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免疫组化全攻略：新手与老手必读
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在上世纪30年代，免疫组织化学（Immunohistochemistry，简称IHC）的原理就已经为人所知，但直到1942年，第一个IHC研究成果才正式发表。这也被誉为免疫荧光技术的里程碑。哈佛大学医学院的Albert Coons在《免疫学杂志》上发表文章，利用FITC标记的抗体来鉴定感染组织中的肺炎球菌抗原。自那以后，组织固定方法、检测标记和显微镜都在不断改进，让免疫组化成为诊断和研究中的一个必备工具。
在病理科，利用特异的肿瘤标志物，医生通过IHC诊断肿瘤是良性还是恶性，确定肿瘤的分期和分级，并确定细胞类型和转移的来源，以便找到原发肿瘤的位置。同样，IHC也能用于药物开发，通过检测疾病靶点的上调或下调来判断药物疗效。
免疫组化指的是根据抗体与抗原特异结合的原理来检测组织切片中的抗原（如蛋白）。immuno的词根来自操作中所使用的抗体，而histo意味着组织。另一种类似的技术是免疫细胞化学（Immunocytochemistry，简称ICC）。这两个词大家经常混着用，看着好像差不多，但实际上还是有点区别。这里顺便说说。
IHCvs. ICC
对于IHC，组织是来自患者或动物，经过冷冻或石蜡包埋。将这些组织制成约4μm厚的切片，封片后再处理。通过这种方法，研究人员可观察细胞组分的定位，同时维持周围组织的原先结构。
对于ICC，大部分细胞外基质及其他基质组分被去除，只剩下整个细胞来染色。ICC的来源可以是细胞悬液，来自患者或动物（如血涂片、拭子等），或在实验室中进行的组织培养细胞系。
除了生物学来源，IHC和ICC在样品处理的程度上也有所不同。ICC需要透化，要么通过固定过程，要么是单独的透化步骤，这样抗体才能与细胞内的靶点相结合。而IHC可能不要单独的透化步骤，这取决于切片的厚度和固定方法。包埋在石蜡中的IHC切片必须进一步处理，才能进行抗体染色。一旦处理好样品，IHC和ICC的染色操作就几乎没什么差异了。当然，就染色而言，根据所使用的抗体来优化还是少不了的。
设计一个成功的IHC/ICC实验
从技术上讲，IHC的原理很简单。首先固定样品，以保留细胞完整性，之后与封闭液共同孵育，避免抗体的非特异结合。随后将样品先后与一抗和二抗孵育，并通过显微镜分析观察信号。
然而，这并不意味着实验很好做。最大的挑战在于如何确定最佳的实验条件，让每个抗原都产生强烈而特异的信号。如果是个高丰度蛋白，那么挺好办，需要的固定时间短，封闭时间短，可以用荧光标记一抗直接检测。但如果要检测冰冻切片中的磷酸化蛋白呢？那可能需要抗原修复，外加放大检测。
IHC/ICC实验设计和优化的变量，如下表。
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看完这些，是不是觉得有些头晕呢，这么多地方需要优化。其实也没那么恐怖，接下来会发布一些优化指南，包括如何制备样品，如何选择固定剂，如何优化抗体检测等，千万别错过。
如何制备样品
　　对于每一项IHC/ICC研究，组织和细胞样本的制备都不可掉以轻心。为了方便孵育，整个组织必须被切成超薄（5-10 μm）的切片，或切成小块用于整体免疫组化。对于ICC实验，在开始染色步骤之前，细胞必须附着在显微镜载玻片或盖玻片上。样本制备与固定方法密切相关，而固定方法又会受到检测技术（荧光vs 显色）的影响。
