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自由电子激光(XFEL)技术揭示细胞信号传导通路
中科院上海药物所研究员徐华强带领国际团队,利用世界上最强X射线激光,成功解析视紫红质与阻遏蛋白复合物的晶体结构,攻克了细胞信号传导领域的重大科学难题。日,这项突破性成果以长文形式在线发表于(纸质本,7月30日,523卷561页开始)。
2012年,诺贝尔化学奖颁给美国科学家罗伯特·莱夫科维茨和布莱恩·科比尔卡,以表彰他们在G—蛋白偶联受体(GPCR)信号转导领域作出的重要贡献。他们的研究成果揭开了人体信息交流系统的秘密,即身体如何感知外部世界,并将信息通过下游G-蛋白发送到细胞内,具有划时代意义。然而,GPCR信号转导领域还有一个重大问题悬而未决,即GPCR如何激活另一条信号通路——“阻遏蛋白”信号通路。
G—蛋白和阻遏蛋白构成了GPCR下游的两条主要信号通路。“在调节GPCR功能过程中,阻遏蛋白和G—蛋白分别扮演阴和阳的角色。”徐华强介绍说,即GPCR能激活G—蛋白的信号通路,而阻遏蛋白会识别被激活的GPCR并使其内吞到细胞内脱敏,进而阻止G—蛋白向下游传递信号。近年来的研究表明,阻遏蛋白还能够作为独立的信号转导蛋白,广泛参与多种细胞生理活动,调节与G—蛋白通路不同的生理功能,比如人体感官功能和神经活动。
对于GPCR这一类膜蛋白来说,要得到晶体已经非常困难,而获得GPCR与阻遏蛋白复合物的晶体则“难上加难”。在过去的十年间,徐华强所领导的团队一直致力于解析视紫红质和阻遏蛋白复合物的晶体结构。视紫红质是一个经典的GPCR,可以感应到光信号,激活视觉功能。
最大的挑战来自获得的复合物晶体形态较小,未能达到同步辐射光源所适合的尺寸,很难获得高分辨率的图像。在交叉团队的紧密配合下,研究团队创新性地利用了比传统同步辐射光源强万亿倍的世界上最亮的X射线—自由电子激光(XFEL)技术,用较小的晶体得到了高分辨率的视紫红质—阻遏蛋白复合物晶体结构。
该三维结构展现了阻遏蛋白与GPCR的结合模式,与G—蛋白与GPCR相互作用截然不同。这为深入理解GPCR下游信号转导通路奠定了重要基础。该结构也是运用XFEL技术获得的首个蛋白质复合物结构,展示了XFEL技术在结构生物学领域的强大应用前景,将对蛋白晶体结构生物学领域的研究带来颠覆性变革。
该研究不仅解决了世界级的科学难题,同时为开发选择性更高的药物奠定了坚实的理论基础。徐华强解释说:“GPCR是目前最成功的药物靶标,迄今40%左右的上市药物是以GPCR为靶点。在药物发现领域,对靶蛋白结构与功能关系的理解认识越深刻,开发出高效低毒药物的几率越大。”因此,选择性靶向其中一条信号通路的药物,也就是激活或抑制G—蛋白或阻遏蛋白信号通路,可能具有更好的疗效并有效降低毒副作用。
“徐华强团队的研究成果对理解GPCR功能具有重大意义。”来自托马斯杰弗逊大学的GPCR领域专家Jeffrey
Benovic博士认为,“视紫红质和阻遏蛋白复合物的晶体结构有助于人们理解GPCR的脱敏过程,并为未来解析更多的GPCR复合物提供了新思路。”
该项目由徐华强和美国温安洛研究所Karsten
Melcher合作主导完成,项目合作者来自全球28个实验室。包括中科院上海药物所蒋华良与赵英明、上海科技大学Ray
Stevens、美国南加州大学Vadim
Cherozov以及其他60余名科学家分别来自于斯坦福大学同步辐射光源结构基因组学联合中心,SLAC国家加速器实验室,亚利桑那州立大学,南加州大学,加州大学洛杉矶分校,德国Desy自由电子激光科学中心,新加坡大学,纽约XFEL结构生物学中心,斯克利普斯研究所,加拿大多伦多大学,范德堡大学,NSF科学技术中心威斯康辛大学密尔沃基分校,瑞士保罗谢尔研究所,爱尔兰都柏林圣三一学院,芝加哥大学,德国康斯坦茨大学和德国汉堡超速成像中心等。
X射线激光器
在美国加州帕洛阿尔托之上的丘陵中,物理学家们为世界上最快的电子建造了一个“极端超越障碍训练场”。首先,他们将粒子在一个长约3公里的真空管道内加速到接近光速,然后,让这些电子猛然撞击一段磁铁,这会导致这些电子发生强烈的扭曲,最终爆发出强烈的X射线暴,强度之大足以穿透钢板。
