第二十八章&&食品功能性成分的测定
第二十八章& 食品功能性成分的测定
低聚糖的测定方法
大豆异黄酮的测定方法
3.& 总皂苷的测定方法
4.& 褪黑素的测定方法
5.& 肉碱的测定方法
6.& 免疫球蛋白IgG的测定方法
EPA和DHA的测定方法
8.& 超氧化物歧化酶的测定方法
9.& 总谷胱甘肽（GSH）含量的测定方法
10.大蒜辣素含量的测定方法
11.核苷酸含量的测定方法
12.糖精含量的测定方法
13.牛磺酸含量的测定方法
14.甘草苷含量的测定方法
15.膳食纤维含量的测定方法
16.枸杞子多糖含量的测定方法
17.香菇多糖的测定方法
18.磷脂含量的测定方法
19.花生四烯酸含量的测定方法
20.β-胡萝卜素含量的测定方法
21.维生素E和胡萝卡素含量的测定方法
22.微量硒含量的测定方法
23.有机锗含量的测定方法
24.茶多酚含量的测定方法
25.儿茶素含量的测定方法
低聚糖——低聚果糖和异麦芽低聚糖
的测定方法(高效液相色谱法)
本方法适用功能性食品中低聚糖的检测。
一、方法提要
低聚糖各组分用高效液相色谱法分离并定量测定，以乙腈、水作流动相在碳水化合物分析柱上糖的分离顺序是先单糖后双糖，先低聚后多聚，以示差折射检测器检测。&&&
低聚糖的检测有外标法和内标法，但由于功能性食品一般只需报告低聚糖的总量，故可用厂家提供的基料作对照样，在相同的分离条件下以面积比值法求出样品中低聚糖含量。
1.高效液相色谱仪：Waters HPLC，510泵，410示差折射检测器，数据处理装置。
2.超声波振荡器。
3.微孔过滤器(滤膜0.45μm)。
1.乙腈(色谱纯)。
2.水（三蒸水并经Milli-Q超纯处理）。
3.低聚糖对照品：低聚糖难得纯品，故可用厂家提供的基料。
为对照品。&&&
低聚果糖（Fructooligosaccharide）：国产：一般含蔗果三糖（GF2）、蔗果四糖（GF3）、蔗果五糖（GF4）。
液状基料：含量约＞35%。
固状基料：含量约＞50%。
进口：从蔗果三糖（GF2）至蔗果七糖（GF6）有液状、固状，30%～96%多种规格。异麦芽低聚糖：有液状、固状，一般含量＞50%。
4.对照样品溶液
根据保健食品所强化的品种，准确称取低聚果糖或异麦芽低聚糖基料分别于100mL的容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，配成低聚果糖约5～10mg/mL或异麦芽低聚糖约5～10mg/mL的对照样品溶液。
四、测定步骤
&& 1.样品处理
（1）&&&&&&
胶囊、片剂、颗粒、冲剂、粉剂（不含蛋白质）的样品
用精度0.000lg的分析天平准确称取已均匀的样品(由于低聚糖原料含量不一，样品中的强化量也不同，所以样品的称量应控制在使低聚糖最终的进样浓度约5～10mg/mL为宜)，于100mL容量瓶中，加水约80mL于超声波振荡器中振荡提取30min，加水至刻度，摇匀，用0.45μm滤膜过滤后直接这样测定。
（2）&&&&&&
奶制品（含蛋白质）的样品
准确吸取50mL于小烧杯中，加25mL无水乙醇，加热使蛋白质沉淀，过滤，滤液经浓缩并用水定容至25mL刻度。
（3）&&&&&&
饮料或口服液样品
准确吸取一定量的样品，加水稀释，定容至一定体积使低聚糖的最终进样浓度约5～10mg/mL。
（4）&&&&&&
果冻或布丁类样品
果冻类样品先均匀搅碎，称量，加适量水并加热至60℃左右助溶．并于超声波振荡器中振荡提取，然后用水稀释至一定体积。
& 布丁类样品可按奶制品处理。
2.色谱分离条件
色 谱 柱：Waters碳水化合物分析柱3.9mm&300mm。
温：35℃。
流 动 相：乙腈+水（75+25）。
速：1～2mL/min。
检测器灵敏度：16X。
进 样 量：10～25μL。
3.样品测定
取样品处理液和对照品溶液各10～25μL注入高效液相色谱仪进行分离。以对照品峰的保留时间定性，以其峰面积计算出样液中被测物质的含量。
& 低聚糖的分离顺序为：
低聚果糖：果糖+葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖（GF2）……蔗果七糖（GF6）
异麦芽低聚糖：葡萄糖、麦芽糖、异麦芽糖、潘糖（pentose）、异麦芽
三糖、异麦芽四糖、异麦芽四糖以上。
五、结果计算
低聚糖占总糖的百分含量
因为各组分均为同系物，所以可用面积归一法计算低聚糖各组分总面积值及各组分占固形物（总糖）的百分含量。
低聚果糖占总糖%=
Sl——果糖+葡萄糖的峰面积；
S2——蔗糖的峰面积；
&S3+……S7——蔗果三糖（GF2）……蔗果七糖（GF6）的峰面积。
异麦芽低聚糖占总糖%=
Sl——葡萄糖的峰面积；
S2——麦芽糖的峰面积；
&S3+……S7——异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖、异麦芽四糖
&&&&&&&&&&
&&&以上的峰面积。
注：以上数值均可在积分仪中直接读出。
2.低聚糖在样品中的百分含量
&&&&&&&&&&&&&
S——样品中各低聚糖组分的峰面积总和；