对于每一项IHC/ICC研究，组织和细胞样本的制备都不可掉以轻心。为了方便孵育，整个组织必须被切成超薄（5-10μm）的切片，或切成小块用于整体免疫组化（wholemount IHC）。对于ICC实验，在开始染色步骤之前，细胞必须附着在显微镜载玻片或盖玻片上。样本制备也与固定方法密切相关，而固定方法又会受到检测技术（荧光 vs 显色）的影响。
在大部分情况下，某个实验变量将决定样本制备的最合适方法。例如，浸润固定在甲醛中的组织必须石蜡包埋，并利用切片机切片。或者，为了检测磷酸化依赖的表位，组织可能需要快速冷冻，因此在醇类固定之后就需要一个低温箱来进行样本切片。
石蜡包埋的组织
石蜡包埋为长期保存组织样本提供了最佳选择。组织在用石蜡包埋之前必须固定。固定可通过灌注或解剖后立即浸润来实现，一般需要4-24小时。不建议固定组织24小时以上，因为固定过度可能导致抗原的遮蔽。如有必要，组织在固定后可转移至酒精中，直至包埋过程。
因为石蜡与水是不混溶的，所以组织在加入熔化的固体石蜡前必须脱水。脱水是通过浸润在浓度递增的酒精中而实现的。这种方法逐步改变疏水性，让细胞伤害最小化。脱水之后，组织与二甲苯共同孵育，以去除任何残留的酒精。石蜡一般加热到60?C进行包埋，随后过夜硬化。之后利用切片机用锋利的刀片将组织切成超薄的切片。切片在显微镜载玻片上干燥，并长时间室温储存。组织切片在开始IHC/ICC步骤之前必须再水化。石蜡是组织包埋的最便宜也是最常用的物质。不过，组织也可包埋在塑料中，凝固得更硬，并切成更薄的组织切片（1.5μmvs 5μm）。
冰冻组织样本的好处之一是省去了石蜡包埋组织最初所需的固定步骤。在检测翻译后修饰如磷酸化时，快速冷冻特别有益。冰冻组织的制备可将组织浸润在液氮或异戊烷中，或埋在干冰里。对于冰冻组织，在冷冻和切片之后进行一个短时间的固定。冰冻组织切片最常用醇类固定，这避免了修复甲醛交联所遮蔽的表位的需要。冰冻组织在低温箱中切片，切片在-80?C可储存多达1年。
冰冻组织切片的处理时间比石蜡包埋切片要短一些。不过，冷冻对于组织的长期保存是不够的，且细胞内冰晶的形成可能会负面影响亚细胞的细节。此外，冰冻切片通常比石蜡切片厚。这可能导致较低的显微镜分辨率以及差的组织形态学图像。因为冰冻切片通常保留酶的活性，所以封闭可能影响IHC检测的内源酶的活性也是特别重要的。
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在开展ICC研究时，首先必须将细胞附着在固体支持物上，如显微镜载玻片或盖玻片。这对于贴壁细胞很简单，它们可直接放置在6孔或24孔板底部的高级无菌盖玻片上生长。将盖玻片预包被一层带电荷的聚合物（如多聚赖氨酸）和/或细胞外基质蛋白（如层粘连蛋白、纤维粘连蛋白或胶原），可增强细胞附着。染色过程的所有步骤可在微孔板内的盖玻片上开展，向每个孔中加入适当的溶液并移走溶液。悬浮细胞可通过Cytospin(R)离心或与包被多聚赖氨酸的玻片孵育10分钟而附着在玻片上。
固定剂的选择
　　理想的固定剂当然是：最好地保持细胞和组织的形态结构，并最大限度地保存抗原的免疫活性。然而，迄今为止尚无一种标准固定液能用于各种不同的抗原固定。经同一固定液固定后，不同组织可能呈现截然不同的染色结果。因此，不同的抗原和样本必须反复试验，选择最佳的固定剂。