XFEL:一项具有颠覆性的技术
不过,在SLAC国家加速器实验室进行这项研究的科学家们对武器并不感兴趣,他们操作的这台机器是全球功能最强大的X射线自由电子激光器(XFEL)之一,它也是一种研究物质结构的工具。
结构生物学家们尤其能从XFEL那儿获益良多,SLAC的激光器发出的X射线脉冲短到足以捕获分子运动类似闪光灯的图像;这些脉冲也稠密到足以为生物分子集群成像—采用传统方法无法做到这一点。因此,XFEL让生物学家们拥有了新的方法,能筛查出潜在的药物标靶;探测光合作用分子的机制等。
“毫无疑问,XFEL是一项具有颠覆性的技术,它彻底改变了人们做研究的方式。”SLAC机器科学顾问委员会委员、芝加哥大学的结晶学家凯斯·莫法特说。
但XFEL也备受争议,尤其是SLAC这台名为“直线加速器连贯光源(LCLS)”机器,更是纷争不断。LCLS是全球首台也是最大的XFEL。2002年,尽管诸多科学家频频质疑,但美国能源部仍对这一项目开了绿灯。当时,很多人怀疑:即使假设这个还未经证实的技术真能工作,其未来提供的科学回报值得投入4.14亿美元吗?
莫法特表示,自从2009年,LCLS开始工作,这些担心就慢慢偃旗息鼓了。莫法特说:“这项研究起作用了,就像我们所说的那样,按期工作,而且费用也在预算内。”
目前,美国能源部正计划建造一台升级版的“LCLS二代”,该设备计划于到2018年投入使用,其能同时进行的实验数量将为现在的3倍。另外,去年11月,美国国家科学基金会承诺,将在接下来的5年内,投资2500万美元,用于资助采用X射线自由电子激光器的生物研究中心(BioXFEL),这一研究中心位于纽约布法罗大学,主要宗旨是推动X射线结晶学在多项前沿领域处于领先地位:从改进纳米晶体的准备工作到实时观察蛋白质同其他化合物之间的相互作用等。
在接下来的几年内,全球在XFEL上的投入将达到数十亿美元。但这些机器要想发挥最大的潜能,还有很多技术障碍需要克服,包括提升其能量和发射出的光束的亮度以及如何处理它们产生的海量数据等。
“LCLS二代”和源源不断涌现的新机器
“LCLS二代”和源源不断涌现出来的其他新机器会给研究人员提供很多机会。例如,自从2011年开始,位于日本的、全球最短波长的XFEL研究设备—SACLA就已开足马力。利用专门建造的紧凑型加速器,SACLA发射出的光束的亮度和能级为LCLS的6倍。欧洲多家研究机构希望能于2015年携手完成总投入高达16亿美元的欧洲版XFEL,目前这台设备正在德国汉堡紧锣密鼓地建造,其亮度与SACLA相当,但能级更高。
亚利桑那州立大学的生物化学家佩特拉·弗洛姆对于欧洲设备的脉冲率非常兴奋。LCLS每秒钟能够发射出120个脉冲,这听起来很多,但纳米晶体喷射器每秒钟会喷射出1万个液滴,而欧洲XFEL每秒将产生2.7万个脉冲,这将不仅使科学家们能避免浪费99%昂贵且很难制造的纳米晶体,也使这台机器能让更多人使用。弗洛姆说:“借用这台设备,在5到10秒钟而非5到10小时内,你就可以得到数百万个衍射图案。”
但弗洛姆也表示,脉冲速度的增加只会在系统能捕获和处理海量数据时才发生。目前探测器最高的速度约为每秒钟发射3000个衍射图案,这一速度亟须提高,计算机的性能也需要提高。他说:“目前,在单个实验内,一次实验就会生成100TB(1TB=1012)字节的数据。我们必须找到方法来精简数据,否则,如此多数据我们实在难以招架。”
结晶学的未来:为运动中的分子成像
最终,研究人员希望能够捕获单个分子的衍射图案,这样一来,他们就能观察分子在完全自然的环境下(比如被水包围而非被捕获在晶体内的人造环境中)的运动和它们之间的交互作用。弗洛姆表示:“那是结晶学的未来。不是像法医那样为死去的分子拍照,而是在分子运动时,为分子成像。”
