激光共聚焦(激光共聚焦显微镜,成骨细胞,胶原,定量分析) - 细胞实验 - 生物秀
标题: 激光共聚焦(激光共聚焦显微镜,成骨细胞,胶原,定量分析)
摘要: [激光共聚焦(激光共聚焦显微镜,成骨细胞,胶原,定量分析)] 前辈，我还有个问题，我作成骨细胞的培养及鉴定，现在细胞养出来了，可是鉴定结果不理想，导师建议让我用激光共聚焦显微镜检测，可是我不太懂这方面的技术，请给我个建议贝，我该怎么设计啊，做一型胶原的荧光染色可以吗？但细胞纯度可以从这定量分析吗？ 关键词:[胶原 成骨细胞 激光共聚焦显微镜 定量分析 荧光染色]……
前辈，我还有个问题，我作成骨细胞的培养及鉴定，现在细胞养出来了，可是鉴定结果不理想，导师建议让我用激光共聚焦显微镜检测，可是我不太懂这方面的技术，请给我个建议贝，我该怎么设计啊，做一型胶原的荧光染色可以吗？但细胞纯度可以从这定量分析吗？
激光扫描共焦显微镜技术及应用（转）l 样品要求：1.经荧光探剂标记(单标、双标、三标）2.固定的或活的组织3.固定的或活的贴壁培养细胞(Confocal专用小培养皿，盖玻片)4.悬浮细胞，甩片或滴片后，用盖玻片封一. 组成倒置或直立荧光显微镜、扫描头(照明针孔、探测针孔、荧光滤片系统、镜扫描系统和光电倍增管)、扫描头控制电路、计算机和图像输出设备二. 原理 Confocal 利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像 。三. 激光扫描共焦显微镜的设计特点:1.点照明2.具有照明pinhole和探测pinhole3.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦), 共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面4.具有扫描系统—— 逐点扫描成像 5.具有多个（四个） 荧光通道，可同时探测多个被标记物 l Leica TCS NT 的技术指标 1. xy分辨率比传统显微镜小1.4x传统显微镜: Rxy=0.61l/NAConfocal: Rxy=0.4l/NA2. 样品的最大厚度:大约 2mm(10X/0.2物镜)取决于三点: 物镜的景深, 与NA成反比Z轴的最大移动范围 激光的穿透力3. 样品的最小光切厚度: 大约0.35 mm 取决于两点: 物镜的数值孔径NAZ轴的最小移动步距: 40nm Z轴的分辨率: 0.35 mm 4. 激光器 Kr/Ar激光器: 477nm, 488nm, 568nm, 647nmAr激光器(UV): 361nm? 激光器的特点:1) 方向性好: 激光基本眼直线传播2) 单色性好 l=10-8nm3) 高亮度: 激光方向性好, 其在空间上的能量分布是高度集中的4) 偏振性: 激光为平面偏振光, 光纤耦合5. 四个荧光通道, 一个透射光通道, 即除了可同时采集多标记荧光图像外还可以同时采集透射光图像,但透射光图像为非共焦图像4. 激光器 Kr/Ar激光器: 477nm, 488nm, 568nm, 647nmAr激光器(UV): 361nm? 激光器的特点:1) 方向性好: 激光基本眼直线传播2) 单色性好 l=10-8nm3) 高亮度: 激光方向性好, 其在空间上的能量分布是高度集中的4) 偏振性: 激光为平面偏振光, 光纤耦合5. 四个荧光通道, 一个透射光通道, 即除了可同时采集多标记荧光图像外还可以同时采集透射光图像,但透射光图像为非共焦图像四. 共焦显微镜的类型：1.点(慢)扫描共焦显微镜: 分辨率高, 图像清晰; 噪音低; 采集图像速度慢;目镜中观察不到共焦图像2.线(狭缝)扫描共焦 显微镜(video rate) 分辨率低; 噪音高; 扫描速度快 240幅/秒; 目镜中可观察到共焦图像3.Nipkov转盘式扫描共焦显微镜 性能介于上述两者之间l 功能1.多荧光标记样品的图像采集2.无损伤、连续光学切片，显微“CT”3.真正的三维重组4.假三维图的显示5.可沿Z轴（xy平面）和Y轴（xz平面）方向进行光切6.定量分析7.xyt 、xzt、xyzt 和 xt 扫描—— 时间序列扫描8.图像处理9. 旋转扫描10.区域扫描11.光谱扫描 激光扫描共焦显微镜技术的应用应用 ：? 定位、定量? 三维重组? 动态测量¨ 活细胞或组织内游离Ca2+浓度的测量¨ 活细胞内H+浓度（ pH值）的测量¨ 自由基的检测¨ 药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量 ? 细胞膜电位的测量? 荧光漂白恢复（FRAP）的测量? 笼锁解笼锁的测量? 荧光能量共振转移（FRET）的测量? 其他应用一.定位、定量? 免疫荧光标记（单标、双标或三 标）的定位、定量如：细胞膜受体或抗原的分布，微丝、微管的分布、 两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位? 细胞凋亡(Apoptosis): AnnexinV-fitc + PI? 末端原位杂交-fitc + PI? 荧光原位杂交： 染色体基因定位? 单细胞凝胶电泳? GFP的表达? 游离Ca2+ 的分布与定量? 