关注今日：38 | 主题：279379
微信扫一扫
扫一扫，下载丁香园 App
即送15丁当
【求助】请教实时荧光定量PCR的图怎么解释，大虾们不吝赐教啊
页码直达：
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
同学，你好，我最近也在做实时荧光，但CT值及扩增曲线一直不好，我看你的图觉得你做的还不错的，不知道你这是用什么做的模板呢？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
雨露0504 同学，你好，我最近也在做实时荧光，但CT值及扩增曲线一直不好，我看你的图觉得你做的还不错的，不知道你这是用什么做的模板呢？很汗，这是我们检验科做的，不是我自己做的。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
一般检验科做的，都是现成的试剂盒，检测特定的基因，如果做实验，结果变数很多，但这个只有扩增曲线没有溶解曲线，也不一定看得出好坏...
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园生物秀人才网[]
打造生物医药领域人才求职与企业招聘的专业平台
欢迎加入最专业的生命科学交流社区，结交业内好友，体验更多功能。
才可以下载或查看，没有帐号？
& & 我做的是肠道，用实时荧光定量，绝对定量，SYBR GREEN I ,现在，现在用标准菌株提取DNA，然后用标准菌株来绘制标准曲线，但是标准菌株培养后提取DNA的浓度和拷贝数都是未知的。求各位大侠帮帮忙，如何绘制标准曲线。
该用户从未签到
生物秀探花
生物秀人才网[]
打造生物医药领域人才求职与企业招聘的专业平台
本帖最后由 yohihi 于
11:25 编辑
能不能教教我，我的看家基因跑的很好，但是其他基因的标准曲线跑的不好，有什么其他计算方式算各个基因的 ...
跑的不好可能是本身目的基因表达量少或者过大。过少，可以降低稀释倍数，比如原来是10倍梯度稀释的，可以2-5倍稀释。直接增加sample浓度。过多，则反之。制作标准曲线的sample一般4个即可，多了反而误差变大。
该用户从未签到
生物秀探花
生物秀人才网[]
打造生物医药领域人才求职与企业招聘的专业平台
本帖最后由 yohihi 于
14:20 编辑
一般都不用所谓的标准样品。只要取待测样品中的野生菌株做10倍梯度的稀释，设置一个DNA浓度以后，等到反应完毕了，软件会自动帮你算出相对浓度的。你只要看看标准曲线的误差就可以了，一般R2大于0.98的算是不错的。
该用户从未签到
嗯，同意楼上的，假设一个浓度的DNA为1，然后梯度稀释，然后按稀释倍数制作标准曲线。
该用户从未签到
生物秀举人
yohihi 发表于
一般都不用所谓的标准样品。只要取待测样品中的野生菌株做10倍梯度的稀释，设置一个DNA浓度以后，等到反应完 ...
我之前看文章说到的你说的这种，以待测样本的RNA进倍比稀释后，制作标准曲线，文章提到这样做出的标准曲线斜率几乎是一样的。这种方法可以吗？不会影响到标准曲线的截距吗？咱定量的结果和标准曲线截距有关系没？谢谢你，这个问题对我很重要。
该用户从未签到
生物秀探花
daybyday2012 发表于
我之前看文章说到的你说的这种，以待测样本的RNA进倍比稀释后，制作标准曲线，文章提到这样做出的标准曲线 ...
截距什么的完全没有关系。标准曲线的制作目的说到底就是为了确定待测目的基因的扩增效率，软件再根据标准曲线来计算待测浓度。你只要注意标准曲线是不是一条直线，误差大不大就可以了。要是标准曲线的几个点偏离得很厉害，那么这条线的信用度就不怎么高了。如果你检测2个以上的目的基因，那么必须制作标准曲线，因为不同的基因扩增效率不一样。要是只检测一个基因的话就可以不必制作标准曲线了。
签到天数: 1 天[LV.1]初来乍到
一般都不用所谓的标准样品。只要取待测样品中的野生菌株做10倍梯度的稀释，设置一个DNA浓度以后，等到反应 ...
