1.定义/定量PCR
广义概念下的定量PCR技术可以分为五种类型：外参法+终产物分析　　所谓“外参法”是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应。这种类型没有对样本进行质控监测，易出现假阴假阳结果，没有监测扩增效率，定量不准。内参法+终产物分析　　所谓“内参法”是指样本与阳性参照在一个反应容器内反应。这种类型对样本进行质控监测，排除假阴结果，但是定量不准。外标法+过程监测　　这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，但是无法排除假阴结果。内参法+过程监测　　由于样本与阳性参照在一个容器内反应，用同样的Taq酶和反应参与物，存在竞争性抑制，起始模板量浓度高的反应会抑制起始模板量浓度低的反应，所以定量不准。外标法+过程监测+内对照　　这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，同时排除假阴结果。这种类型是应该提倡的。 　　PCR过程的监测有多种检测模式。最常用的有三种检测模式： 　　a.R Green I 检测模式。温度循环为94—55—72°C三步法，只有引物，无探针，荧光染料镶嵌在双股螺旋链中间。通过对特定方向的强荧光检测获得信号，这种试剂检测模式易产生非特异信号，且本底光较大。 　　b.解探针模式（Taqman）Hydrolysis Probe 。温度循环为94—60°C二步法，不仅有引物，还有另外一个特异针对扩增模板的探针在引物对之间。在探针相邻两个碱基上分别结合两个荧光染料，一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态。当Taq酶在60°C延伸扩增链时，遇到探针，利用Taq酶5`—3`外切酶活性将探针水解成单个碱基，单个碱基之间距离较远，第一个染料的能量无法传给第二个染料，只好通过发射特征光子回到稳定态，通过对溶液中第一个染料的荧光检测获得信号。这种试剂检测模式增加了检测信号的特异性，但是由于利用了Taq酶5`—3`外切酶活性，一般试剂厂家只给Taq酶的聚合酶活性定标，没有同时给Taq酶5`—3`外切酶活性定标，不同批号试剂之间会给定量带来差异。另外对探针的熔点温度（Tm）仅要求其高于60°C，这就使不同试剂盒之间的特异性参差不齐，而且无法做质控检测。 　　c.（Hybridization Probes）模式。温度循环为94—55—72°C三步法，有引物，二个特异针对扩增模板相邻的探针在引物对之间，在一个探针3`碱基上结合一个荧光染料，在另一个探针5`碱基上结合第二个荧光染料。在55°C时，两个探针好接合在模板上，第一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态，通过对结合在扩增模板上双探针中第二个染料的荧光检测获得信号。这种试剂检测模式中荧光信号与特定杂交温度相关，探针的浓度始终保持不变，因此可以在扩增后检测熔解曲线作为信号的特异性质控。另外这种试剂检测模式可以用于点突变检测。 　　狭义概念的定量PCR技术（严格意义的定量PCR技术）是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果(扩增效率为零)。在国家没有出台阴阳判定标准时，所用PCR系统灵敏度最好达到一个拷贝（一个病毒）。从理论上说，只要有一个拷贝数，样本就算阳性；一个拷贝数都没有才算阴性。
2.检测模式/定量PCR
　　PCR过程的监测有多种检测模式。最常用的有三种检测模式： 　　⑴R Green I 检测模式：温度循环为94—55—72°C三步法，只有引物，无探针，荧光染料镶嵌在双股螺旋链中间。通过对特定方向的强荧光检测获得信号，这种试剂检测模式易产生非特异信号，且本底光较大。 　　⑵解探针模式（Taqman）Hydrolysis Probe：温度循环为94—60°C二步法，不仅有引物，还有另外一个特异针对扩增模板的探针在引物对之间。在探针相邻两个碱基上分别结合两个荧光染料，一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态。当Taq酶在60°C延伸扩增链时，遇到探针，利用Taq酶5`—3`外切酶活性将探针水解成单个碱基，单个碱基之间距离较远，第一个染料的能量无法传给第二个染料，只好通过发射特征光子回到稳定态，通过对溶液中第一个染料的荧光检测获得信号。这种试剂检测模式增加了检测信号的特异性，但是由于利用了Taq酶5`—3`外切酶活性，一般试剂厂家只给Taq酶的聚合酶活性定标，没有同时给Taq酶5`—3`外切酶活性定标，不同批号试剂之间会给定量带来差异。另外对探针的熔点温度（Tm）仅要求其高于60°C，这就使不同试剂盒之间的特异性参差不齐，而且无法做质控检测。 　　⑶杂交探针（Hybridization Probes）模式：温度循环为94—55—72°C三步法，有引物，二个特异针对扩增模板相邻的探针在引物对之间，在一个探针3`碱基上结合一个荧光染料，在另一个探针5`碱基上结合第二个荧光染料。在55°C时，两个探针都刚好接合在模板上，第一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态，通过对结合在扩增模板上双探针中第二个染料的荧光检测获得信号。这种试剂检测模式中荧光信号与特定杂交温度相关，探针的浓度始终保持不变，因此可以在扩增后检测熔解曲线作为信号的特异性质控。另外这种试剂检测模式可以用于点突变检测。
3.RT-qPCR组成步骤/定量PCR
RT-q是由三个步骤组成：　　1.反转录：依赖反转录酶将RNA反转录成cDNA; 2.扩增：用PCR的方法扩增cDNA; 3.检测：实时检测和定量扩增的产物.