IHC/ICC实验中使用的所有样本必须经过固定，以维持组织形态，并保留目的分子的抗原性。固定改变了组织的化学组成，因此往往需要在维持组织结构和保留表位之间进行折衷。细胞或组织的不完全固定（固定不足）可能造成组织内目的蛋白的快速水解，并降低了特异的免疫反应性。然而，过度的固定（固定过度）可能导致表位的遮蔽或强的非特异背景染色，这可能会掩盖特异的标记。
理想的固定剂当然是：最好地保持细胞和组织的形态结构，并最大限度地保存抗原的免疫活性。然而，迄今为止尚无一种标准固定液能用于各种不同的抗原固定。经同一固定液固定后，不同组织可能呈现截然不同的染色结果。因此，不同的抗原和样本必须反复试验，选择最佳的固定剂。
甲醛是保留组织和细胞内蛋白靶点的最常用固定剂。甲醛介导的组织固定被认为依赖于蛋白-蛋白以及包含亚甲基桥（-CH2-）的蛋白-核酸交联的形成。甲醛能化学连接NH2（氨基）和CONH（肽段）基团，NH2和NH，或NH2和NH2基团。
甲醛是大多数IHC/ICC应用的良好选择，但并不是一种通用的固定剂。甲醛的固定过度会修饰氨基酸（属于表位中的一部分），并阻断抗体与之结合。然而，在大部分情况下，利用抗原修复技术可暴露表位，以还原抗体结合。研究还表明甲醛会诱导磷酸化依赖表位的细胞内转位，从细胞膜转移至细胞质。在这种情况下，冰预冷的无水甲醇或无水乙醇是适当的替代。
注意：甲醛溶液应当分装并冻存，或储存在4-8?C不超过一个月。
最常用于细胞和组织固定的醇类是甲醇和乙醇。甲醇和乙醇的分子结构与水相似。因此，它们与水竞争蛋白氢键，取代组织中的水分子。这通过降低蛋白的介电常数，使蛋白在等电点沉淀，并由于构象的改变，阻断抗体-表位的结合。尽管醇类通过打断氢键而影响蛋白的三级结构，但它们似乎能稳定蛋白的二级结构。
不过，通常认为醇类不像甲醛固定剂那样保留组织形态。醇类不像甲醛那样渗透，主要用于固定冰冻组织切片和细胞。因此，醇类固定更适合膜表面抗原。在醇类固定之后不推荐进行抗原修复，因为它通常认为太过剧烈，有可能损害组织切片或细胞的完整性。
丙酮是一种强的脱水剂，能引起组织蛋白的不可逆沉淀。它常用于未固定、快速冷冻组织的切片。
组织的固定
在研究小动物如小鼠、大鼠和豚鼠的完整组织时，整个动物的灌注固定是保留抗原的最佳方法。它包括用固定液来取代动物的全身血液。然而，整个动物的灌注还不足以固定目的组织。在这些情况下，解剖的组织可浸润在固定剂中。例如，4%甲醛是组织灌注和浸润固定的常用溶液。
为了在浸润固定过程中加强固定剂的渗透，建议组织厚度不超过10 mm。对于完整的固定，固定剂的体积应当是组织体积的50-100倍。固定通常在室温下进行4-24小时。由于固定不足或固定过度可能降低或破坏组织的免疫反应性，因此优化固定条件很重要。
培养细胞的固定
与组织样本不同，培养细胞的固定时间更短，且固定液的浓度更低。例如，用2%甲醛溶液在室温下固定20分钟，常常足以保留细胞形态和抗原性。
培养细胞的固定通常只是去除培养基，并加入固定液即可。不过，去除培养基后表面张力的变化可能损害某些细胞类型。如果是这种情况，固定剂可直接加入培养基中。例如，加入与培养基相同体积的4%甲醛，将得到2%甲醛溶液，它足以预固定细胞。在2分钟后，预固定培养基应当替换成新鲜量的2%固定剂。预固定步骤让细胞更加坚硬，这样它们就能够承受表面张力改变所引起的任何可能的有害影响。
一抗的选择与优化
　　在设计IHC/ICC实验时，一抗的选择是相当重要的。IHC/ICC实验的所有步骤都必须经过优化，以便观察到特异染色，并尽可能减少非特异的背景染色。然而，应该如何选择一抗呢？选择单克隆还是多克隆抗体？一抗孵育的条件该如何优化？请看本文。