能不能教教我，我的看家基因跑的很好，但是其他基因的标准曲线跑的不好，有什么其他计算方式算各个基因的真实浓度吗？
签到天数: 1 天[LV.1]初来乍到
跑的不好可能是本身目的基因表达量少或者过大。过少，可以降低稀释倍数，比如原来是10倍梯度稀释的，可以 ...
那么我如果稀释10倍降到稀释5倍的话，在仪器上的的标曲的浓度是输入之前的1、10、100、还是输入5、25、125.。。。。呢？
更新你的简历，加入生物秀人才库，高薪工作基因编辑峰会支持人类胚胎研究(胚胎、基因细胞治疗：生物医药产业下一个风口(细胞治生物秀论坛手机版全新改版,更快速度,更好体聚焦“基因剪刀”奠基人的科研历程
12345678910
murongxiaoxiao大叔级摄影爱好者，喜欢分享绝对零度积极有责任心，热心公益事业yiii红米达人，爱拍照的北京女孩荧光定量PCR是什么检查，用什
荧光定量PCR是什么检查，用什
荧光定量PCR是什么检查，用什么样本。
共2条医生回复
因不能面诊，医生的建议仅供参考
职称：医师
专长：中医科
&&已帮助用户：121306
指导意见：一般定量检测包括总RNA提取和纯化、（可能还需要做mRNA提取和纯化）、RT、定量PCR，还需要反转录用的引物、定量PCR用的一对引物、荧光信号源
职称：医生会员
专长：儿科
&&已帮助用户：121356
指导意见：你好，聚合酶链式反应，简称PCR。传染性及治疗效果均有相关性，而目前病原体抗原检测方法一般需要105-7个病原体才可检测到、丙型肝炎病毒定量研究中发现。
问乙肝病毒DNA定量，荧光定量，
职称：医生会员
专长：妇科疾病
&&已帮助用户：27582
问题分析：你好，首先你的乙肝病毒DNA定量，荧光定量，6.01E 3提示你体内的肝炎病毒明显增高，乙肝正处于活动期，需要及时的保肝治疗意见建议：其次甲胎蛋是9.31，需要警惕在肝炎的基础上发生肝癌的可能性，建议进一步检查；如腹部增强CT
问乙肝NDA荧光定量
职称：医师
专长：肝病,结核
&&已帮助用户：134011
这个是阳性的！同时间肝功能不正常 一定要考虑进行抗病毒治疗才行的！
问荧光定量PCR检测结果分析
职称：医生会员
专长：消化不良、婴儿腹泻、婴儿湿疹
&&已帮助用户：627830
这情况没有多大问题的，一般是不需要用药的，定期复查就行了
问医生你好，我检查出有高危HPV荧光定量结果是1.9E+5，这...
职称：医生会员
专长：手足癣,传染性软疣,白驳风
&&已帮助用户：406814
病情分析： 建议您去正规医院进行治疗.治疗原则为发现湿疣存在应立即祛除.方法有激光，液氮,微波,外用药物涂抹等.然后在行全身治疗，如输抗病毒药物,增强抵抗力药物等.
问乙肝病毒DNA的荧光定量检测结果是怎样看
职称：医师
专长：肝病,结核
&&已帮助用户：134011
不知E后面是多少呢？这样才好一步的帮你进行指导。同时肝功能的情况如何。乙肝转阴没有特效根治办法.建议检查肝功,只要肝功检查正常,不要担心.但是平时一定要注意不要过于劳累,禁酒,不要吃肝损害的药物.多喝水多吃蔬菜水果.如果要吃可以吃点:复方维生素B 维生素C 肌苷片 保肝治疗,但是药物不要过多,过多的药物:中药或西药都可能反而会造成肝脏损害.因为任何药物都要通过肝脏代谢.都会或多或少加重肝脏损害.肝功能正常就不需要特别治疗,肝功正常才是目的.
问今天在医院做了孕检，检查标本种类：白带，荧光定量PC...