4.RT-qRCR影响分析可靠性关键点/定量PCR
RT-qRCR影响分析可靠性关键点（Key porint):　　1.分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计 2.反转录反应的非标准化影响试验的稳定性 3.数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此通过对RT-q 的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。 存在的问题由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析： 1.新鲜、冰冻、甲醛固定的样品 2.整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞 3.总RNA或者mRNA 4.RNA反转录成cDNA的不同的引发策略 5.不同的酶以及酶的不同组合 6.变异系数、灵敏度 7.多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。 8.每一步骤缺乏标准化分析流程造成了在样品的处理，内参的使用，归一化的方法，质量控制等等因素严重影响RT-qPCR的可信度，重复性。
5.RNA 质量评价/定量PCR
　　现在RNA 定量的程序很多。最近) 比较了用Ribogreen,Agilent BioAnalyser,spectrophotometer,Nanodrop and the BioRad Experion 来定量同样的样品。结果显示没有哪两种方法得到同样的分析数据。所以用不同的方法进行定量是不明智的。因此，我们需要用统一套 来完成所有RNA样品的评价。 　　 RNA 质量　　RNA 质量主要包括RNA的纯度（没有蛋白质和DNA的污染）以及完整性。传统的RNA质量的评价通过分析A260/A280的比值或者对 rRNA的条带的分析。Agilent Bioanalyser/BioRad Experion 微流体毛细电泳系统也是一种较新的分析方法。Agilent的2100也是一种十分好的分析RNA质量的方法，它通过分析18S以及28S rRNA的分析图谱，通过图谱来反应RNA的量和完整性，其完整性通过完整性系数（RIN）来反应。样品的RINs在10-4之间。10代表完整的RNA，4代表没有完整的rRNA带。 　　由于以上的方法并非100%准确定反应mRNA的完整性，因为他们只是反应rRNA的量来间接测定mRNA的完整性。这里推荐一种方法：采用GAPDH的3’：5’分析法。 　　我们使用oligo dT进行逆转录，然后对逆转录的cDNA用multiplex荧光定量评价。设计三个taqman探针来定量三种相同大小的扩增产物。探针设计的位点分别位于3’；5’以及中部。扩增产物的之间的比值反应RNA的完整性。如果3’；5’的比值在1，反应较高度完整性，如果高于5说明降解。 　　 QRT-抑制物的组成　　QRT-PCR抑制物严重减少了PCR的灵敏度以及热动力学反应，高度的抑制还导致假阴性的结果。 　　抑制物的来源：生物样品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，盐离子，尿素，血红素，heparin以及IgG. 　　是否有抑制物的评价体系： 　　1.通过对目的样品进行梯度稀释进行PCR扩增效率的检测 　　2.通过内部扩增对照来反应样品处理过程中样本的情况 　　3.用细菌检测临床样品的抑制 　　4.通过标准人工合成的扩增进行RT-PCR来反应目标检测物的抑制情况 　　反转录反应系统 　　1.RT和PCR单一酶系统 　　2.RT和PCR分离的酶系统 　　3.RNA逆转录引物的选择 　　引物主要有三种： 　　1.随机引物：随机引物，特别是6nt引物对所有的靶位点不产生十分稳定一致的结果，建议使用15nt的随机引物. 　　2.oligo-dT：只能用于mRNA完整的样品，特别有polyA .而且对于一些特殊的变异体以及较长的3’UTR的区域比较困难 　　3.特异引物：最特异最灵敏的方法。特别RNA量足够情况下建议使用此法。
6.PCR优化/定量PCR
　　 优化主要有： 　　1.引物的浓度 　　2.建议使用SYBR Green I和EvaGreen 进行扩增和溶解曲线的测试
7.操作流程/定量PCR