要做到这一点很困难,因为被隔离开来的单个分子并没有同样的“双胞胎姊妹”来帮助它散射过来的光子,这是晶体内会发生的情况。唯一的补偿办法是用更多光子来照射它从而制造出更强烈的散射图案,光子的亮度需要达到LCLS的1000到1万倍。弗洛姆说,欧洲XFEL发射出的光子的亮度可能会再强10倍,升级后的LCLS的亮度也会增加1000倍。弗洛姆认为,这一目标指日可待。“我们十年之内就可以做到这一点。”
X射线自由电子激光(X-ray Free Electron
Laser,XFEL)又被称为第四代同步辐射光源,其产生的X射线在亮度大幅度提升、脉冲时间显著缩短的同时,还具有相干性,是像激光一样的相干光。
由于XFEL具备的上述特点,令其在众多科学领域有着不可估量的应用前景。XFEL能够让结构生物学研究带来颠覆性的变革。然而,目前国际上在XFEL的研究方面尚处于起步阶段。目前(2013年)国际上仅有位于美国斯坦福直线加速器中心的&“直线加速器相干光源”已经建成并投入试运行。日本、德国、瑞士等国也在开展XFEL研究计划,其中又以我们的近邻日本最为领先。2006年,日本政府把“XFEL计划”指定为“具有国家级重要性的关键技术”之一,并着手开始研发。
在我国,XFEL设施的建设也在筹划之中,将由上海同步辐射光源负责实施。目前国际上已建成和在建的XFEL设施都在征集各学科领域的研究计划。相比,我国在这方面的研究工作已经落在了后面。
2012年6月,欧洲X射线自由电子激光装置(XFEL)建设工程取得了阶段性进展,全长近5.8公里的网络隧道建设工作顺利完成。欧洲XFEL公司为此举行了庆祝仪式,来自项目国际合作伙伴、德国联邦政府和学术界代表共400多人参加了此次活动。&&&&
XFEL项目隧道网络建设工作于2010年启动,按计划共分为11个部分,其中加速器地下隧道部分长约2.1公里,外部隧道长约3.4公里。在此之后,项目隧道施工将进入基础设备和安全装置安装阶段,具体包括超导电子直线加速器、光子隧道、波荡线和实验大厅等。2015年底,欧洲XFEL将正式投入运行。&&&&
欧洲X射线自由电子激光装置(XFEL)建成运行后可产生近似激光但波长不到十分之一纳米的X射线闪光,其亮度比现有第三代光源高9个数量级,将有力促进在原子尺度开展有机/无机材料内部分析、化学反应过程拍摄、纳米三维图像制作、星球内部过程研究等领域研究工作。
为我国学者深入交流XFEL在结构生物学中的应用成果,使相关领域专家学者对XFEL在结构生物学研究中的作用有更深入的了解,凝聚共识,提出相应科学问题的解决方案,加深对XFEL在结构生物学上应用的认识,探索发展XFEL在结构生物学领域的新应用,以战略的眼光来预估将来的发展趋势,制定预期目标,为今后学科发展奠定基础,香山科学会议定于~28日在南昌召开以“X射线自由电子激光在结构生物学中应用的突破性进展”为主题的学术讨论会,会议将邀请多学科跨领域的专家学者与会,围绕(1)我国发展生物大分子自由电子激光设施的必要性与紧迫性;(2)基于自由电子激光设施的新技术、新方法和(3)应用自由电子激光进行生物大分子结构研究的新进展等中心议题进入深入讨论。
中国工程物理研究院应用电子学研究所2013年8月介绍了一台紧凑型自由电子激光太赫兹源的研制工作,该装置主要的设计指标为波长100μm,宏脉冲长度为4μs,宏脉冲内功率为1kW。装置中使用热阴极微波电子枪作为注入器,为了降低电子反轰、获得高亮度电子束,该所研制了一台新型S波段多腔热阴极RF-gun注入器,该注入器由两路独立的微波输入系统为注入器提供微波功率。
装置中使用的摇摆器有44个周期,材料为NdFeB-FeCoV,峰值磁场为4800高斯,间隙为14mm,好场区为6mm。目前已经完成了电子束调试,进行了束流参数测试,注入器输出电子束能量为1.5MeV,发射度小于10pmm·mrad,能散度小于1%。主加速段后电子束能量为7MeV。通过改变电子束能量获得了波长分别为125μm、108μm、94μm的自发辐射。目前正在开展受激辐射实验。