职称：医师
专长：功血,子宫脱垂,阴道毛滴虫病,卵巢早衰,阴道念珠菌病,子宫内膜增生,子宫腺肌病,慢性盆腔疼痛,绝经,排卵期出血
&&已帮助用户：792
问题分析：你这个检查结果提示有支原体感染的，是需要做个药敏实验看下意见建议：个人建议你及时去医院做个药敏实验看下，服用敏感的药物治疗就可以
关注此问题的人还看了
大家都在搜：
医生在线 - 免费健康咨询
随着亚健康人群的增加，各种莫名的病症都找上了门，严重时
“日出而作，日落而息”，随着社会的进展，这种良性的作息
现代社会发展节奏快,生存压力大,人的心理压力也很大,但很多
免费向百万名医生提问
填写症状 描述信息，如：小孩头不发烧，手脚冰凉，是怎么回事？
无需注册，10分钟内回答
百度联盟推广
百度联盟推广
搜狗联盟推广
评价成功！在线订购和留言
您的位置：&&&&&&
荧光定量技术服务
最专业的团队为您服务
1. 最专业的核酸分离纯化专家为您提取核酸
百泰克作为国内知名的自主创新生物公司，其优越的产品和服务取得了广大用户的认可和拥护，很多用户用我们的产品做实验并发表了很多高水平的文章，其中经RNA提取试剂TRIpure（TRIzol）发表了影响因子分别为6.427，5.52，4.00的文章，microRNA提取试剂盒发表了影响因子为6.88的文章，博奥生物芯片公司也写了一封推荐信，推荐他们的芯片客户使用我们的产品。因为我们的产品解决了他们很长时间全血RNA提取不稳定的问题，并成为他们制作表达谱芯片前期核酸提取的经典方法。这封推荐信经各大生物网站转载
。除此之外，百泰克的通用植物RNA提取试剂盒解决了长期以来多糖多酚植物RNA难以提取的问题，大大提高了植物研究工作者的工作效率。
2. 平均10-20个工作日的完成时间，解决了您的燃眉之急！
我们是专业的荧光定量技术服务提供商，因为专一，所以专业！如果一个公司什么都能做，那八成是倒一手的！
3. 客户可以全程参与实验进程，我们的实验室对客户开放，客户可以全程参与学习！
4. 为潜在客户提供免费的培训！
客户可以邀请我们的技术顾问上门进行荧光定量的技术培训，我们可以安排实验技术交流会和实验操作演示会，让初学者能迅速提高专业知识、动手能力、接受新事物的思维；初学者还可以加入百泰克Real-time技术交流QQ群,和大家一起交流学习心得，免费下载很全面的荧光定量技术资料
，在线技术咨询QQ
荧光定量PCR服务的内容
荧光定量PCR分别采用SYBR Green I染料和探针进行real time PCR，定量测定或定性分析。
荧光定量PCR服务要求
1、北京市内上门取样，外地运输为了避免RNA降解，请按照以下方式处理样本
a、细胞和动物组织保存于RNAfixer（rp1301）保存液，
b、血液样本按照3倍体积加入裂解液TRIPURE LS或者RLS,
c、植物材料用液氮研磨后加入10倍体积的裂解液PL,以上材料均颠倒混匀后放一些普通冰块或干冰就可以快递到北京，4℃ 2-3天内不影响RNA的质量。
2、通过 E-mail或其它方式提供已知的全长基因序列。
3、请尽可能提供详细的背景资料： DNA/ RNA 来源、丰度等。
荧光定量提供服务
1、根据客户提供基因序列设计特异性引物或荧光探针引物。
2、帮助客户提取 DNA/ RNA 。
3、Real Time PCR(荧光定量PCR)，实验结果分析。
4、实验完成后，提供完整的实验报告（含软件分析结果）及引物等实验材料。&
附录：荧光定量简介，原理，应用
荧光定量PCR简介
荧光定量PCR检测技术诞生至今已10多年的时间，而其应用一直都没广泛展开，究其原因，无外乎受制于相关仪器、试剂和技术的发展。近期，尤其是08年以来，仪器和试剂是遍地开花，这也使科研人员均跃跃欲试，都想借此技术使自己的研究能突飞猛进，发展势头通过查找每年所发表的文章数可一目了然。据有关统计，在 Medline 数据库中，用&Taqman& 或 &real time PCR& 作为关键词检索，1996 年是19 篇，1999 年157 篇，到2003 年就高达2984 篇，2009年会是多少呢？我们不得而知。但其迅猛的发展势头却是不可更改的，本公司真诚希望能和众多研究人员共同努力，抓住这一大好时机，为科研事业的发展贡献自身的力量。基于这一目标，本公司长期以来对荧光定量PCR，无论是技术还是多年来的产品，均进行了深入地研究，并及时推出更加优异的荧光定量PCR技术服务。
荧光定量PCR原理
荧光定量PCR最早称TaqMan PCR，后来也叫Real-Time PCR，是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能的。其原理：随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。
一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 ，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，根据最终的 PCR 产物量也不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT值（如下图所示）。
荧光域值（threshold）
是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光域值的缺省设置是PCR反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍，即：threshold。