定位、定量研究中常用荧光探针1.Amine-Reactive Probes与抗体耦联、与配体耦联、与肽耦联、与人工合成的寡聚核苷酸耦联的探针，可用于免疫组化、荧光原位杂交、受体标记等FITC (fluorescent isothiocyanate) BODIPY FL 503/512异硫氰基荧光素 494/518TRITC 四甲基异硫氰基罗丹明 544/572 BODIPY TMR 543/569Texas Red 德州红 595/615 BODIPY TR592/618PE 藻红蛋白 565/578 cy3 490/530cy5 650/6901)细胞表面抗原、胞内某种蛋白免役荧光标记： 与抗体耦联, 直标: 一抗+荧光探针间标: 二抗+荧光探针如: 微管蛋白 抗 tublin抗体+荧光探针肌动蛋白 Palloidine+荧光探针2)细胞膜表面受体 配体+荧光探针如: nAchR、mAchR、多巴胺受体(D1,D2)标记 Gm1: 霍乱毒素受体 霍乱毒素+FITC2.标记细胞器荧光探针1)线粒体 MitochondriaRodamin 123 505/534 ，可染活细胞，阳离子性,可检测线粒体膜电位, 且在多数细胞中停留时间短JC1 线粒体膜电位低时为单体 490/527 发绿光线粒体膜电位低时为多聚体 490/590 发红光可标记活细胞线粒体，且为检测线粒体膜电位最佳探针Mitotracker Green FM 490/516, 染活细胞或固定细胞 ,稳定不漏出Mitoracker Orange CMTMRos 551/576, (氧化型)Mitoracker Orange 还原型, 只能染活细胞 2)溶酶体 Lysosome中性红 541/640: 微偏碱性, 可标记溶酶体等酸性器官为非特异性AO : LysoTracker Green DND-26 504/511, 染活细胞LysoTracker BlueLysoTracker Red3)内质网 Endoplasmic ReticulumDiOC6 484/500: 非特异性, 较高浓度标记内质网,较低浓度标记线粒体4)高尔基体 Golgi apparatusNBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死细胞 ¨细胞器的单克隆抗体5)细胞核PI propidium iodide 536/617 DNA/\RNA 死细胞碘化丙啶EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死细胞Hochest 1 DNA A-T 活细胞Hochest 33258 (同上)DAPI 358/461 DNA A-T 半通透细胞Chromomycin A3 450/470 DNA G-CAO 500/526 DNA 活细胞460/650 RNATOTO-1 514/533 DNA 死细胞SYTO 活细胞3. GFP 绿色荧光蛋白GFP的的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发光蛋白(aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母整体几提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白 GFP, 后经研究表明，在水母体内Ca2+和肠腔素与水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白产生蓝色荧光，GFP在蓝光的激发下，产生绿色荧光 。将外源基因与GFP DNA 相连, GFP可作为外源基因的报告基因实时监测外源基因的表达.GFP主要应用: 对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察如: 可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中的时空表达GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞, 可动态观察该分泌蛋白分泌到细胞外的过程GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能显示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器的结构及病理过程l 定位与定量测量应注意的问题定位：1.可以对图像进行修饰，2.pinhole 可尽可能的小。3.确认共定位时要取两个通道荧光相互干扰的对照图像定量：1.的各个条件必须一致2.必须用原始图像进行定量测量3.Pinhole尽可能的大二.显微CT与三维重组光切的层数： VoxelsizeZ ￡ 2VoxelsizeX三.动态测量l Physiology:细胞内离子动态变化测量1).游离Ca2+测量检测游离Ca2+变化荧光探针的原理：这类探针多为Ca2+螯合剂，不与Ca2+结合时不发荧光，通常也不能进入细胞膜，只有与乙酰甲酯AM相连方可进入细胞内，被细胞内酯酶水解后并与胞内游离钙结合后发出荧光。Kd值为Ca2+解离常数，表明检测Ca2+浓度的范围:0.1xKd-10xkd, Kd和很多因素有关，如pH、 Mg2+、与蛋白的结合、温度等。细胞内生理Ca2+浓度值(10-100n M)，细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）
