随着美国454 Life Sciences公司（该公司现已被美国罗氏公司收购）的第一台新一代测序仪――454测序仪的面世，我们获得了一种完全不同的测序方式。454测序仪引 领的新一代测序技术在一直困扰传统测序技术的三个瓶颈问题上取得了突破。这三个问题分别是文库制备、模板制备和测序。而且，在随后出现的其它新一代测序仪 产品身上，我们或多或少都会发现在454测序仪上使用到的技术，这也足以说明454测序仪的技术创新的确取得了巨大的成功。 454测序仪的先行者地位使它对整个测序业的影响远远超过了其它新一代测序仪竞争对手。这一点从Leamon、Rothberg等人撰写的一篇介绍 2005年技术进展的论文被引用了570多次的事实，以及有100多篇经过同行审议的关于人类遗传学、代谢组学、生态学、进化学以及古生物学的论文 （peer-reviewed publications）都是使用454测序仪开展的研究多个事实中都能够得到证明。454测序仪技术是继Sanger测序技术之后出现的第一个用于对 细菌基因组进行从头测序的新技术，也是第一个被用来对人类基因组进行测序的非Sanger测序技术。其它使用454测序仪开展的重要研究项目包括探究蜜蜂 消失原因的项目、研究人类基因组重排复杂性的项目、建立用于研究传染性疾病新方法的项目以及对尼安德特尔人（Neanderthal）基因组的测序项目等。 1.1.1 摩尔定律对454测序仪的影响 454测序仪的迅猛发展不是因为我们想要Sanger测序仪小型化，而是因为新型奔腾芯片的出现以及摩尔定律法则给我们带来的希望。很明显，常规的 人类基因测序项目会对我们处理测序技术的能力提出更高要求，这与我们对计算机处理能力的要求是一样的。不过，只有将计算机的电子管换成晶体管，才为后来集 成电路技术的发展提供了可能，这正是计算机产业发展的关键所在。而希望对传统的毛细管电泳技术进行改良，提高它的速度和处理规模，正如只用电子管直接制作 集成电路一样不可能。因此，如果将各种测序技术比作一个个晶体管，将一系列测序步骤整合起来比作集成电路，那么也就可以用摩尔定律来预测DNA测序技术的 发展速度了。 合成测序法概念虽然在提出的时候还不算成功，但它的出现为测序仪小型化奠定了基础。基于合成测序法出现了两种策略：一种是循环可切除终止测序法 （cyclic reversible termination technology），即依次逐个添加荧光标记的碱基，继而检测荧光信号，切除荧光基团，如此往复；另一种策略是焦磷酸测序法（sequenced by detecting pyrophosphate release）。454测序仪采用的正是焦磷酸测序法，因为它似乎比第一种方法的效率更高。结果证明，454公司的选择是正确的。454测序仪采用的是 小型化焦磷酸测序反应，测序模板准备和焦磷酸测序反应步骤都是在固态芯片上完成的。 实际上，早在上世纪90年代中期，焦磷酸测序技术就已经被科研界用来进行基因分型工作了，但那时的焦磷酸测序技术还不能够满足标准的测序实验要求， 因为它的测序长度太短，因此只能用于旨在发现SNP的基因分型研究当中。当时进行基因分型操作时，是在微量滴定板（microtiter plate）上进行的，可以连续进行最多96次基因分型实验，平均每个样品花费20美分。那时焦磷酸测序还不能用于从头测序工作，因为从头测序需要对每一 个尤其是第一个碱基都能准确地区分清楚，而焦磷酸测序只能简单地对已知位点的碱基进行检测，而且从头测序要求的测序长度也是焦磷酸测序法无法达到的。 不过，由于焦磷酸测序的原理是通过检测碱基掺入时发出的光来进行测序的（图3），所以它并不需要类似于电泳之类的物理分离过程来对碱基进行区分。这 也就是说焦磷酸测序仪可以“缩小（减）”到只需要检测光线就够了，而不需要像传统的测序仪还需要电泳设备，而这正是限制传统电泳仪小型化的关键所在。发光 检测方法还能够进行多路平行操作，但是直到454测序仪出现之前，还没有人这样做过，以前都是依次进行检测的。和晶体管早期的遭遇一样（当时人们也怀疑晶 体管替代不了电子管），人们同时对高密度的，用于并行焦磷酸测序的反应也充满了疑问。不过，当我们不再在溶液中进行测序反应，而是将测序模板、所有的试剂 （酶）都固定在平板上制成芯片之后，就获得了小型化的，能进行多路并行处理的测序仪，这就与晶体管被小型化并整合成 集成电路的过程一样。此外，借 助微量滴定板上一个个的小孔所达到的将不同测序反应进行分隔这一目的，也能通过在单个固相支持物上进行严密包裹（隔离）的反应来实现。在这些各自隔绝的反 应体系中，链聚合反应速度和发光速度都能通过对反应试剂和产物弥散状况进行严密的控制来进行精密的调整。