在设计IHC/ICC实验时，一抗的选择是相当重要的。IHC/ICC实验的所有步骤都必须经过优化，以便观察到特异染色，并尽可能减少非特异的背景染色。这包括开展预实验，以确定每个一抗的适当孵育条件。抗原亲和纯化的多克隆抗体的稀释度通常低于单克隆抗体，但这些值必须根据经验确定。为了获得可靠特异的信号，应采用交叉反应性极少的高质量抗体。
一抗孵育的起始条件
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选择一抗供应商
在搜索一抗时，产品很可能有几个不同的商业来源，而它们的抗体质量可能参差不齐。最初的选择也许决定了这是个成功的实验，抑或是个错失的机会。第一步是寻找独立验证。这包括在文献中检查抗体过去是否成功使用。许多供应商都可以为寻找这一信息的研究人员提供协助。另一个问题是询问抗体是否真的由供应商制造，还是它采购了之后转售？直接购买确保了商业来源对制造、质量控制流程、以及运输和储存条件的完全控制。此外，一旦抗体的使用出现问题，制造商会处于提供优质技术服务的最佳地位。
选择单克隆还是多克隆抗体
单克隆和多克隆抗体的内在特征决定了它们用于IHC/ICC时的优势和限制。单克隆抗体由单个B细胞克隆产生，代表了同质群体，能够高亲和力高特异性地与单个表位结合。这在检测蛋白家族的某个成员时特别有用，因为蛋白家族有着高比例的氨基酸同源性。
抗体结合往往依赖于目标蛋白维持其天然的构想状态。与其他蛋白的相互作用、翻译后修饰、温度、pH、固定和盐浓度都会影响抗体接近目的表位。多克隆抗体是异质的，可识别多个表位，因此它们较少受到蛋白构象变化的影响。一般而言，多克隆抗体在一定pH和盐浓度范围内也比单克隆抗体更为稳定。基于这些原因，多克隆抗体更常用于IHC/ICC实验。
多克隆抗体的亲和纯化
多克隆抗血清是抗体混合物，它们由大量B细胞克隆产生。组成多克隆抗血清的抗体以不同的特异性和亲和力与目标表位结合，也与不相关的目标分子交叉反应（非特异相互作用）。为了富集与目的抗原特异性和亲和力最高的抗体，R&DSystems的多克隆抗体经过抗原亲和纯化。在此过程中，多克隆抗血清流过包含固定化抗原分子的亲和柱。特异抗体被固定化抗原保留，而非特异抗体流过柱子，被丢弃。随后从柱子上洗脱经抗原亲和纯化的抗体。抗原亲和纯化的抗体主要与目的抗原相互作用，降低了背景染色，与未纯化抗体相比产生了更一致的结果。
一抗孵育的优化
一抗浓度、稀释液、孵育时间和温度都影响了染色质量。这些变量需要针对每个抗体和样品来优化，以便实现特异染色和低背景。优化通常是保持孵育时间和温度不变，而改变抗体浓度，以确定何时获得最佳信号和低背景噪音。例如，如果使用高亲和力的抗体，那么相对较高的浓度可能需要较短的孵育时间。相反，较低的抗体浓度可能需要较长的孵育时间。人们通常采用较长的孵育时间，以确保抗体完全渗透到体视学技术所用的组织切片。为了促进特异染色，较长时间的孵育通常在低温下开展（即4 °C vs 室温）。
组织切片染色方案的优化通常是从一抗在4 °C孵育过夜开始的。对于细胞染色，人们通常选择在室温下与一抗共同孵育1小时。抗原亲和纯化过的多克隆抗体的工作浓度（1.7-15ug/mL）通常比单克隆抗体（5-25ug/mL）要低。在比较不同浓度的相同抗体染色的样品时，在孵育步骤时必须使用一致的时间和浓度。当第一次使用新抗体时，建议开展预实验，检验各种抗体浓度。
对照的重要性
