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实时定量PCR,一定要做标准曲线么?有什么作用?
我是个实验新手,想问一下做实时定量PCR时,一定要做标准曲线么?一般做多大的体系呢?
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一、 样品RNA的抽提
取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
两相分离 每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12 000 rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12 000 rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
RNA清洗 移去上清液，每1 mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7 000 rpm离心5分钟。
RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
二、 RNA质量检测
紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。
（1）浓度测定
A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下：
RNA溶于40 μl DEPC水中，取5 μl，1:100稀释至495 μl的TE中，测得A260 = 0.21
RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
取5 ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为：
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg
（2）纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
变性琼脂糖凝胶电泳测定
1 g琼脂糖溶于72 ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10×MOPS电泳缓冲液 浓度
成分 0.4 M
MOPS，pH 7.0 0.1 M
乙酸钠 0.01 M
灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
（2）准备RNA样品
取3 μgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
上样前凝胶须预电泳5 min，随后将样品加入上样孔。5-6 V/cm电压下2 h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3 cm。
（4）紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。
三、样品cDNA合成
逆转录buffer
逆转录酶MMLV
轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。
混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5 μl，37℃水浴60分钟。
取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。
四、 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR
β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3 μl按10倍稀释（加水27 μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。
反应体系如下：
标准品反应体系
SYBR Green 1 染料
阳性模板上游引物F
阳性模板下游引物R
阳性模板DNA
32.5 μl 8
轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。
管家基因反应体系：
SYBR Green 1 染料
内参照上游引物F
内参照下游引物R
待测样品cDNA
32.5 μl 8
轻弹管底将溶液混合， 6000 rpm短暂离心。
制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃　2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。
五、 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板
针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。
10× PCR缓冲液
MgCl2 溶液
dNTP混合液
加水至总体积为
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）； 72?C延伸5分钟。
（3）PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
（4）将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。
六、 待测样品的待测基因实时定量PCR
所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。
体系配置如下：
SYBR Green 1 染料
待测样品cDNA
轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。
（3）将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃ 2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。
七、 实时定量PCR使用引物列表
引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
最新实验心得
(共4个心得)
CT值越高说明扩增的产物越多，这个方法我试过；还有就是可以在逆转录的时候增加total RNA量，一般是1000ng；镁离子浓度我没有试过，我们用的是东洋纺的SYBR MIX,就按上面的量来加，mg都是混好的。我们用的内参是18s，一般CT正常能在13,14左右。
发表于 12:57
多聚集链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术发明至今已近20年了，在这期间技术得到了不断的发展，近年来出现的实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。
发表于 17:58
一般的RT-PCR引物是不能用来做是实时荧光定量的的引物的，但是你可以设计出兼顾二者的引物，除了要注意一般引物设计的原则外，愚见认为还要注意下两个问题：
1：设计引物扩增出来的片段一定要小一点不要超过250bp尽量在200bp以内，150bp以上
2：实时荧光定量的引物一定要更加注重它的错误引发效率，越低越好。
发表于 23:05
(共40个问题)
相关实验Protocol
谁能提供实验帮助？
谁做这个实验？
nan,感觉一窍不通
操作严格按照实验步骤进行，保证提取物的纯度。
谁关注这个实验？
丁香通采购热线：400-
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实时荧光定量PCR检测的数据处理及结果报告-PPT（精）
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实时荧光定量PCR检测的数据处理及结果报告-PPT（精）
官方公共微信实时荧光定量PCR相对定量用标准曲线法还是2-ΔΔCt法，后者还做标准曲线吗？是不是标准曲线法更准确-学网-中国IT综合门户网站-提供健康,养生,留学,移民,创业,汽车等信息
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实时荧光定量PCR相对定量用标准曲线法还是2-ΔΔCt法，后者还做标准曲线吗？是不是标准曲线法更准确
来源：互联网 发表时间： 15:31:00 责任编辑：鲁晓倩字体：
为了帮助网友解决“实时荧光定量PCR相对定量用标准曲线法还是2-ΔΔCt法，后者还做标准曲线吗？是不是标准曲线法更准确”相关的问题，学网通过互联网对“实时荧光定量PCR相对定量用标准曲线法还是2-ΔΔCt法，后者还做标准曲线吗？是不是标准曲线法更准确”相关的解决方案进行了整理,用户详细问题包括:
看文献上都做了标准曲线，那个是不是很麻烦，我只求顺利毕业，天啊
，具体解决方案如下：解决方案1：你的是相对对量用2-ΔΔCt法，标准曲线是绝对定量。解决方案2：
用这种方法的前提是你默认扩增效率一致，如果你做的次数多的话，每次都要先做下标准曲线。而2-ΔΔCt法不用做标准曲线，但是缺点是两者都可以，我觉得标准曲线法较麻烦
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