1.1.2 新的并行试验方法 在开发新型高通量、高并行运行方法时碰到的一个关键问题是，如何将反应试剂同时加入数量如此之多的各个反应体系中？在焦磷酸测序的过程当中需要反复 加入不同的碱基以供测序反应使用，而当时的自动化加样设备无法有效地做到对这么多的反应体系同时循环加样。于是，开发一种全新的高密度并行处理方法这一重 要课题又再一次摆在了科研人员的面前。这一次，我们找到了一个非常简单但是又很巧妙地方法。在高密度的反应芯片表面使用层流（laminar flow）加样方式，反应试剂会通过扩散作用很好地进入每一个反应体系，而且也可以用层流的方式洗去多余的反应试剂。现在，所有的新一代测序仪都采用了这 种层流加样方法。 为了将每个单独的测序反应都分隔开来，我们一开始使用平板（芯片），不过在平板上平均每一平方厘米的面积上最多只能同时进行数百至数千个反应。但我 们希望达到的是在每平方厘米的面积上同时进行100万个测序反应，这样才能令测序仪小型化，同时节省试剂并进行快速成像和测序。为了实现更高密度的测序反 应，我们在平板上制作了很多小孔，将每个反应体系都安置在这些小孔中，这些小孔都足够深，足以分隔每个反应体系。虽然这种方法极大提高了测序反应的密度， 缩小了平板的面积，但是要达到我们的要求还是需要60mm×60mm大小的芯片才行。 针对图像采集问题使用了商业化的天文学照相（astrological grade camera）器材，在电荷偶合装置（CCD）的表面连接上光纤束（fiber-optic bundle）。这些光纤是锥形排列的，这样可以将大范围的光信号都传输到CCD表面上很小的一个范围。采取下面两个步骤，我们就可以制成含有高密度小孔 的芯片：先将光纤束连接到类似于载玻片一样的一次性芯片上，然后用酸蚀刻（acid etching procedure）技术在玻片的另一面打上小孔。这种酸蚀刻技术是根据制作生物传感器的技术改进而来的。 454公司制作的每张芯片上可以达到数百万个小孔，每一个小孔都是一个独立的“反应站”，互不干扰，测序反应发出的光被连接在芯片上的光纤传送到 CCD记录下来（图4）。这种芯片就好像集成电路一样一次可以同时处理数百万个测序反应。这种芯片同样也能被其它通过发光检测技术的产品所使用。454测 序仪也没有像以前的96孔板焦磷酸测序仪那样使用液态的试剂，而是将试剂和模板统统都吸附在一个个微珠上，然后把这些微珠一个个地放到芯片上的小孔中，每 孔一个微珠。这种固定步骤不仅保证了每孔测序反应的独立性，也极大地节省了试剂消耗费用。
要想实现高通量基因组测序，只对测序步骤进行优化还是远远不够的。人类基因组计划花费的30亿美元经费中有很大一部分都用在了测序样品制备阶段。当 时即使是采用最简单的制备样品方法也需要将目标片段克隆到细菌中，挑克隆，再转到96孔板，然后进行克隆扩增，提取质粒，制备测序模板。这种工作流程既耗 时也耗钱。 如果采用新型的文库制备方法就可以极大地节省这部分开支，这种新型的方法是先分离基因组DNA，随机切割成小片段分子，然后通过有限稀释 （limiting dilution）和聚合酶扩增反应，即体外克隆方式（clones without bacterial）制备模板片段。这样，从模板制备到最后的测序反应整个过程都能够在体外完成。 1.1.3 从发明到创新 从概念的提出到最后技术上的实现，454测序仪主要关注两个方面，首先是开发蚀刻光纤玻片；其次，改进焦磷酸测序方法使其能在固相支持物上进行，即将其改造成固态焦磷酸测序法，同时也对模板及文库构建方法进行了改进，让454测序仪能进行长片段测序工作和从头测序工作。 