　　适当的对照对于IHC/ICC结果的准确阐释至关重要。令人满意的IHC/ICC实验设计可产生结果，说明抗原位于正确的组织、细胞类型或亚细胞定位。固定、封闭、抗体孵育和抗原修复步骤的优化将产生强烈而特异的信号。然而，有时实验也会出现假象哦，蒙蔽了你的双眼。因此，IHC/ICC实验必须包含阳性和阴性对照。
适当的对照对于IHC/ICC结果的准确阐释至关重要。令人满意的IHC/ICC实验设计可产生结果，说明抗原位于正确的组织、细胞类型或亚细胞定位。固定、封闭、抗体孵育和抗原修复步骤的优化将产生强烈而特异的信号。然而，有时实验也会出现假象哦，蒙蔽了你的双眼。因此，IHC/ICC实验必须包含阳性和阴性对照。
此外，抗体特异性、实验条件、组织类型之间生物学条件、甚至研究人员的差异都可能产生不一致的染色，导致不准确的结论。为了实现性能一致，详细记录是IHC/ICC研究的一个重要因素。在此，我们介绍了一些公认的对照，可支持您IHC/ICC结果的特异性。
内源组织背景对照
某些细胞和组织可能有着固有的生物学性质，产生背景染色，从而导致结果的误读。在一抗上样之前，应利用荧光（适用于荧光标记）或明视场（适用于显色标记）照明在显微镜下检查细胞和组织，以确保组织本身没有信号。例如，脂褐质是一种内源的自发荧光色素，可与阳性染色混淆。
无一抗对照
将组织与抗体稀释液孵育，其中不包含一抗的对照通常也是必需的。之后与二抗和检测试剂孵育。只用检测试剂染色应该是可以忽略的，它不会掩盖特异染色，也不会类似于特异染色的模式。
在使用单克隆一抗时，可利用此对照。将样品与抗体稀释液孵育，并添加与一抗相同亚型（如IgG1、IgG2A、IgG2B、IgM）和浓度的非免疫球蛋白。之后将样品与二抗和检测试剂孵育。这些步骤将确保特异染色所出现的不是由免疫球蛋白分子与样品的非特异相互作用引起的。背景染色应该是可以忽略的，与特异染色不同。
为了证明抗体是与目的抗原特异结合，首先要将抗体与免疫原预孵育。这会使抗体失活，组织应该无染色或很少染色。抗原与抗体的混合物应以10:1（摩尔比）配制，并在4 °C预孵育过夜。随后将预吸附的抗体与组织共同孵育，以取代一抗。将一抗产生的染色模式与预吸附抗体产生的相比较。
如果免疫原是肽段，那么吸附对照效果更好。不过，如果抗体是由整个蛋白产生的，则抗体与蛋白混合物的添加可能导致更高的非特异染色。尽管机理还不清楚，但有可能是预吸附所用的抗原本身与组织结合，产生非特异染色。因此，必须注意，使用整个蛋白的吸附对照不一定能验证抗体与组织中蛋白结合的特异性。
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组织类型对照
IHC/ICC实验的其他对照包括使用已知表达（或不表达）目的表位的组织样品。这种策略可提供有用的参考，也可使用在初步优化研究中。来自转基因动物的组织特别有用，它们表达或不表达抗原。此外，不同物种的组织样品也可包含在内，以支持抗体的物种特异性。
WesternBlot有必要吗？
人们常常开展Western blot实验，以补充或支持IHC/ICC研究。不过，在变性过程中蛋白构象的变化可能产生误导性的结果。对于某一特定抗体，Westernblot与IHC/ICC研究之间的不一致可能只是反映出实验条件的差异。由于多克隆抗体识别多个表位，故没那么容易产生这种实验假象。
抗原修复方法
　　固定可能会改变蛋白的生化特性，如目的表位被掩盖，或不再与一抗结合。表位的掩盖可能是由氨基酸与表位的交联、表位附近无关肽段的交联、表位构象的改变或抗原静电荷的改变引起的。抗原修复指的是逆转表位掩盖和恢复表位-抗体结合的技术。
