荧光定量pcr扩增效率计算 扩增曲线求助

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-12-05 10:11 标签： 定量pcr扩增效率
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荧光定量PCR 扩增曲线求助
诸位大侠我的试剂是使用SYBR.TAKARA的，机子是AB7300，但是做出来的扩增曲线不稳定啊。做的时候很多有时候做的还行，但是在有的时候扩增曲线出现在基线上面，有时候就是没有平台期，扩增曲线乱七八糟的。想问问这是什么原因呢？我从以下3方面入手解决。1.试剂 （开启后4°避光保存） 2。加样误差（已经很小心了） 3.仪器的稳定性（换了扩增的孔道）。事实上到现在都没查出来是什么原因。求教诸位大侠这究竟是怎么回事，问了其他实验室的师兄他们也不是很清楚。下面是我的图片。
IEF扩增曲线（58.5）.jpg
IEF标准曲线.jpg
平行1溶解曲线.jpg
扩增曲线3号平行.jpg
我使用的额是SYBR I里面的 BUFFER早就加入进去了 这个不能换吧
那这个还是别换了
好吧&&辛苦了
引物跑了胶 溶解曲线是单峰 就是扩增曲线有时候可以 有时候很差 不明白原因 请问你们在加入SYBR I的时候是在避光操作么 还是在超净台上打开灯操作呢？我的SYBR I在光照下 曝光时间有一个小时吧。（因为每次加样都得一个多小时）
尽量在光线比较暗的环境下加吧，曝光时间有一个小时可能是有点久了，换一支新的吧，我以前用Takara的也没有出现这种情况
好的&&非常感谢
片段是设计的80-200BP之间的 我再把我的荧光产物电泳一下 看看条带结果
师兄 请问方便留下QQ号码么
我做过普通PCR，从53度到60度做了一个梯度&&胶片上没有发现二聚体以及非特异性扩增，然后在条带亮度相同的情况下选择了TM值最高的一个温度进行了QPCR。
qPCR你用的SYBR法, 说明书上有标准的qPCR反应程序, 按照那个来就可以了, 一般是step1: 95℃ 30S; step2: 95℃ 5s; step3: 60℃ 30s.
40个repeats即可. 这个说明书上会有的. 你先把qPCR的扩增产物电泳检测下.
好的&&谢谢 师兄
我是按照说明书上的来加的 我再稀释一下倍数摸索一下 3Q
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荧光定量原理与分析方法　分析荧光太好了　２０１３
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荧光定量原理与分析方法　分析荧光太好了　２０１３
官方公共微信荧光定量PCR之绝对定量分析——标准曲线的绘制
1. 绝对定量定义
绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。
将标准品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，绘制标准曲线，对未知样品进行定量时，根据未知样品的CT值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。
* Log(起始浓度)与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，即得到该扩增反应存在的线性关系
* 由样品CT值，就可以计算出样品中所含的模板量
2. 绝对定量标准品
标准品的一些标准
* 必须用与扩增目的基因相同的引物进行扩增，并且扩增效率相同
* 标准品必须是经过准确定量的（我们通常用的是ASP-3700紫外光/可见光微量分光光度计）
* 标准品必须是标准化的（例如，同一化的细胞数）
* 在每组实验时，必须用相同的阈值设定来确定CT值
标准品可以是含有目的基因的线性化的质粒DNA，也可以是比扩增片段长的纯化后的PCR产物，当然也可以是基因组DNA，甚至cDNA，但前提是所有的作为标准品的核酸都必须保证稳定。
3. 标准品的制备
一般一条标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准确性。一般一个点重复三至五次，对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。
倍比梯度稀释方法：
1v原液（标准品i）+9v稀释缓冲液，得标准品ii
1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii
1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv
1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v
依次倍比稀释
拷贝数的计算：详见核酸拷贝数的计算
标准品的制作：将标准品依次进行10倍稀释，ASP-3700 测得其拷贝数1.55&108copy /ul
标准曲线的绘制（1cycle=1min）
设置对照：浓度为1.55&107、1.55&106、1.55&105、1.55&104、1.55&103、1.55&102、1.55&101的标准样品各一个，设空白对照
PCR反应：以不同浓度标准品作为模板
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标准品的扩增曲线
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标准品的溶解曲线
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标准品的标准曲线图
扩增效率（E）计算
E=10-1/斜率=10-1/-3.23=2.04，E%=(2.04-1)&100%=104%
若未知样本的CT值为19.11，将CT值代入线性方程：
即19.11=34.29-3.23X，所以X=(19.11-34.29)/(-3.23)=4.7
Quantityunknow=104.7=50118 copies
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图1：荧光定量PCR扩增曲线
与RT-PCR相比，荧光定量PCR具有以下技术优势
1.实时监测：通过扩增曲线能够实时监测PCR产物的积累。
2.特异性强：实验完成后，溶解曲线的分析可以验证扩增产物的特异性，降低假阳性。
3.精确定量：利用扩增进入指数增长期的CT值来定量测定起始模板量，从而实现了极为精确的核酸定量检测。
图2：荧光定量PCR溶解曲线
RNA抽提与定量；引物设计及荧光定量PCR；数据分析；实验报告提交。
1.技术咨询：在您开始实验之前，本公司将为竭诚您提供最有效的荧光定量PCR实验设计方案。
2.由于荧光定量PCR可以检测任何类型样本中基因的表达量，如组织、细胞、细菌等材料。因此本公司接受任何类型的样本，对于不同的样本需要的量有所不同，具体需要量请咨询本公司，
3.不推荐提供，除非您能充分证明所提供RNA/cDNA是高质量的且可用于荧光定量PCR。
4.客户提供尽可能详细的背景信息；物种信息，扩增目的基因的NCBI登录号等。
5.客户可以提供荧光定量PCR引物，如果没有引物，本公司可以设计合成,但要另外收取费用。
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注：样本应避免各类污染和反复冻融。
实验报告内容
1.RNA浓度及荧光定量PCR原始数据及分析结果；
2.荧光定量PCR完整的实验步骤、使用仪器、软件设置参数等。
实验周期及收费标准：咨询本公司
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