　　 笔者建议的操作流程：　　I．靶的选择和试验设计 　　1.针对目的基因序列选择合适的扩增片断 　　查看以下三个网站是否有合适的已经证实的QRT- 的扩增引物，探针以及反应条件. 　　如果没有合适的或者已经证实的可以提供参考，以下的设计方案仅供参考： 　　A.最广泛使用的商业化的 C.如果Beacon Designer 无法得到您说需要的结果，或者获得到设计方案的备选数目不够的话，可以选择的服务方案，详细周到 　　D.一个免费的基于网页构架的引物和探针设计程序： 您可以挑选其中的4-6对引物进行试验，选择引物的扩增效率和灵敏度高的.这个软件可以直接与NCBI的网站进行比对，并且用NCBI的ePCR进行虚拟的电子PCR 　　引物设计简介 　　 引物长度：15-25 个碱基 　　GC含量：50%左右 　　如果引物的与AT区域富集结合，可以考虑用LNA替换几个碱基，较少引物的长度以及避免引物次级结构和3’端二聚体的影响.由于引物和模板和探针与靶点之间的分之间的相互竞争，分之内杂交，倒转重复等等会引起引物的引发探针对结合效率达降低，因此我们选择引物二聚体的△G为负值，即：&10 kcal/mol.没有连续的G/C. 　　引物探针的保存一般遵循以下原则： 　　正向和反向引物保存在-20度，浓度为10mM 或者10×工作浓度.探针应该避光保存，贮存在-70度，最好以冻干粉状态，工作浓度的液体保存一般两周左右。 　　2.输入靶序列，用进行比对 　　3.检查比对序列的多态性以及可能的错误避免这些区域来进行引物和探针设计 　　4.在靶序列中避免直接待重复区，在重复区进行杂交容易使得引物非获得产物性结合，降低DNA的扩增效率以及减少分析的灵敏度。 　　5.考虑到潜在的剪接变异体以及合适的所需要的获得到靶，通过学分析内含子以及外显子的边界，主要通过cDNA和基因组序列比对来确定。一般都设计跨最长内含子区，这样减少了扩增子受到 的污染的影响。这是十分有必要的，特别当用DNA做归一化处理以及靶向某一特异的剪接变异体。最经济的做法是让下游引物跨越剪接接头，这样允许使用一条探针检测可能剪接变异体.然后如果在有效性和灵敏度无法保证情况下，可以使用跨越单一外显子的设计方案。我们还是建议试验者用DnaseI处理样品，除去gDNA的污染。 　　6.在RT步骤时，用工具检测在特定温度下靶序列的折叠情况，避免一些高度次级结构的区域，那些区域探针和引物结合效率较低 　　7.尽可能用60-150bp的扩增产物，GC含量在60%或者稍小来确定高效的变性，更高度反应效率。GC含量高度序列容易产生非特异性的反应，短序列扩增是 　　的扩增时间缩短gDNA污染可能性减少。短的序列容易人工合成，用来做扩增多标准曲线。用oligodT进行逆转录最好设计扩增子位于靠近模板的3’区域
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定量PCR实验指南
作者：test
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定量PCR实验步骤
1. Real-time qPCR 实验设计
&&&&&&& 实验设计其实比实验本身更重要！好的实验设计可以事半功倍，节省时间！尤其做生物实验，一定要查询尽可能完全的相关资料 一定要查询尽可能完全的相关资料，整理好思路，设计好实验路线。
实验材料的处理和准备
&&&&&&& 实验材料一般分为对照组和处理组。组内要有生物重复，可以数据分析此处理是否有统计意义。在材料收集过程中，尽量避免 RNA的降解（尤其对于绝对定量的样品）。一般传统的收集材料的方法是样品采集立刻液氮速冻，然后迅速转移到超低温冰箱保存
引物设计原则：
&&&&& 上下游引物要保守为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100-200片段进行PCR扩增。所以引物的选取也要非常的保守。
&&&&& 上下游引物的长度一般为18-30bp之间，且Tm值在58-62℃之间，上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃。
&&&&& 确保引物中GC含量在30-80%。应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。引物的3’端最好不为G或/和C。引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。
&&&&& 避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构，同时也应避免引物间配对形成引物二聚体。
&&&&& 5跨外显子设计引物，用于区别或消除基因组DNA的扩增。
探针设计的基本原则：
&&&&& 保守：探针要绝对的保守，有时分型就仅仅依靠探针来决定。理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。
&&&&& Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出5-10℃，这样可保证探针在退火时先于引物与目的片段结合。
&&&&& &确保探针中GC含量在30-80%。
&&&&& &避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基
&&&&&& 探针的5’端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时， 也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。
&&&&&& Taqman探针应靠近上游引物，即Taqman探针应靠近与其在同一条链上的 上游引物。两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基。