1.1.3.1 在蚀刻板上的小孔中进行固态、长片段焦磷酸测序反应 蚀刻技术经过改良之后能在75mm×75mm的玻片上刻出深55μm、宽44μm的小孔。而开发固态测序方法和改良测序长度则是两个紧密相关的问 题，因为在固定的小孔中反应实际上就能改进测序质量和测序长度。由于反应试剂能迅速渗透到小孔中，因此反应速度也会加快。而且这里也没有使用三磷酸腺苷双 磷酸酶（apyrase）提取未参与反应的碱基，而是将芯片置入反应池中通过层流液体的快速渗透作用将多余的未参与反应的碱基和反应副产品洗掉，由此得到 100bp~500bp的测序长度。在能有效去除多余碱基的同时，每轮反应中聚合酶的效率也得到了极大提高。这样高效率的聚合反应使得454测序仪具有较 长测序长度的同时也保证了高准确性，测序长度在200bp时的准确率高达99.5%。这是因为通过降低小孔中残存的未参与反应的碱基浓度，可以降低这些碱 基对聚合酶活性的抑制作用，或者降低这些碱基导致的延后错误（carry-forward error，即由于未参与反应的碱基导致的测序反应不同步现象）的发生率。454测序仪在测序长度和准确率方面具有优势还因为其在应用流体学、表面化学和 酶学（包括选择更好的聚合酶、在更高的温度进行测序反应以及更换及平衡各个酶组分）等方面都有创新（表4）。 还有一些能提高测序精度和测序长度的技术，不过暂时还没有商业化产品。这些技术包括使用可切除的终止碱基（reversible terminator）提高对同聚物（homopolymers）的检测精度；双末端测序法（double-ended sequencing），即同一模板的两条链均不测序；以及选择性酶固定法（alternative enzyme-immobilization method）等。这些技术改进还都没有用到测序仪产品中，有一部分原因是因为现在还没有必要使用。
注：蜜蜂群崩溃症（honeybee colony collapse），指的是来自养蜂业的蜂箱或自然界存在的欧洲蜜蜂群的工蜂突然消失的现象，又称作Colony collapse disorder（CCD)。 1.1.3.2 模板制备程序 完全的体外大规模模板制备工作是达成高通量、低价格测序技术的前提。已广泛使用的乳液PCR扩增技术就是一种很好的方法。不过，由于很难在热循环测序反应中保证乳液微滴的稳定性，因此最开始实验的模板扩增方法是恒温扩增法（isothermal）。 乳 液PCR不需要借助细菌的帮助就能扩增模板，虽然这一点非常诱人，但最开始时并没有合适的表面活性剂能帮助乳液在热循环过程中保持稳定。于是出现了恒温扩 增法，即滚环扩增反应（RCA）。虽然滚环扩增反应的产量非常高，但这些产物中大部分都不能用来作为测序模板。因此，还需要找到一种不需要细菌扩增，能用 于有限稀释的模板扩增新方法。于是，人们又把目光转回了PCR法。在RCA法中，首先将模板克隆有限稀释之后置入光纤玻片上的小孔中，然后用橡胶衬垫把光 纤玻片封闭起来，将玻片放入传统的平顶PCR仪进行扩增。这种方法取得了成功，但是效率不高，因为在玻片中的热质量（thermal mass）和它的钳效应（clamping mechanism）需要更长的PCR循环时间，而且模板的有限稀释度不能低于10%。孔与孔之间的相互污染现象也是一个不容忽视的问题。不过无论如何， 该方法还是第一个首先从全基因组文库中扩增模板然后使用非Sanger、非Gilbert测序法对基因组进行从头测序的方法，也是第一个使用体外模板扩增 技术进行全基因组（腺病毒基因组）测序的方法。 乳液滴的热稳定性问题最终通过加入用于制造炸药的表面活性剂得到了解决，于是乳液PCR技术马上在众多新一代测序仪中得到了广泛的应用。因为乳液 PCR技术具有高效性、可扩展性，既能从30Kb的腺病毒基因组中扩增模板，也能从好几Mb的肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）基因组中扩增模板。 