Ct 值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。
Ct值与起始模板的关系：
研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值如下图所示。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
荧光定量检测
荧光定量检测根据所使用的标记物不同可分为荧光探针和荧光染料。荧光探针又包括Beacon技术（分子信标技术，以美国人Tagyi为代表）、TaqMan探针（以美国ABI公司为代表）和FRET技术（以罗氏公司为代表）等；荧光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料，非饱和荧光染料的典型代表就是现在最常用的SYBR GreenⅠ；饱和荧光染料有EvaGreen、LC Green等。
嵌合荧光染料法（SYBR GreenⅠ）
SYBR Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，与双链DNA非特异性结合。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，其荧光增加1000倍。所以，一个反应发出的全部荧光信号与出线的双链DNA量呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。
SYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合
双链DNA结合染料的优点：实验设计简单，仅需要2个引物，不需要设计探针，无需设计多个探针即可以快速检验多个基因，且能够进行熔点曲线分析，检验扩增反应的特异性，低的初始成本，通用性好，因此国内外在科研中使用比较普遍。
荧光探针法（Taqman 技术）：PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR 仪检测不到荧光信号； PCR扩增时（在延伸阶段），Taq 酶的 5' － 3' 切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步，这也是定量的基础所在。其过程如下图所示
荧光定量PCR的应用
分子生物学研究
1 核酸定量分析。&对传染性疾病进行定量定性分析，病原微生物或病毒含量的检测 , 比如近期流行的甲型H1N1流感， 转基因动植物基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等。&
2 基因表达差异分析。&比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证&
3 SNP 检测。检测单核苷酸多态性对于研究个体对不同疾病的易感性或者个体对特定药物的不同反应有着重要的意义，因分子信标结构的巧妙性，一旦SNP 的序列信息是已知的，采用这种技术进行高通量的 SNP 检测将会变得简单而准确。
4 甲基化检测。甲基化同人类的许多疾病有关，特别是癌症， Laird 报道了一种称作 Methylight的技术，在扩增之前先处理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影响，用特异性的引物和 Taqman探针来区分甲基化和非甲基化的 DNA ，这种方法不仅方便而且灵敏度更高。&
5 产前诊断：人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗，到目前为止，还只能只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止各类遗传性疾病的发生，如为减少X连锁遗传病患儿的出生，从孕妇的外周血中分离胎儿DNA，用实时荧光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法，易为孕妇所接受。
6 病原体检测：采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。
7 药物疗效考核：对乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析显示：病毒量与某些药物的疗效关系。HCV高水平表达，干扰素治疗作用不敏感，而HCV低滴度，干扰素作用敏感；在拉米夫定治疗过程中，HBV-DNA的血清含量曾有下降，随后若再度上升或超出以前水平，则提示病毒发生变异。
8 肿瘤基因检测：尽管肿瘤发病的机理尚未清楚，但相关基因发生突变是致癌性转变的根本原因已被广泛接受。癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期就可以出现。实时荧光定量PCR不但能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病WT1基因、肿瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。
北京百泰克生物技术有限公司
地址：北京市海淀区上地信息路15号金融科贸大厦507
联系电话：400-6788982 / 010-
传真：010-