荧光探针 激发波长 发射波长 KdFLuo3-AM, K+, dextran 506nm 525nm 390nM Fluo4 506nm 525nm Calcium Green-1 507nm 530nm 190nMCalcium Green-2 507nm 535nm 550nMFura red 420/480nm 637nm 140nMOregon Green 488 494nm 520nm 20,000nMCalcium Crimson 583nm 602nm 328nMIndo-1 356nm 405/458nm 230nMFura-2 340/380 476nm 145nMl 相对 测量
DF/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)l Ca2+浓度绝对测量l 单波长公式法Fluo3: 530nm Kd=450nM[Ca2+]I =Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)Fmin: 细胞内无钙时的荧光强度( MnCl2)Fmax：细胞内钙饱和时的荧光强度(A23187)? 测量时切记细胞内静息Ca2+浓度的相对荧光强度值不能太低（F值不低于40）细胞内生理Ca2+浓度值（10-8 -10-7 M）细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）? 标准曲线法根据条件和负载条件，以不同Ca2+浓度的Buffer(EGTA- Ca2+)做标准曲线，横轴为Ca2+浓度，纵轴为荧光强度? 比例荧光的测量.双波长(比例荧光：ratio) Indo1(360, 420/480), fura2(340/380, 440)[Ca2+]I =Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2? 细胞器的Ca2+测量1.线粒体内游离Ca2+测量Fluo-3 + TMRM(线粒体荧光探针，红色）2. 特异定位的重组水母发光蛋白水母发光蛋白与 Ca2+结合后发蓝光用含有水母发光蛋白和含有特定细胞器蛋白的表达载体转染细胞，可测定亚细胞器内的游离Ca2+变化 目前已商品化的探针可检测：线粒体、内质网、细胞核内的游离Ca2+，因发光很弱不能使用Confocal检测 细胞内游离Ca2+测量的应用l 钙的特性1．细胞内外的电化学(electrochemistry)梯度103-104倍2．细胞膜渗透性稍有改变或钙库释放稍有增加，导致胞内钙明显升高3．细胞内钙为细胞激活“开关”l 细胞内钙的生理作用1．肌肉的兴奋收缩-收缩偶联2．神经递质(neurotransmitters)的释放3．学习记忆的增强4．卵子受精5．细胞分裂(cell division)和再生6．细胞调亡7．细胞间通讯8．细胞信号传导9. DNA合成10. 基因表达l 细胞内钙超载与疾病1．高血压、脑缺血、心脏病、内分泌病—胞内钙浓度异常2．糖尿病、风湿性关节炎、多发性硬化病—胞内钙浓度增高3．人体缺钙—骨钙大量丢失，神经细胞的钙浓度增高4．老化和老年性痴呆-神经细胞内钙浓度增高 细胞内生理Ca2+浓度值（10-8 -10-7 M）细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）五.荧光漂白恢复(FRAP: Fluorescence Recover after photobleaching)定义:经荧光探针标记的细胞的某一区域一旦被高强度的激光照射后,荧光物质的光化学结构被迫坏,荧光强度下降, 且为不可逆的过程, 但此处荧光强度会渐渐恢复, 荧光强度和恢复的快慢和多少,代表周围分子扩散的速率, 或分子运动速度。R=(I2-I1 /I0-I2)′100%R-荧光漂白恢复率：代表分子的运动速度应用：细胞间通讯， 细胞膜流动性，蛋白分子的运动六.笼锁解笼锁的测量定义：笼锁化合物全称为光致不稳定笼锁化合物，为人工合成的用隐蔽基团修饰活性分子的化合物，一旦被紫外光照射，两者间的共价键几解离而释放出活性分子，这一光解作用称为解笼锁。
