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[28]荧光光谱法研究四环素和牛血清蛋白的荧光猝灭和增敏作用_玄光善
第23卷,第6期2006年11月光　谱　实　验　室ChineseJournalofSpectroscopyLaboratoryVol.23,No.6November,2006荧光光谱法研究四环素和牛血清蛋白的荧光猝灭和增敏作用玄光善　孙红梅　吴效楠　王洪涛　杨玲(青岛科技大学药学系　山东省青岛市　266042)??摘　要　利用荧光光谱法研究了四环素和牛血清白蛋白(BSA)分子间的相互作用,在BSA荧光最强的pH=6.5的醋酸缓冲溶液中测定了结合常数(在19℃,7.61×103L?mol-1)和结合点数(n=0.88)。研究表明:四环素可猝灭BSA的荧光,是静态猝灭过程。同时四环素的荧光也被BSA增敏并随着BSA的浓度的增加而增加。用同步扫描法讨论了四环素对BSA构象的影响和作用点位。关键词　四环素,牛血清蛋白,荧光,相互作用。中图分类号:O657.32　　　文献标识码:A　　　文章编号:06)06-1318-051　引言白蛋白是主要的血清蛋白,药物进入人体后总要通过血浆蛋白(主要是白蛋白)的储存和运输到达受体部位发生药理作用。因此研究蛋白质-蛋白质、药物-蛋白质之间的相互作用是药物动力学及临床药理学的重要内容[1],也是体内药物分析和新药开发的理论依据和基础[2]。四环素族和牛血清或人血清的研究已有报道[3,4],并在牛血清或人血清与四环素族之间的结合距离和能量转移问题进行了探讨。2　实验部分2.1　试剂和仪器牛血清白蛋白(BSA,美国Sigma公司),盐酸四环素(TC,华北制药厂),其他试剂均为分析纯。实验中所用的仪器970CRT荧光分光光度计(上海三科仪器厂),762紫外分光光度计(上海精密仪器厂)。2.2　实验方法2.2.1　储备液的配制0.25mol?L醋酸缓冲溶液的配制如下:先配制0.25mol?L-1-1-1醋酸溶液,然后用0.25mol?LNaOH溶液调溶液的pH值直到pH=6.0―8.0。1mgBSA溶于1mL的醋酸缓冲溶液中,在4℃的条件下冷藏备用。准确称取0.1203g盐酸四环素,溶于250mL容量瓶中,加入0.25mol?L-1醋??联系人,电话:(7;HP:;E-mail:.cn作者简介:玄光善(1964―),男,朝鲜族,吉林省和龙县人,青岛科技大学,博士,主要从事蛋白质-蛋白质,药物-蛋白质相互作用的研究。第6期玄光善等:荧光光谱法研究四环素和牛血清蛋白的荧光猝灭和增敏作用1319酸缓冲溶液稀释到刻度(1×10-3mol?L-1)再进一步稀释得到所需的浓度。2.2.2　荧光的测定(1)含有BSA的不同浓度的四环素溶液的荧光光谱的测定为以284nm为激发波长,在300―600nm范围内测定不同浓度四环素对BSA荧光猝灭的荧光光谱。四环素溶液的荧光测定为以393nm为激发波长,在460―650nm范围内测定荧光光谱。(2)固定BSA浓度,依次加入不同浓度的四环素溶液,分别设定????=15nm、=60nm进行同????步扫描。3　结果与讨论3.1　BSA和四环素的荧光光谱BSA为分子量62000的蛋白质,BSA的内源荧光来自于分子中的色氨酸和酪氨酸。BSA的激发光谱和发射光谱表示在图1中的a和b,其激发波长为284nm,发射波长为344nm。并且在0.02―0.12g?L-1实验浓度范围内,发射光谱在344nm处的荧光强度随着BSA浓度的增加而增强呈线性关系。I=9.11+8.43×10C,r=0.999。对浓度为3.0×10mol?L的四环素溶液在pH=6.5的醋酸缓冲溶液中测定激发光谱和发射光谱表示在图1中的c和d,其激发波长和发射波长分别为393nm,530nm。从图1中可看出BSA的发射波长和四环素的激发波长比较接近,图谱部分重
叠。3.2　pH的影响溶液的pH直接影响到BSA的电荷分布,从而影响发射的荧光强度,BSA和一些小分子形成复合物时,溶液的pH将影响复合物的稳定性也影响荧光强度。为了观察溶液的pH对发射荧光强度的影响,分别测定在不同pH的醋酸缓冲溶液的0.08g?LBSA和8.0×10mol?L四环素溶液的发射光谱的荧光强度进行了比较并表示在图2。从图2可看出在pH=6.5时有最大的发射荧光强度,而四环素的荧光强度随溶液的pH的增大而增大,但四环素在碱性溶液中很容易降解,并且pH=6.5能维持自然的BSA三维结构。因此,择pH=6.5为最佳酸度。3.3　四环素对BSA的荧光猝灭BSA浓度为0.08g?L,四环素浓度分别为0×10,2×10,3×10,4×10,5×10,6×10-5mol?L-1,在pH=6.5的醋酸缓冲溶液中以激发波长??ex=284nm,在300―550nm范围内扫描时,荧光谱图如图3所示。从图3的插图可看出随着溶液中存在的四环素的量的增多BSA的荧光强度逐渐降低,并且BSA的发射波长的峰值逐渐发生蓝移。BSA的荧光强度降低说明四环素对[5]BSA有荧光猝灭,但不像BSA和乙酰水杨酸相互作用没有明显的等吸收点,说明四环素和BSA的相互作用不形成稳定的络合物。如果四环素共存时的荧光强度对纯BSA的荧光强度进行归一化的结果如图3所示。从图3可看出随着共存的四环素的量的增多380nm以上的荧光强度增强,说明-1-5-5-5-5-5-1-5-12-3-1图1　0.08g?L-1BSA和3.0×10-3mol?L-a――??ex(BSA);b――??em(BSA);c――??ex(TC);d――??em(TC)。1四环素在醋酸缓冲溶液中的激发和发射光谱图