随着测序精度、测序长度、乳液滴稳定性等各方面技术的不断发展，454测序仪已经不仅仅用于对细菌级别的基因组进行测序了，还能对更高级、更复杂的生物基因组进行测序，例如现代人类基因组、尼安德特人基因组以及环境基因组等。 1.1.3.3 文库制备 文库制备包括以下几个步骤，首先随机切割样品基因组，获得大量DNA片段，然后接上接头进行扩增反应。454测序仪的样品制备程序和Craig Venter等人的鸟枪法样品制备程序有着本质的差别。454公司采用的是如图4中所示的有限稀释、乳液PCR扩增法，而没有鸟枪法中的细菌克隆繁殖步 骤。去掉了细菌繁殖步骤极大地提高了整个测序工作的速度和效率，同时避免了由于细菌繁殖导致的序列丢失的可能性。这种方法同样对古老DNA和代谢基因组学 的研究也非常适用。末端配对文库制备方法的建立同样帮助454测序仪获得了对复杂基因组从头测序、对重复片段测序以及对基因组结构（复制、重排）展开系统 研究三种能力。这种末端配对文库的制备方法是受到了Bender科研小组对果蝇（Drosophila）制备跨步文库（jumping library）方法的启发而发展得来的。 1.1.4 应用范围 随着越来越多重要的研究领域受到测序技术的影响，454公司开始和其它商业和学术机构开展合作，进行样品测序和分析工作。这些合作项目又进一步验证 了454测序仪使用的技术能够在众多领域中发挥作用，例如末端配对文库技术对于研究基因组结构的作用和乳液PCR技术捕获目的DNA片段的作用等。 1.1.4.1 细菌基因组测序和比较基因组研究 为了测试454测序仪在全基因组测序方面的能力，454公司一开始就参与了一项合作项目，该研究项目会对4株结核分支杆菌基因组进行测序，这四株结 核分支杆菌分别是一株对R207910具有耐药性的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）菌株，基因组大小约4Mb；两株对R207910具有耐药性的耻垢分支杆菌（Mycobacterium smegmatis），基因组大小约6Mb；以及一株正常的耻垢分支杆菌（Mycobacterium smegmatis），基因组大小约6Mb。他们希望能发现结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）对R207910产生抗药性的机制。该项研究清晰的展现了454测序仪在测序速度和测序精度方面的优势。使用传统的 Sanger测序法对一个4Mb的基因组和3个6Mb的基因组进行测序需要好几个月的时间，而用454测序仪，在只有一位实验人员参与实验的情况下，包括 样品制备等步骤在内所用的时间仅需要一周。而且使用454测序仪还避免了传统测序方法中细菌克隆阶段可能出现的错误，获得了高质量的测序结果，发现了导致 结核分枝杆菌对R207910产生抗药性的两个点突变位点。这项研究成果让我们在最近的40年内第一次找到了特异性治疗结核病的药物，同时也对454测序 仪在细菌基因组测序方面的应用价值有了深刻的体会。随后，454测序仪又参与了比较基因组学研究项目、对高致病性细菌空肠弯曲菌 （Campylobacter jejun）基因组的从头测序项目、对幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）在慢性胃炎致病过程中的进化研究项目、从南极豆丁微信公众号
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转自 生物技术世界biotechworld cn
2005年，在国际顶级的学术期刊《Nature》上，来美国454生命科学公司的Margulies等人发表文章介绍了一种快速简单的测序方法：结合了DNA扩增的乳胶系统（emulsion system）和皮升大小焦磷酸（pyrophosphate）为基础的测序方法——焦磷酸测序（pyrosequencing）方法。发明者宣称，这种测序方法比传统的Sanger测序的方法快100倍，假如利用这种方法来进行人类基因组的测序，那么在100多天..