笼锁化合物的种类：笼锁的神经递质(neurotransmitters)、笼锁的第二信使、笼锁钙等七．荧光能量共振转移( fluorescence Resonance Energy Transfer)能量转移：能量从分子的一个部位向另一个部位的传递，或能量从一个分子向另一个分子传递。能量的提供者叫能量供体，能量的接受者叫能量受体。能量共振转移：分子可以看作为正负电荷分离的一个偶极子，受激发以一定的频率振动，如果其附近有一个振动频率相同的另一分子存在，则通过这两个分子之间的偶极-偶极相互作用，能量可以非辐射方式从前者转移到后者，这种能量转移称为共振转移荧光能量共振转移的条件两个荧光分子：供体-FL1，受体-FL2供体与受体的距离在2-7nm供体的发射波长与受体的激发波长一致l 检测以FL1的激发波长的光照射样品，没有共振转移时，只检 测到 FL1的发射光(绿光)，发生共振转移时，就可检测出FL1的荧光(绿光)减弱，FL2(红光)的增强。l 应用：检测大分子的相互作用D 大分子构象的改变(蛋白)例：大分子(亚基)的结合与分离D 受体与配体的结合 ? 常用荧光探剂：FITC/TRITC, Cy3/Cy5, BFP/GFP 八 .其它应用生物材料,例: 细胞在生物材料中的生长状态及分布激光扫描共焦显微镜的发展趋势：l 连续光谱型Confocall 多光子激光扫描显微镜—— Multiphoton Laser Scanning Microscopy回复
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电话：021-荧光定量图像分析&激光扫描共聚焦显微镜不仅可以对生物样本进行二维和三维图像分析，还可以与荧光探针相结合，在图像处理的同时，进行图像定量分析。例如细胞面积及周长的测定和细胞核面积的...
荧光定量图像分析
激光扫描共聚焦显微镜不仅可以对生物样本进行二维和三维图像分析，还可以与荧光探针相结合，在图像处理的同时，进行图像定量分析。例如细胞面积及周长的测定和细胞核面积的测定，从而可以将生物体的形态学特征进行量化，提高了研究结果的准确性。激光扫描共聚焦显微镜能对单标记或双标记生物样品的共聚焦荧光定量分析，并显示荧光沿Z轴的强度变化。根据实验要求设置好仪器测试的各种参数后，计算机便能自动进行数据采集，并将结果储存起来，供以后分析和输出。定量图像分析结果的表达有数字、直方图和二维坐标形式等，将生物样品的平均荧光强度、背景荧光强度、面积、周长和形状因子像素点等显示出来，同时在一种方式中表达。
我国学者为了解肝病患者肝组织纤维化程度，应用激光扫描共聚焦显微镜进行荧光定量图像分析。他们先把经肝穿刺活检得到的肝组织实施免疫荧光组织化学染色，肝组织I、Ⅲ型胶原分别与荧光素标记结合，被标记上荧光素。不同的荧光素被共聚焦显微镜中激光管激发后，荧光强度和荧光面积的变化可以被计算机分析，便能准确地量化肝组织纤维化程度。首先，使用检测I、Ⅲ型胶原的荧光定量表达。 Ⅰ、Ⅲ型胶原以红、绿双色荧光通道扫描观察，绿色荧光的激发波长为488nm，在；30nm波长以上观察，红色荧光的激发波长为543nm，在；60nm波长以上观察。每张切片选取10个视野观察，并由计算机自带扫描分析软件测定荧光强度与荧光面积。上述指标的荧光值＝平均荧光强度×平均荧光面积。研究结果显示：经FITC和TRITC免疫荧光双重染色的Ⅲ型胶原阳性表达为绿色荧光；I型胶原阳性表达为红色荧光。慢性肝炎、肝硬化患者Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达大量增加，在门管区、血管壁周围及炎性坏死区均可见到I、Ⅲ型胶原表达增加，并向肝小叶内延伸。分隔包绕肝小叶；肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的荧光定量、G-S分期积分和已检测的肝纤维化指标，如透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)和Ⅳ型胶原C(n-—C)相关性分析得出结论：在慢性肝炎和肝硬化时，上述研究指标均呈显著相关性。由此说明此种方法的荧光定量分析能准确地量化肝组织纤维化程度，对患者的治疗和预后有指导性意义。
四种指标的相关分析(γ值)
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那请问做某个蛋白的含量和定位，实验结合WB和激光共聚焦是否更具有说服力？？
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直接买培养基
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根据研究目的是怎么说呢？什么情况用western,什么情况用共聚焦呢？
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western是半定量实验，激光共聚焦也可以定量，这两个哪个结果更可靠呢？
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不好意思，刚看到信息，还需要吗？可以留下你的信息，看到后联系你。
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亲，没有的。如果短期用，可以试用。
我刚刚在丁香通试用中心申请了一款金准血糖仪试用装，觉得很不错，推荐大家也来申请吧。
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请问，左下角两个双层膜结构是自噬体吗？还是说是其他双层膜结构的细胞器
第二张双层膜的是吗？另外大的双层膜结构旁边，有个小的较暗的东东是什么呢？谢谢大家。
