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荧光定量PCR扩增效率很低已有11人参与
荧光定量PCR，什么参数都合格就是扩增效率很低，换了好多条件都很低，请问是怎么回事呀？引物我都加的1ul，cDNA加了1ul或者2ul，都试过，另外三步法也都试过，扩增效率都上不去，做了好多次都是，都快崩溃了。还有就是我的引物长度大概200多bp，有的接近300，一般都超过250了，这影响大吗？可是我都用三步法延伸了呀？求各位高手赐教呀！
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Nothing is impossible for a willing heart!
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荧光定量产物还是控制在100-150bp之间吧
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排除法呗。
是不是cDNA问题，有没抑制物？
从哪里看出扩增效率上不去，以前做过吗？
用的sybr还是探针？
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引用回帖:: Originally posted by bbqlhb at
排除法呗。
是不是cDNA问题，有没抑制物？
从哪里看出扩增效率上不去，以前做过吗？
用的sybr还是探针？ 用的是sybr，从一开始做，就做的标曲，一直都是扩增效率很低，不知道是不是cDNA的问题，怎样检查是不是cDNA的问题呀？
Nothing is impossible for a willing heart!
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引用回帖:: Originally posted by godloveplum at
用的是sybr，从一开始做，就做的标曲，一直都是扩增效率很低，不知道是不是cDNA的问题，怎样检查是不是cDNA的问题呀？... 测A260/A280，有没做溶解曲线，看看有没双峰出现，就是看有没非特异扩增
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标题: 实时荧光定量PCR 咨询(荧光定量,扩增效率)
摘要: [实时荧光定量PCR 咨询(荧光定量,扩增效率)] 我现在做实时荧光定量PCR，扩增效率是110%，而R2为3 18。扩增效率为什么会大于100%,请问这个结果我该怎么解释啊，请高手指教！ 关键词:[荧光定量 扩增效率]……
我现在做实时荧光，扩增效率是110%，而R2为3.18。扩增效率为什么会大于100%,请问这个结果我该怎么解释啊，请高手指教！
回复能否上传一下相关图像，扩增效率110%还可以解释，R2为3.18有点搞不懂啊回复扩增效率110%就是用R2为3.18算出来的回复扩增效率110%就是用R2为3.18算出来的你说的是斜率吧？R2是决定系数，一般在0.9~1之间，slope为3.18的话还是可以的，只要不超过110%就是可信的，至于扩增效率超过100%的问题，是因为扩增效率完全是由斜率计算出来的，那么扩增曲线的标曲的CT只要出现偏离就会影响扩增效率，比如加样手法偏差等等原因，当然也不排除体系中含有PCR阻害物，在高浓度模板CT值滞后，而低浓度模板正常扩增，这样的话斜率就会出现偏差，导致出现大于100%的情况。
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电话：021-荧光定量pcr扩增效率曲线怎么做_百度知道
荧光定量pcr扩增效率曲线怎么做
我有更好的答案
根据模板的来源不同选择不同的标准品，且浓度已知。标准品可以自己制备也可以购买。然后在进行定量的时候对标准品进行浓度梯度稀释（5倍/8倍/10倍），由于CT值跟浓度的负对数存在线性关系，所以根据CT值和已知的浓度画出标曲。一般情况下机器会自动给出标曲。
采纳率：60%
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荧光定量PCR扩增效率怎么做？？？？我要被逼疯了
请问各位大侠：
我最近在做4个基因，7个模板的荧光定量PCR，是相对定量，模板间Actin的CT值相差比较大，最低的19最高的26，这样的实验结果能不能用？？？
我用的CDNA没有稀释，稀释过10倍的，actin的CT值在25以上，很高，有什么办法能都解决这个问题？
还有，我怎么确定我的扩增效率，具体应该怎么做？是以一个模板的cDNA做5个数量级的梯度稀释以后，跑一下荧光定量PCR，然后用稀释倍数和CT值做曲线，按公式计算吗？？还有应该用别的方法做啊？？？？？？
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在罗氏480的软件里，会直接给出扩增效率
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★ 感谢参与，应助指数 +1wenjing120(金币+1): 积极应助！
PCR扩增为指数扩增，每一扩增周期后产物的量可以下式表达：
& && && &Yn=Yn-1·(1+E) = Yn-2·(1+E)2=…= X·(1+E)n& &
& && && &0≤E≤1& && && && &
& && && & 其中E表示扩增效率，Yn表示在n个周期后PCR产物的分子数量，Yn-1为n-1个周期后PCR产物的分子数量。
& && && &等式仅在限定的扩增周期数（通常为20或30）内成立。超过此周期数，扩增过程即由指数扩增降低至稳定的扩增速率，最终达到平台，不再扩增.
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引用回帖:: Originally posted by tuobaohua at
PCR扩增为指数扩增，每一扩增周期后产物的量可以下式表达：
& && && &Yn=Yn-1·(1+E) = Yn-2·(1+E)2=…= X·(1+E)n& &
& && && &0≤E≤1& && && && &
& && && & 其中E表示扩增效率，Yn表示在n个周期后PCR产物 ... 非常感谢啊！但是恕我愚昧，我还是不能将此联系到我现在的问题上，我想说，我怎么能求出这个E值，我需要做什么样的实验，还有，我上面描述的稀释倍数+CT值做曲线的方法行得通不？
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引用回帖:: Originally posted by 梁小云632 at
非常感谢啊！但是恕我愚昧，我还是不能将此联系到我现在的问题上，我想说，我怎么能求出这个E值，我需要做什么样的实验，还有，我上面描述的稀释倍数+CT值做曲线的方法行得通不？ 我也是查的资料，我再去查查，查到了的话就黏贴上来
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【原创】为什么我的荧光定量效率低
页码直达：
这个帖子发布于9年零61天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位大侠，这是我今天跑的荧光定量的结果，体系是用实验室常用的20ul体系，用的是SYBR Green,退火温度用的是52度，之前跑了梯度进行优化发现60和62度都还好，觉得温度高点特异性会好点所以用了62度，标准品用的是克隆到载体上的质粒，抽完质粒后测得浓度是10的9次方，跑荧光定量的时候我用了5个梯度，分别是10的8，7，6，5，4，但是扩增效率时高时低，不知道是为什么，急求各位大虾帮忙看看吧…………这个是我选的内参基因标准品和样品的扩增曲线[img][/img]
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还有让我很困惑的是，我用相同的基因相同的条件，昨天就跑的还不错，我不知道这是为什么，我什么条件都没改变@@大家可以看一下附件里的图！
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还有让我困惑的是我用相同的基因相同的条件昨天就扩的比较好大家可以看一下图，我很迷茫
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