&&&&& 避免探针与引物之间形成二级结构。
&&&&& 对于多重定量PCR，例如SNP分型检测时，SNP位点应设计在探针的中间位置，并且两种探针的Tm值应相近。
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2. RNA 提取和反转录
在抽提RNA过程中任一环节的不正确操作都可能导致RNA酶的污染。由于RNA酶的活性很难完全抑制，预防其污染是十分必要的。在实际的操作中应遵循下面一些原则：
&&&&& 全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。
&&&&& 使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。
&&&&& 在提取裂解液中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。
当然，这些也不是绝对的要求。如果是操作熟练。完全可以用初次开封的离心管和枪头，新过滤的超纯水，进行RNA 的提取。
3. Mix配制以及加样
&&&&& 一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix 都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR 灵敏度高，所以每个样品至少要做3 个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Cq 相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1μl 或者1μl 的10 倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。&
在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意：
&&&&& MasterMix 不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4 度。
&&&&& 更多的配制Mix 进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。
&&&&& 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！
&&&& &所有成分加完后，离心去除气泡。
&&&& &每个样品至少3 个平行孔。
4.仪器设置进行定量PCR实验
&&&&& 所有仪器的操作都基本一致，设置的时候包括反应板设置和程序设置。我们以以Illumina的EcoTM实时荧光定量PCR仪为例，详细看一下反应设置：
A．首先是实验目的选择：绝对定量、相对定量或者HRM。
B. 反应程序的设置：反应程序的设置要根据不同公司的MasterMix或者是仪器说明书上建议的程序，当然和引物设计的Tm值也有很大关系。
C. 实验方法的选择: SYBR Green方法，Tapman方法等。
D. 目的基因的设置：有几个目的基因（assay）和目的基因的名称。
E. 样品的设置: 包括哪个是实验组，哪个是对照组。以及负对照的设置和生物重复的设置。
F. 对照组和内参基因的设置: 这个是为相对定量做准备的。
G. 反应体系的设置：EcoTM实时荧光定量PCR仪的加样孔体积为5-30ul (推荐 20ul)。
&&& &客户如果本着节约成本的原则的话还可以使用10ul的体系。A-G这五个步骤简单设置好，可以保存，修改反应程序或者立刻进行反应。设置好之后，就可以把配置好的PCR管放进仪器，点击START进行实验。
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五、Real-time qPCR 数据分析
1. Real-time qPCR常见参数
基线（baseline）
通常是3－15 个循环的荧光信号
同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线
阈值（threshold)
自动设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍
手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。
同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。
Cq值 :与起始浓度的对数成线性关系。
分析定量时候一般取Cq:15-35。太大或者太小都会导致定量的不准确。
Rn（Normalized reporter）是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。
△Rn：△Rn 是Rn 扣除基线后得到的标准化结果（△Rn = Rn –基线）。
2. 影响Cq值的关键因素
模板浓度是决定Cq的最主要因素。控制在一个合适范围内，使Cq在15-35之间。
反应液成分的影响