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好的，非常感谢
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对，就是这样的，是哪个按钮可以实现互换呢？数据较多，不好重新输入数据
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您好，我的数据如下，我怎么样能把数据调换一下？现在是同一组不同时间点对比，我想要同一时间点不同组对比，谢谢！
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你好，我也是学生，可以进一步交流
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蛋白分析软件alphaview,图片反相调节(白底黑条带)保存，插入word为什么确是原来的样子（黑底白条带）？如何才能是黑条带呢？谢谢
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你好，请问graphpad prism要插入其他软件的图进行排版，格式是TIF的，提示格式不对，应该怎么样才能把图导入呢？谢谢
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请教，graphpad prism可以插入其他软件做出的什么格式的图片？我插入TIF格式图片，提示格式不对，应该怎么办呢？
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请问最后怎么解决呢？我的图片是TIF格式，说是格式不对
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请问怎么解决的呢？
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引用一篇博士论文，编辑意见让体现是博士论文还是硕士，这在论文中参考文献格式应该如何写？不是学位论文都是D吗
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试了好多方法，开根号，取对数，还有取倒数，但是还是不能成正态分布，请问还有什么方法吗？如何实现？关注今日：14 | 主题：209225
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western和激光共聚焦比较，定量结果哪个好?
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western是半定量实验，激光共聚焦也可以定量，这两个哪个结果更可靠呢？
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因为研究的目的不同，没有可比性
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都是相对定量，简易程度不同，需要根据自己实验设计来选择。
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共聚焦一般不做定量
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young74361 因为研究的目的不同，没有可比性根据研究目的是怎么说呢？什么情况用western,什么情况用共聚焦呢？
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冰凝果84 young74361 因为研究的目的不同，没有可比性根据研究目的是怎么说呢？什么情况用western,什么情况用共聚焦呢？WB研究蛋白表达量，但是不注重体现其在细胞中的定位；共聚焦着重研究蛋白在细胞层面的表达情况
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young74361 冰凝果84 young74361 因为研究的目的不同，没有可比性根据研究目的是怎么说呢？什么情况用western,什么情况用共聚焦呢？WB研究蛋白表达量，但是不注重体现其在细胞中的定位；共聚焦着重研究蛋白在细胞层面的表达情况那请问做某个蛋白的含量和定位，实验结合WB和激光共聚焦是否更具有说服力？？
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charol young74361 冰凝果84 young74361 因为研究的目的不同，没有可比性根据研究目的是怎么说呢？什么情况用western,什么情况用共聚焦呢？WB研究蛋白表达量，但是不注重体现其在细胞中的定位；共聚焦着重研究蛋白在细胞层面的表达情况那请问做某个蛋白的含量和定位，实验结合WB和激光共聚焦是否更具有说服力？？我个人觉得比较好的
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