1320光谱实验室第23卷图2　在不同pH醋酸缓冲溶液中BSA和四环素的荧光强度(a)和(b)分别表示牛血清和四环素的荧光强度随pH
变化。图3　在不同浓度的四环素存在下0.8g?L-1BSA的荧光猝灭光谱a――0×10-5;b――2×10-5;c――3×10-5;d――4×10-5;e――5×10-5;f――6×10-5mol?L-1。3.4　BSA对四环素的荧光增敏作用为了观察BSA对四环素的荧光增敏作用,在3.0×10-5mol?L-1四环素溶液中改变BSA的浓度时以四环素的激发波长为激发波长测定四环素的荧光强度并进行了比较(图4所示)。从图4可看出随着溶液中共存的BSA的量的增多在530nm处四环素的峰荧光强度逐渐增大,说明BSA对四环素有荧光增敏作用。图4的插图部分表示BSA-TC体系中以BSA的激发波长为激发波长时,随着BSA的浓度的增加BSA
荧光强度增加的趋势。图4　在不同浓度的BSA存在下3.0×10-5mol?L-1四环素的荧光猝灭光谱a――0.1;b――0.2;c――0.4;d――0.6;e――0.8g?L-1
。图5　BSAStern-Volmer曲线1――19℃;2――29℃;3――39℃。3.5　温度的影响荧光猝灭是溶液中猝灭体分子和荧光物质分子之间相互作用,致使荧光物质的荧光量子效率降低或激发态寿命缩短,从而导致荧光降低的现象。荧光猝灭可由动态猝灭或静态猝灭所引起。一般情况下,动态和静态猝灭可依据不同温度条件下的结果加以区别,对于动态猝灭,温度的升高将增加有效碰撞的离子数和加剧电子转移过程,使荧光物种的猝灭常数随着温度的升高而增大;若是静态猝灭,则温度的升高将降低复合物的稳定性使猝灭常数减小。因此温度对荧光猝灭的影响是判断体系是否静态猝灭的重要依据。将含有0.08g?LBSA和不同浓度的四环素的溶液在19℃、29℃、39℃情况下,测定体系的荧光随四环素浓度的变化情况。根据Stern-Volmer方程[6]F0/F=1+Kq??0[Q]=1+Ksv[Q]式以荧光强度猝灭比值F0/F对猝灭剂TC的量[Q]做图,如图5所示。从,4.4,44.4,-1第6期玄光善等:荧光光谱法研究四环素和牛血清蛋白的荧光猝灭和增敏作用1321荧光猝灭是静态猝灭机制。按多结合点位理论推导的式lg[(F0-F)/F]=lgK+nlg[Q]对19、29、39℃下测定结果做图并计算出每个BSA的结合点数分别为0.0,0.898,结合常数K值分别为7...78×103(L?mol-1)。说明每一个BSA分子几乎与一个四环素分子结合形成络合物。3.6　热力学常数的测定四环素和BSA之间的相互作用包括氢键、范德华力、静电力、疏水性相互作用。如果热力学参数焓变(??H)随温度的变化而变化的比较少,可按Van??t00Hoff式lnk=-+计算焓变(??HO)和熵变RTR0(??S)。在这里k是温度T下的Stern-Volmer猝灭常数、R是气体常数。以lnk-1/T作图(图6所示),并利用斜率和截距对19、29,39℃下得到的结果进行O0-1计算得??H、??S分别为-6.90KJ?mol,66.14-100O图6　lnk对1/T曲线J?(mol?K)。根据判断规则,??H≈0,??S&0,两者之间的作用力为静电力,Ross等[7]人为很多情况下??H0&0,??S0&0,因此认为四环素和BSA之间的作用力主要是静电引力。自由能变(??G)可以从公式??G=??H-T??S得到,并利用上述的结果计算在19℃,29℃和39℃的??G分别为-26.21KJ,-26.87KJ和-27.53KJ,并与参考文献[3,4]一致。3.7　四环素对BSA构象的影响BSA的荧光主要来源于BSA结构中的色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)。为研究TC在不同浓度下对色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)残基微环境以及BSA构象的影响,分别测定了????=15nm和????=60nm时的蛋白质的同步荧光光谱。????=15nm时只显示酪氨酸残基的光谱特性,而由????=60nm时仅表现色氨酸残基的光谱特性。图7表示在????=15nm(A)和????=60nm(B)测定条件下0.8-1g?LBSA在不同浓度的四环素溶液中荧光光谱的同步扫描。由两个同步扫描图可看出,随着TC浓度的增加BSA荧光强度下降,当????=15nm时荧光峰位置有变化红移了1nm,而????=60nm时荧光峰位置几乎不变并且荧光强度下降的幅度较大。表明四环素的加入几乎不引起BSA的构象变