尽管固定对于组织形态的保留是必不可少的，但这一过程对IHC/ICC检测也有不良影响。固定可能会改变蛋白的生化特性，如目的表位被掩盖，或不再与一抗结合。表位的掩盖可能是由氨基酸与表位的交联、表位附近无关肽段的交联、表位构象的改变或抗原静电荷的改变引起的。抗原修复指的是逆转表位掩盖和恢复表位-抗体结合的技术。
抗原修复技术
抗原修复的需要取决于多个变量，包括但不限于，目的抗原、所使用的抗体、组织类型，以及固定方法和持续时间。多克隆抗体能识别多个表位，因此即使不进行抗原修复，它们也比单克隆抗体更有可能检测到特定抗原。
目前有多种技术可恢复表位的免疫反应性。简单的方法有改变抗体稀释液的pH或阳离子浓度，这可能影响抗体与表位的亲和力。对于部分掩盖的表位，在开始抗原修复之前可以先试试改变一抗的孵育条件。不过，这一步也需要抗体浓度、孵育时间和温度的进一步优化。在讨论抗体修复方法时，技术通常分为两大类，蛋白酶诱导的表位修复（PIER）和热诱导的表位修复（HIER）。一旦优化好，抗原修复的影响可能是明显的。
蛋白酶诱导的表位修复（PIER）
在PIER方法中，蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶等都曾成功恢复抗体与表位的结合。人们认为作用机制是切割了可能遮盖表位的肽段。PIER的缺点在于恢复免疫反应性的成功率低，且有可能破坏组织形态和目的抗原。
热诱导的表位修复（HIER）
HIER被认为能逆转一些交联，并实现表位二级或三级结构的重建。每种组织、固定方法和待研究抗原的实验方案必须经过优化。总的来说，HIER的成功率比PIER要高得多。HIER可利用微波炉、高压锅、蒸屉、高压灭菌锅或水浴开展。在HIER实验中，微波炉是越来越流行的设备。这些方案大多加热5分钟，然后更换缓冲液。对于所有HIER方法，在开始IHC/ICC孵育之前必须让玻片冷却。HIER对时间、温度、缓冲液和pH特别敏感，最佳方法必须根据经验确定。
优化与限制
抗原修复可能需要加强样品与玻片或盖玻片的附着。此外，此技术对于冰冻组织切片和酒精固定切片通常过于剧烈。对于每种设备，时间、温度和pH必须经过优化（如92-95 °C水浴中的5-10分钟，相对120 °C高压锅中的1-5分钟）。为了优化抗原修复，必须开展初步研究，使用时间、温度和pH的各种组合。在使用抗原修复方法时，应始终考虑到染色假象的可能性。实验应当包含对照，以证明特异的抗体结合，因为染色常受到实验中多个变量的影响。
HR提供了一些试剂，可改善组织抗原检测，并增强免疫反应性。在初次优化时，研究人员可比较经中性pH7.0通用抗体修复液（货号CTS015）处理的样品和未经过抗原修复的同一组织样品。之后可能需要使用酸性或碱性的抗原修复液，这取决于组织。他们发现，碱性抗原修复液（货号CTS013）的处理通常很成功。同时也提供酸性的抗原修复液。与中性溶液相比，酸性和碱性抗原修复液更可能影响组织形态。
预防非特异性染色
　　所有IHC/ICC研究都依赖特异的抗体-抗原表位结合，这是由疏水相互作用、氢键及其它分子间作用力来控制的。不过，相同的吸引力也可能引起非特异染色，即一抗与目的抗原表位之外的氨基酸结合。这是IHC/ICC实验中经常存在的一个问题。我们的挑战在于如何降低非特异相互作用，而不损害抗体-表位的结合。