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454测序原理与操作流程
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罗氏454测序系统
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罗氏 454 测序系统是454 生命科学公司推出的 454测序技术，是基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统, 开创了第二代测序技术的先河。该技术是通过合成反应而测序(Seqencing-bysynthesis,
SBS)的原理进行测序的。
罗氏454测序系统测试原理
GS FLX系统的测序原理是基于焦磷酸测序法，依靠生物发光对DNA序列进行检测。在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，GS
FLX系统将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、高灵敏度和高自动化的特点。
罗氏454测序系统测序流程
1. 样品种类：GS FLX系统支持各种不同来源的样品序列测定，包括基因组DNA，PCR产物，BACs，cDNA及小分子RNA等，不同类型的样品测序都可在一台仪器上完成。
2. 样品DNA打断：样品如基因组DNA或BAC等被打断成300到800bp的片段；对于小分子的非编码RNA，这一步骤并不需要。短的PCR产物则可利用GS融合引物扩增后直接进行步骤4。
3. 加接头：借助一系列标准的分子生物学技术，将3′端和5′端有特异性的A和B接头连接到DNA片段上。接头也将在后继的纯化，扩增和测序步骤中用到。图中仅仅显示了后续步骤中要用到的单链的DNA片段。
4. 一条DNA片段=一个磁珠：接头使成百上千条DNA片段分别结合到一个磁珠上，磁珠被单个油水混合小滴包被后，在这个小滴里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响，从而实现了所有DNA片段进行平行扩增（emPCR）。
5. 一个磁珠=一条读长：经过emPCR扩增后，每个磁珠上的DNA片段拥有了成千上万个相同的拷贝。经过富集以后，这些片段仍然和磁珠结合在一起，随后就可以放入到Pico Titer Plate板中供后继测序使用了。
6. 数据读取和分析工具：GS FLX
系统提供三种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用。例如多达3Gb序列的重测序，对比已知参考序列进行的扩增产物差异分析及120Mb的从头测序工作等。
罗氏454测序系统是最早出现的新一代测序系统，其应用成果在Nature，Science上发表了多篇论文。454系统自推出以来进行了多次升级，最新的GS FLX序列分析仪的配合Titanium系列测序试剂具有更高的测序通量（400Mb每反应），具有更加广泛的灵活性和准确性，并且保持了新一代测序技术中运行速度最快（3-5天）和最高单序列读长（400bp）的优势，而且单一读长的准确性可以超过99.5%，完整测序结果一致准确性大于99.99%。Titanium系列中的新成员，长距离Paired-End试剂盒更能对长达3-20kb的插入片段进行双端测序，突破了新一代测序技术对重复序列较差的瓶颈。此外，具备完整的软件包是GS FLX的一大特色，其简单易用的图形界面，可以用来进行作图、拼接和扩增产物差异检测等研究。同时GS FLX因为其超高的测序读长，可以和传统的序列分析软件相互接轨，也是其他新一代测序技术所不能实现的。正因为其优异的性能，GS FLX 系统可以广泛应用在全基因组de novo测序和BAC文库重测序、扩增产物重测序、转录组分析、基因调节的研究等基因组学研究中[1]
罗氏454测序系统TBC服务内容
（一）全基因组de novo测序
（二）转录组测序
（三）全基因组或基因组区域重测序
（四）扩增产物重测序
（五）宏基因组测序
罗氏454测序系统TBC服务承诺
每个样本提供15倍以上的454测序数据；
全基因组精细图达到全基因组覆盖度大于95%，基因区覆盖度达到98%以上；
完成图得到完整全基因组序列，无片段错拼和遗漏，单碱基错误率低于十万分之一；
基因组一次成型计划：原核基因组单独使用454测序，达到全基因组少于10个scaffolds，无片段错拼和遗漏；
超高通量、高效率、高重复性、高准确率、低成本、完备的生物信息分析。
罗氏454测序系统应用
利用454测序系统测序植物转录组,可以得到大量的表达序列标签(Expressedsequencetag,EST)。EST是cDNA的一个片段,通常长度在150~400bp之间。研究人员可以通过连接两端有相同序列的EST,获得一个contig,直至全长cDNA序列。通过对这些EST序列与已知数据库进行生物信息学分析比较,可以进行如下研究。[2]
1新基因发现与物种基因文库的构建
2 SNP 发现以及分子标记筛选
3 转录图谱的绘制
4 代谢途径的确定
5 在分子进化研究领域的应用
6 在 sRNA 发现和功能验证领域的应用
．罗氏454测序法[引用日期]
．中国知网．2011-9[引用日期]
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