任何分子的荧光发射都受环境因素影响----比如溶液的pH 值和盐浓度。
PCR反应的效率
PCR 反应的效率也会影响Cq 值。在PCR 扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增，与PCR 扩增效率高的条件下相比，可能会所产生斜率不同的标准曲线。PCR效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。一般说来，反应效率在90-110%之间都是可以接受的。
3. 如何评估实时定量PCR反应的效果
PCR扩增效率：为了正确地评估PCR 扩增效率，至少需要做3 次平行重复，至少做5 个数量级倍数(5 logs)连续梯度稀释模板浓度。
R2 值：另一个评估PCR 效率的关键参数是相关系数R2，它是说明两个数值之间相关程度的统计学术语。如果R2 等于1，那么你可以用Y 值（Cq）来准确预测X 值（量）。如果R2 等于0，你就不能通过Y 值来预测X 值。R2值大于0.99 时，两个数值之间相关的可信度很好。
精确度: 标准偏差（standard deviation，偏差的平方根）是最常用的精确度计量方法。如果许多数据点都靠近平均值，那么标准偏差就小；如果许多数据点都远离平均值，则标准偏差就大。如果PCR 反应效率是100%，那么2倍稀释点之间的平均Cq 间隔应该恰为1 个Cq 值。要以99.7%的几率分辨2倍稀释浓度，标准偏差就必须小于等于0.167。标准偏差越大，分辨2倍稀释的能力就越低。为了能够在95%以上的情况下分辨出2 倍稀释，标准偏差必须小于等于0.250。
灵敏度：无论Cq绝对值是多少，任何能够有效扩增和检测起始模板拷贝数为1 的系统都达到了灵敏度的极限。PCR效率是决定反应灵敏度的关键因素。在检测极低拷贝数时的另一个重要的考虑因素是，低拷贝时的模板数量不能按普通情况来预期。相反，它会遵循泊松分布，即进行大量的平行重复，平均应该含有一个拷贝的起始模板，实际上约37%不含有拷贝，仅有约37%含有1 个拷贝，约18%实际上含有两个拷贝。因此，为了更可靠地检测低拷贝，必须做大量的平行重复实验来提供统计显著性，并克服泊松分布的限制。
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评价荧光PCR结果的标准
除了这些因素，还必须评估和验证合适的实验对照（如无模板对照，无反转录酶对照等）以及模板质量。
实时定量PCR体系的优化
1.基本参数的优化：
MgCl2的浓度：在PCR反应中，MgCl2的浓度对酶的活性是至关重要的，不仅如此，合适的MgCl2的浓度还能在反应中得到较低的Cp(crossingpoint)值（指PCR达到指数扩增期时，产生一定的荧光高于背景并为仪器所识别时的循环数），较高的荧光信号强度以及良好的曲线峰值。所以对其的浓度选择应慎重。一般来说，对以DNA或cDNA为模板的PCR反应，应选择2－5mM浓度的MgCl2，对以mRNA为模板的RT－PCR而言，则应选择的浓度为4－8mM。
模板的浓度：如果研究者是进行首次实验，那么应选择一系列稀释浓度的模板来进行实验，以选择出最为合适的模板浓度，如果条件困难，也至少要选择两个稀释度（高和中、低浓度）来进行实验。一般而言，使Cq位于15－30个循环比较合适，若大于30则应使用较高的模板浓度，如果Cq小于15则应选择较低的模板深度。对于Cq值的确定，经验上是SYBRGreen探针的荧光信号比本底高2倍，杂交探针的荧光强度比本底高0.3倍。
2.使用SYBRGreen测定DNA时的条件优化：
MgCl2的浓度：大多数引物－模板对其的要求是2－4mM。
模板的浓度：初次实验要求做一系列的稀释浓度，如条件限制，至少完成两个稀释的度的测定。基因组DNA在50ng-5pg之间选择，质粒DNA在106拷贝数左右。
引物的浓度：引物的浓度是一个影响PCR反应的关键因素，若浓度太低，会致使反应不完全，若引物太多，则发生错配以及产生非特异的产物的可能性会大大增加。对于大多数PCR反应，0.3uM是个合适的浓度，若初次选用这个浓度不理想，可在0.1－1.0uM之间进行选择，直至达到满意的结果。
退火温度：首次实验设置的退火温度应比计算得出的Tm值小5℃，然后在1－2℃内进行选择。一般的，退火温度要根据经验来确定，这个经验值往往会同计算得到的Tm值有一定的差距。
3.杂交探针进行实时定量RT－PCR测定时的条件优化：
MgCl2的浓度：在4－8mM之间进行选择。
杂交探针的浓度：初实验用0.2uM，如果荧光信号强度不足，可以增加至0.4uM。
模板浓度设置：优化的扩增须进行一系列稀释度的实验，在条件有困难的情况下，至少要进行两个稀释度的测定。选用1pg-1ug的总RNA或是mRNA，若是模板的浓度过小（小于10ng/ul），则可加入MS2或alternativeRNA作为载体。
对照设置：每个引物都要设无模板对照，阳性对照以及污染对照。
&常见问题以及处理
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其他注意事项
1．在溶解曲线前是否插入一个同溶解程序初始温度相同的一个保温过程?