  自由电子激光,是一种以相对论高品质电子束作为工作介质,在周期磁场中,以受激发射方式放大电磁辐射的新型激光光源。是二十一世纪诞生的最新一代的先进光源,是激光物理与等离子物理中的一个重要研究领域。由于同时具有极高的峰值亮度(高于第三代同步辐射光源8-10个数量级)、超短的脉冲(飞秒到阿秒)和极好的相干性等优越特性,已经被科学界视为最新一代的光子科学综合实验装置,在物理、化学、生物、医学、能源、环境等等领域具有重大的应用价值。
迄今为止,已有一批世界著名科学家利用软X射线到硬X射线的自由电子激光用户装置做出重要的实验结果。目前,X射线激光研究多采用毛细管放电、高功率激光的多脉冲和短脉冲等抽运方式,而且绝大多数研究局限于软X射线波段。
  出于对中国发展自由电子激光的极大关注,杨振宁先生早前参加“X射线自由电子激光的最新进展”报告时指出,XFEL将在21世纪前期取得重大突破性发展,此项技术目前还在发展的初始阶段,正是中国参与的上好机会。他相信中国人的聪明才智,相信党和政府的杰出组织能力,只要给予足够重视,定能在该领域进入世界先进行列。杨振宁先生从1997年5月开始还先后8次给我国有关部门和有关领导写信,呼吁中国尽快开展XFEL的预研究。为此,国家科学技术中长期发展计划相关研究报告已明确建议“立即制订并分阶段实施从深紫外起步以X射线为最终目标的自由电子激光系统总体发展计划”。
  目前对X射线自由电子激光装置的科学需求十分强烈,对于建设高亮度多用户的新装置存在普遍的呼声和期待。除已经建成的美国、欧洲和日本的大型自由电子激光装置以外,意大利、美国、韩国和瑞士等国家也在建设软X射线到硬X射线的新用户装置。
  中国科学院副院长江绵恒表示,自由电子激光光源已在国际上加速发展起来,美国SLAC的X射线自由电子激光已经出光,德国、日本、韩国等也均已起步,并已被提到战略高度予以部署和实施,我国也应该加快发展自由电子激光光源。希望在预研后,再向国家申请建设硬X射线的用户装置,就可以将我国与先进国家在光子科学领域的发展差距缩短到10—15年。
2014年末,《Nature Methods》杂志将年度技术授予了激光层照荧光显微技术(Light-sheet
fluorescence
microscopy)。同时,杂志也介绍了2015年值得关注的技术,包括非编码RNA、新一代CRISPR、DIA质谱以及微小晶体的结构等。
大家都知道,通过X射线衍射确定原子结构时,首先你得有大的、结构良好的蛋白质晶体。这说来容易做来难。许多蛋白质,尤其是膜蛋白,无法形成大的晶体,往往形成纳米或微米大小的晶体。在几年前,这种微小的晶体基本上被认为是没用的,因为在衍射数据记录之前它们就会受损。不过,新的技术如今也能从这些晶体上获得高质量的数据。
一种方法是飞秒X射线晶体学(femtosecond X-ray
crystallography),其中微小的晶体涌入飞秒脉冲的路径,这些脉冲来自极其明亮的X射线自由电子激光装置(XFEL)。X射线的脉冲非常快,因此在晶体被破坏之前就能收集衍射图像。自2011年引入这项技术之后,它经过快速发展,并不断扩大应用范围。
2014年,这项技术带来了新的结构和见解,并不断改进将微小晶体引入XFEL光路以及数据分析的方法。去年,亚洲地区唯一拥有XFEL的研究机构——日本理化学研究所发表了一些生物学成果。而在未来几年,德国和瑞士XFEL设施的建设也有望完成。
然而,另一种更新的技术可能让这些极其昂贵的XFEL的日子不太好过。MicroED方法于2013年底在eLife上发表,利用电子衍射来确定微小晶体的蛋白质结构。尽管电子晶体学已存在很多年,但技术上的挑战阻碍了它的广泛应用。《Nature
Methods》在2015年发表了MicroED的通用版本。它让微小晶体暴露在极低的电子剂量下,同时连续旋转,从而产生更准确的数据。
&&& 编辑Allison
Doerr认为,X射线和电子衍射这两种方法的进一步发展有可能对结构生物学产生持久的影响。
正如清华大学颜宁教授所言:“我们正处在结构生物学最好也是最坏的时代。我们结晶分子并用X射线的衍射图谱来揭示它们的结构,而技术进步使冷冻电镜(cryo-EM)经历了一场革命。以往用结晶技术可能需要十年才能完成的困难项目,cryo-EM只需要半年就能解决。”