所有IHC/ICC研究都依赖特异的抗体-抗原表位结合，这是由疏水相互作用、氢键及其它分子间作用力来控制的。不过，相同的吸引力也可能引起非特异染色，即一抗与目的抗原表位之外的氨基酸结合。这是IHC/ICC实验中经常存在的一个问题。我们的挑战在于如何降低非特异相互作用，而不损害抗体-表位的结合。
非特异染色的原因包括一抗和二抗与血清蛋白的相互作用，抗体与组织之间的离子相互作用，以及与能够影响IHC检测系统的内源分子的相互作用。这些问题会产生高背景，以及无法在适当的细胞位置观察目的抗原。这种类型的染色问题可通过用封闭剂来封闭非特异相互作用来解决。在将样本与一抗共同孵育之前，可开展这些步骤。
预防非特异疏水相互作用
尽管疏水相互作用在抗原表位-抗体的结合中起了重要作用，但这些力同样能促进非特异结合。由于一些氨基酸的中性侧链，大部分蛋白有着某种程度的疏水性。将组织与热灭活的正常血清或牛血清白蛋白（BSA）共同孵育，是降低非特异疏水结合的常用步骤。正常血清类型的选择对预防与一抗或二抗的相互作用，或预防与待染色组织/细胞的相互作用很重要。例如，在使用山羊来源的一抗时，不建议用山羊血清作为封闭剂。而是推荐与二抗的宿主动物相同的血清或来自不相关物种的血清。BSA和脱脂奶粉常用作封闭剂。这些试剂通常包含在一抗和二抗的稀释液中。非离子去污剂如0.3%Triton X-100(TM)或Tween20(TM)的添加也能降低非特异疏水相互作用。
预防非特异离子相互作用
如果使用的抗体与目的组织有着相反的净电荷，那么离子相互作用可能导致非特异的背景染色。例如，非特异染色可能来自相反的羧基和氨基相互作用。范德华力、两级分子间的弱静电相互作用也能起作用。增加固定剂和/或抗体稀释液的离子强度能降低离子相互作用。不过，表位-抗体结合通常依赖于离子强度，因此这种方法也可能负面影响染色特异性。由于单克隆抗体的单表位特异性，与多克隆抗体相比，增加离子强度更可能损害其性能。
内源酶的干扰
显色检测法常使用一种结合的酶来观察表位-抗体的相互作用。在使用这种检测方法时，同一种酶的内源活性必须被封闭。例如，包含辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）的操作步骤可能需要试剂来防止非特异信号。肾、肝或带有红细胞的血管区域等组织含有内源的过氧化物酶活性。由3-10%H2O2配制而成的过氧化物酶封闭液能用于防止内源的过氧化物酶切割底物。内源的碱性磷酸酶主要在肠、肾、淋巴及其它组织中发现，能被1 mM 左旋咪唑（Levamisole）封闭。碱性磷酸酶的肠道形式不受左旋咪唑影响，但能用1% 乙酸封闭。
内源的生物素干扰
链亲和素与生物素化的一抗或二抗结合，是IHC/ICC实验常用的另一种检测系统。因此，在链亲和素孵育之前，内源的生物素必须被封闭。内源的生物素在多个组织中发现，包括肝、肾、心脏、脑和肺。样本与亲和素（avidin）预先孵育，通常可封闭内源的生物素。接下来必须与生物素共同孵育，以封闭亲和素分子上多余的生物素结合位点。在这些生物素/亲和素封闭步骤之后，样本才能与一抗孵育。
问题到底出在哪儿？
　　从技术上说，IHC和ICC实验并不难，然而，每个实验又有那么多的变量需要鉴定和优化。若运气不佳，实验结果不太好，那么我们可能要做个troubleshooting，看看问题到底出在哪儿。下表就列出了IHC/ICC实验的常见问题，以及相应的对策。
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IHC问题总结
Q1：边缘效应?