如果在熔解曲线前没有一个保温过程，则曲线会在前几个循环非常陡峭，使真正的熔解峰型几乎看不到。
2．变性温度是否合适?
&&&&& 大部分的双链DNA在95°C就开始解链了，在有些情况下在90至94°C都不能很好地变性DNA。由于部分变性，参加反应的探针和引物相应的减少了，因此反应效率会下降。
3．变性时间是否合适?
&&&&& 15到20秒对于变性扩增子是足够了，然而，长一点的产物，可能会需要30秒，60秒的变性时间通常是不需要
4．退火温度和时间是否合适?
&&&&& 检查引物和探针的Tm值，SYBRGreen的退火时间大约20到35秒，双标记探针通常是两步法，退火和延伸合并为一步，时间大约是45到60秒，温度通常在60°C。
5．在哪一步骤采集信号?
&&&&& SYBRGreenI应当在72°C，此时绝大部分的DNA是双链状态，如上所述，双标记探针通常是两步检测，因此信号采集应该在退火延伸的整合步骤。
6. 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？
判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性
如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析。
7. 文献上找到的引物和探针序列能否直接使用？
通常国外的文献可信度比较高，可直接使用；但为了保险起见，最好用blast对引物探针的序列进行必要的验证；或者再进一步用primer软件对引物探针的二级结构和退火温度进行分析，这样更有利于您对整个实验的把握。
8．在实验之前要进行哪些准备工作？
&&&&&& 首先要不加探针做常规的 PCR 实验，验证引物是否工作、模板是否降解、模板纯度是否合适，同时确定实验的最佳反应体系和反应条件。
9．标本的采集和处理应该注意什么问题？
&&&&&& 根据实验要求和目的，有针对性采集病灶部位的标本；采集好的标本，最好根据每次实验用量，用冻存管分成几小份，放在－80℃保存，以免反复冻融；标本通常分成 3 类，如细胞组织、分泌物、血清全血；如果是血清，不能有融血现象的发生，否则会影响PCR的扩增；如果是全血，最好不用EDTA作为抗凝剂，选用柠檬酸作为抗凝剂，否则会影响PCR的扩增；如果是组织，最好用蛋白酶K消化；如果是提RNA的标本，更应该防止反复冻融和保持标本的新鲜。10．在做荧光定量实验时要注意些什么呢？
在操作中，应使用不含荧光物质的一次性手套（经常替换）、一次性移液器吸头（带滤嘴自卸式），并不能用手直接触摸毛细管、离心管吗底部。
在试剂准备和标本处理时应使用超净工作台(负压式)或防污染罩，以防止对环境的污染。
操作台、移液器、离心机、PCR 扩增仪等仪器设备应经常用 10%次氯酸或 75%乙醇擦拭消毒。每次实验前后用 10%次氯酸和 70%乙醇擦拭移液器、操作台。
实验中涉及的有害有毒的标本及试剂应妥善放置，专人保管；废弃物应置专门容器中，妥善处理。
荧光探针应避光保存，加入反应液中后，应尽快配制好反应体系进行扩增。
配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管底，不要加至管壁，所有液体的混匀要用振荡器进行，不能用移液器吹打，反应体系配制完毕后低速离心数秒，避免产生气泡。
配制反应体系过程中若需标记，请在试管架或离心机管架上标记，不要直接标记在离心管上。
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