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光纤通信是利用激光从光导纤维的一端射入,在内壁上多次
______从另一端射出来传递信息的.我们使用的手机是利用
______来传递信息的.
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光纤通信是利用激光从光纤的一端射入,在内壁上多次反射后在另一端放射出来,然后在接收端,检测器收到光信号后把它变换成电信号,经解调后恢复原信息;手机是利用电磁波传递信息的;故答案为:反射,电磁波.
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wtp=tt" target="_blank">http://baike.baidu.com/view/1192388,运行在1.3um波长的光纤衰减为4dB&#47,与之配套的光纤连接器也很重要,要求每个连接器的连接损耗低于25dB。使整个线路系统的光功率得到提高.com/view/1192388.html.baidu://baike。芯子直径为100um,包层直径为140um 的光纤.85um波长系统贵源。另外,而PIN检波器只需用5V电源。如果要达到更远距离和更高速率,一般光纤能够支持的  接头数比双绞线或同轴电缆多得多。目前低价可靠的发送器为0,易于安装,价格较低。  来自百度<a href="http、衰减少,可提供相当好的性能,是一种新的数据传输系统.5~2KM范围内的局域网。  激光二极管的发送器成本较高,且不能满足百万小时寿命的要求。光  的总线拓扑结构的实验性多点系统已经建成,但是价格还太贵。原则上,由  光纤功率损失小;Km。0.8um的光纤频宽为150MHz/Km。对光载波的调制为移幅键控法,所以它所需的支持电路可在低速率下运行。WDM的光纤链路适合于字节宽度的设备接口,可起中继放大作用,提高光功率。前置放大──在接收端的光电检测器之后将微信号进行放大。在线中继放大──建筑群较大或楼间距离较远时。  目前采用一种光波波分复用技术WDM(WAVELENGTH DIVISION MULTI-PLEXING),可以在一条线路上复用、发送、传输多个位,一般按一个字节八位并行传输,对每个位流使用不同的波长,又称亮度调制(IntensityModulation);Km。  综合布线系统中,主干线使用光纤做为传输介质是十分合适的,而且是必要的.3um的光纤频宽为500MHz&#47,以光的出现和消失来表示两个二进制数字。发光二极管LED和注入型激光二极管ILD的信号都可以用这种方法调制,PIN和ILD检波器直接响应亮度调制.5&#47,1,以提高入纤的光功率.8um波长的光纤衰减为6dB/Km。运行在0.85um波长的发光二极管检波器PIN也是低价的接收器;125um光纤的多4dB,比50/125um光纤多8.5dB。运行在0.85um波长  发光二极管LED,能支持100Mbps的传输率和1。其接收的光能比62。光纤的芯子和孔径愈大,从发光二极管LED接收的光愈多,其性能就愈好。  功率放大──将光放大器置于光发送端之前,这种系统衰减很小,但要比0,则可用1.3um波长的系统。雪崩光二极管  的信号增益比PIN大,但要用20~50V的电源,有较大的带宽潜力,因此,以提高接收能力。  编辑本段  光纤传输特性  光缆不易分支,因为传输的是光信号,所以一般用于点到点的连接。典型的做法是在给定的频率下,在另一端则有PIN或APD光电二极管作为检波器接收信号  光纤传输过程  由发光二极管LED或注入型激光二极管ILD发出光信号沿光媒体传播