化。00000图7　0.8g?L-1BSA的同步扫描荧光光谱图A――????=15B――????=60nm,TC浓度分别为a――6.0×10-6;b――1.2×10-5;c――2.4×10-5;d――3.6×10-5;e――4.8×10-5;f――6.0×10-5mol?L-1。1322光谱实验室第23卷参考文献[1]潘祖亭,余军平.荧光光谱法研究克仑特罗与蛋白质的结合作用[J].分析试验室,):41.[2]曹瑛,何锡文.药物分子设计和核酸的分子识别分析[J].分析科学学报,):244―252.[3]陈振华,黄祖云,尹权等.荧光光谱法研究四环素族化合物与蛋白质的相互作用[J].武汉大学学报,):413―418.[4]BiSY,SongDQ,TianYetal.MolecularSpectroscopicStudyontheInteractionofTetracyclineswithSerumAlbumins[J].Spec-trochimicaActaPartA.,):629―636.[5]玄光善,吴效楠,李玉平.荧光光谱法研究乙酰水杨酸与牛血清蛋白的相互作用[J].光谱实验室,):861―864.[6]HuYJ,LiuY,WangJBetal.StudyoftheInteractionbetweenMonoammoniumGlycyrrhizinateandBovineSerumAlbumin[J].J.Pharm.Biomed.Anal.,):915―919.[7]RossPD,SubramanianS.ThermodynamicsofProteinAssociationReactions:ForcesContributingtoStability[J].Biochem.,1981,20(11):.TheFluorescenceQuenchingandSensitizingInteractionbetweenTetracyclineandBovineSerumAlbuminbyFluorescenceSpectroscopyXUANGuang-Shan　SHUNHong-Mei　WUXiao-Nan　WANGHong-Tao　YANGLing(DepartmentofPharmacy,QingdaoUniversityScience&Technology,Qingdao,Shandong266042,P.R.China)Abstract　Theinteractionbetweenbovineserumalbumin(BSA)andtetracycline(TC)wasstud-iedbyfluorescencespectroscopictechnique.Theequilibriumconstantis7.61×103L?mol-1,andthenumberofbindingsitesis0.88.Thequenchingmechanismofthecombinationofbovineserumalbu-minwithTCisastaticquenchingprocedure.ThefluorescenceofTCwassensitizedbyBSA,andwiththeincreaseofBSAconcentration,theintrinsicfluorescenceintensityofTCincreases.TheBSAcon-formationandbindingsitewerealsodiscussedbysynchronousfluorescencespectra.Keywords　Tetracycline,BovineSerumAlbumin,Fluorescence,Interaction.
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请问BSA多大浓度一下可避免自身荧光猝灭
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或者换个问法，BSA的浓度选择依据是什么？有的文献是10的-5次幂，mol/L，有的是10的-6次幂，是不是跟它有自身荧光猝灭有关呢？
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引用回帖:: Originally posted by
或者换个问法，BSA的浓度选择依据是什么？有的文献是10的-5次幂，mol/L，有的是10的-6次幂，是不是跟它有自身荧光猝灭有关呢？ 对呀，不同的荧光仪检测的灵敏度也不一样，所以你应该先配个10-6 mol/L 的浓度试试，BSA是牛血清白蛋白，需要低温保存。
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