散有差别吗？还有上样量的选择，若目的条带表达弱，该怎么权衡弥散和上样量的关系啊？？我用的是1mm的10个道宽梳子，上样20ul，蛋白浓度在20mg/ml,出来的内参条带弥散差不多成一条明亮的线，而目的条带还算轮廓清楚就是稍有点弱。我师兄用的是12个道的窄梳子，做细胞可以，但是组织就弥散的更厉害。请各位高手帮帮忙，谢谢啊！！
请问在western中不同细胞的内参beta tublin是否有表达差异？
我做的是大肠肿瘤中不同细胞的蛋白表达，蛋白都反复重提了好多次，今天用新蛋白做的western还是内参不齐，我用的是beta tublin，且发现总是有一个特定的细胞株内参表达特高，是不是在不同细胞中内参的表达不一样呢？蛋白的提取应该是没有问题的，我的标准曲线也是很直的啊
谢谢楼主的分享，我在做一个蛋白，但问题是内参b-actin都做不出来，请问你是用的谁家的一抗和二抗呢？稀释比例是多少？
楼主你太好了，我正好现在做17KD的目的蛋白，从你那里可以借鉴下了，很是感谢！不过我提取蛋白后不测浓度，直接加统一的上样量！这样很有影响吧，我的内参条带不是一样呀呵呵还有上样缓冲溶液里面的巯基乙醇必须现用现加吗？
1.楼主做的17KD的蛋白，为什么转移液不加SDS，如果加了会有什么后果？
2.我做的也是17KD，用0.45的膜，转不上后来才知道要用0.22的膜，可是做了几次，转移的效果都不好，MARKER很难转到膜上？用0.45的膜转30分钟膜已经很漂亮了，0.22的膜转40分钟膜上依稀可见MARKER的条带，胶上的条带却很清楚？
我很着急，做了2个月了，只有内参能够曝出来。木的条带从来没出来过。
恳请楼主多多指教！！
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