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我科学家攻克生物学世界级重大难题,有助于开发更高效靶向药物——
世界最强激光解析细胞信号传导大通路
本报记者 佘惠敏
视紫红质和阻遏蛋白复合物的三维结构。(资料图片)
中国科学院上海药物研究所徐华强研究员领衔国际28个实验室组成的交叉团队,经过联合攻关,利用世界上最强X射线激光,成功解析视紫红质(Rhodopsin)与阻遏蛋白(Arrestin)复合物的晶体结构,攻克了细胞信号传导领域的重大科学难题。该项突破性成果7月22日以长文形式在线发表于国际顶级学术期刊《自然》(Nature)上。 2012年,诺贝尔化学奖颁给美国科学家罗伯特·莱夫科维茨和布莱恩·科比尔卡,以表彰他们在G-蛋白偶联受体(GPCR)信号转导领域作出的重要贡献。他们的研究成果揭开了人体信息交流系统的秘密,即身体如何感知外部世界,并将信息通过下游G-蛋白发送到细胞,具有划时代意义。然而,GPCR信号转导领域还有一个重大问题悬而未决,即GPCR如何激活另一条信号通路——阻遏蛋白(Arrestin)信号通路,该难题一直困扰着世界结构生物学家。 G-蛋白和阻遏蛋白构成了GPCR下游的两条主要信号通路。“在调节GPCR功能过程中,阻遏蛋白和G-蛋白分别扮演阴和阳的角色。”徐华强研究员介绍说,即GPCR能激活G-蛋白的信号通路,而阻遏蛋白会识别被激活的GPCR并使其内吞到细胞内脱敏,进而阻止G-蛋白向下游传递信号。近年来的研究表明,阻遏蛋白还能够作为独立的信号转导蛋白,广泛参与多种细胞生理活动,调节与G-蛋白通路不同的生理功能,比如,人体感官功能和神经活动等。 对于GPCR这一类膜蛋白来说,要得到晶体已经非常困难,而获得GPCR与阻遏蛋白复合物的晶体则“难上加难”。在过去的十年间,徐华强研究员所领导的团队一直致力于解析视紫红质(Rhodopsin)和阻遏蛋白复合物的晶体结构。视紫红质是一个经典的GPCR,可以感应到光信号,激活视觉功能。 最大的挑战来自获得的复合物晶体形态较小,未能达到同步辐射光源所适合的尺寸,很难获得高分辨率的图像。在交叉团队的紧密配合下,研究团队创新性地利用了比传统同步辐射光源强万亿倍的世界上最亮的X射线——自由电子激光技术,用较小的晶体得到了高分辨率的视紫红质-阻遏蛋白复合物晶体结构。该三维结构展现了阻遏蛋白与GPCR的结合模式,与G-蛋白与GPCR相互作用截然不同,为深入理解GPCR下游信号转导通路奠定了重要基础。该结构也是运用XFEL技术获得的首个蛋白质复合物结构,展示了XFEL技术在结构生物学领域的强大应用前景,将对蛋白晶体结构生物学领域的研究带来颠覆性变革。 这一研究不仅解决了世界级的科学难题,同时为开发选择性更高的药物奠定了坚实的理论基础。徐华强解释说:“GPCR是目前最成功的药物靶标,迄今40%左右的上市药物是以GPCR为靶点。在药物发现领域,对靶蛋白结构与功能关系的理解认识越深刻,开发出高效低毒药物的几率越大。”因此,选择性靶向其中一条信号通路的药物,也就是激活或抑制G-蛋白或阻遏蛋白信号通路,可能具有更好的疗效并有效降低毒副作用。 “这个研究项目面临了艰巨的挑战,最终在全世界众多研究机构的多领域专家的合作下完成。”徐华强研究员说,“X射线自由电子激光技术为未来解决更具挑战性的蛋白质科学难题开启了新思路。” “徐华强研究员团队的研究成果对理解GPCR功能具有重大意义。”来自托马斯杰弗逊大学的GPCR领域专家杰弗里·贝诺维奇博士认为,“视紫红质和阻遏蛋白复合物的晶体结构有助于人们理解GPCR的脱敏过程,并为未来解析更多的GPCR复合物提供了新思路”。

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