1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致. 解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。
2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。用组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。
Q2：产生组织切片非特异性染色的原因有哪些？如何解决？
1） 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。
2） 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。
3） 内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；
4） 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；
5） DAB孵育时间过长或浓度过高；
6） PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要；
7） 标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。
Q3：免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些？
1） 抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误。不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果，抗原抗体反应有前带和后带效应，必须摸索最佳浓度。
2） 抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合;建议微波修复用高火4次*6min试试。有人做过实验，这是最佳的时间和次数。若不行，还可高压修复。
3） 组织切片本身这种抗原含量低；
4） 血清封闭时间过长。
5） DAB孵育时间过短。
6） 细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。
7） 开始做免疫组化，一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。
Q4：背景强的原因?
1） 考虑一抗浓度高；
2） 然后调整DAB孵育时间；
3） 也要考虑血清封闭时间是否过短
4） 适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间等。
Q5：石蜡切片在染色过程中出现脱片现象？
1） 烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度
2） 用含有多聚赖氨酸的玻片，可以购买到或这自己做
3） 有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲PBS不要直接冲到组织上，冲到组织上方，让它流下冲洗组织，
4） 用高温修复时，温度骤冷也可能引起。
Q6： 一抗从4度拿出后，为什么要进行37度复温？
1） 一方面，防止切片从4度直接放入PBS易脱片；
2） 另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用，4度和37度时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者，后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染色。
Q7：切片染色后背景太深，如何区分特异性与非特异性着色？
全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有：
1） 抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。
2） 抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。
3） DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。
4） 组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。
5） 切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4?C冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。
6） 一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。
Q8：脱片产生的原因有哪些？
1） 多聚赖氨酸玻片质量的问题。
2） 组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。
3） 没烤好，时间短，温度不够之类。
4） 操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。
5） 修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进100度的修复液时手法不好，咚的一声就丢进去了，这样超容易脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也没办法，只有从另外的问题上着手。
6） 一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用PBS的时候尽量用泡的，不要冲。基本上把这些方面都注意到了，能改善的尽量改善，脱片可以减少很多。
7） 组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。
Q9：DAB显色后发现切片着色不均匀：如一片着色，一片不着色或染色浅？
1） 切出的片子厚度本身可能就不一样，切出一片厚，一片薄，这样可能造成着色深浅不一。
2） 有可能是你 显色液底物加到片子上后没有摇匀，造成局部底物浓度不一致，所以加完显色液后最好将片子来回左右晃动几下，使片子上所有区域的底物浓度一致。
3） 如果你的片子是中间的染色深，靠近边上的浅，那有可能是你蜡圈画的太小，显色液覆盖的面积不过大而产生了边缘效应。最外侧的组织片最好离显色液外缘0.5 cm。
Q10：染色过强
1） 抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）
2） 孵育温度过高，
3） DAB显色时间过长或DAB浓度过高，显色时间不能超过5-10分钟，以显微镜下观察为准
Q11：非特异性背景染色
1）操作过程中冲洗不充分
2）组织中含过氧化物酶未阻断 ，可再配置新鲜3%H2O2封闭，孵育时间延长
3）组织中含内源性生物素，可用正常非免疫动物血清再封闭
4）血清蛋白封闭不充分，可延长血清蛋白封闭时间
Q12：染色弱
1） 抗体浓度过低，孵育时间过短，可提高抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟
2） 试剂超过有效使用期 及时更换试剂
3） 操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释，可每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥）
4） 室温太低，低于15℃ 若室温低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分钟（或4℃冰箱过夜）
5） 蛋白封闭过度，封闭时间不要超过10分钟
Q13：染色阴性
1） 操作步骤错误 重新试验，设立阳性对照
2） 组织中无抗原 设立阳性对照片，以验证实验结果
3） 一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗与二抗种属无误
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