&&S1——对照样品溶液中各低聚糖组分的峰面积总和；
m1——对照样品质量（g）；
&&&&c——对照样品中各低聚糖组分占固形物（总糖）实测的百分含
&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&
① 此项由结果计算5（1）求出。
&&&&&&&&&&&&
② 如对照样品为液体基料还应乘以固形物的含量：
V——样品定容体积（mL）；
&V1——对照样品定容体积（mL）；
m——样品质量（g）。
&&& 举例：
（1）样品（约含低聚果糖65%）称样量0.7760g溶于水中并定容至l00mL。
（2）对照样品：比利时进口低聚果糖GF2至GF6（企业标示量占总糖为＞92），准确称取0.5770g溶于水中并定容至l00mL。
（3）样品及对照样品进样量分别为25μL。
（4）用HPLC面积归一法验证对照样品低聚糖各组分面积值总和：418326；及各组分占固形物（总糖）的百分含量：93.99%。
（5）用HPLC面积归一法计算样品低聚糖各组分面积值总和：417532。。
（6）样品中低聚果糖的百分含量：
& 低聚果糖%=
1.低聚糖（Oligosaccharide）或称寡糖，是由3～10个单糖通过糖苷键连接形成直链或支链的低度聚合糖，现已广泛应用在饮料、奶类、果冻、谷类制品、婴幼儿食品等保健食品中。
2.低聚果糖或异麦芽低聚糖是由酶将蔗糖（或淀粉）水解为果糖与葡萄糖或麦芽糖与葡萄糖以国产低聚果糖为例其结构式G—F—Fn，（n=1～3），G—F为蔗糖（由G代表葡萄糖，F代表果糖构成），GF2即一分子葡萄糖和二分子果糖称蔗果三糖，GF4称蔗果五糖。
3.低聚糖难得纯品，因酶反应产物中除各种蔗果糖外，还残留下不少葡萄糖，果糖和蔗糖（或麦芽糖）；另经有关文献检索，低聚糖亦未见有准确的定量方法，其原因是低聚糖的分离其响应因子依赖于分子内部链的长短，故准确定量较难，本方法是根据自己的实践，采用强化在保健食品中的基料作对照样，而建立的新方法。&&&
4.两种低聚糖（低聚果糖、异麦芽低聚糖）共存于同一食品中，低聚糖各组分用以上的分离条件难以分开，表现为许多组分重叠，干扰了正常定量，但将两组色谱图叠加进行比较，异麦芽三糖为一独立峰，因而可以用其对异麦芽低聚糖进行定量分析。
把两组对照样色谱图中低聚糖各组分的峰面积相加，得出总的峰面积，再求出其中低聚果糖所占的百分比，求出一个校正因子（注意：一定要换算成相同的浓度单位）。从样品色谱图中把低聚糖各组分总的峰面积乘以其百分比就可求出低聚果糖的含量（但要注意样品中含其他糖如蔗糖的干扰）。
5.食品的化学构成比较复杂，某些功能性食品在生产工艺过程中会带来杂质和赋形剂及其中一些组分（如淀粉、麦片、豆粉）的变性而干扰本法的测定，故在样品处理中应尽量去除并参考6．（4）的定量方法；
6.本法也适用于其他低聚糖的测定。
第二节 大豆异黄酮的测定方法
一、大豆总异黄酮的测定方法（紫外分光光度法）
本方法适用于大豆以及大豆制品中大豆总异黄酮的测定（所测样品需要进行前处理）。
将金雀异黄素标准品及含有大豆制品的样品溶液在分光光度上扫描200～400nm吸收情况，结果发现，标准品及样品的最大吸收峰都在259nm，且最大吸收峰周围干扰较少。因此，选用金雀异黄素作为标准品，利用紫外分光光度法测定大豆总异黄酮的含量。
&&& 2. 仪器
紫外分光光度计。
&&& 3. 试剂
（1）金雀异黄素（C12H10O5）标准品（美国Sigma公司，含量为99.999%）。
（2）95%乙醇（C2H6O）（分析纯），天津化学试剂厂生产。
（3）双蒸馏水（H2O），自制。
（4）石油醚（沸程为60～90℃）（分析纯），上海化学试剂厂。
（5）环己烷（C6Hl2）（分析纯），上海试剂一厂。
（6）标准品溶液：准确称取金雀异黄素（geninstein）标准品5.2mg，置人50ml容量瓶中，以95%乙醇溶解，并定容至刻度，摇匀。
（1）样品处理：精密称取大豆总异黄酮纯化物10.4mg，置入50mL容量瓶中，以95%乙醇溶解，并定容至刻度，摇匀。（注：样品为经大孔吸附树脂吸附纯化并配合溶剂法提取制得的大豆总异黄酮提取纯化物，浅黄棕色粉末，味苦）。
（2）标准曲线的绘制：准确吸取0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4mL标准品溶液分别置于10mL容量瓶中，并各加95%乙醇1.0mL，再加蒸馏水稀释至刻度，摇匀。以lmL95%乙醇加水到l0mL作空白对照，在259nm处测得吸光度，以测得之吸光度与纯品量绘制标准曲线并得出回归方程见表28—1。
&&& 计算公式：
回归方程& y = ax +
b& 相关系数r = 0.9996
式中&& b——截距，0.2006；
d——斜率，7.8118。
&标准曲线与回归方程
（3）样品测定：分别准确吸取样品液0.3mL于3只10mL容量瓶中，以下按标准曲线制备项下操作，在259nm处测定吸收度，计算平均值，按标准曲线方程计算含量，并计算样品的大豆总异黄酮质量分数。结果见表28—2。
样品中的大豆总异黄酮含量&&&
平均吸光度/OD
含量/（μg/mL）
5. 精密度实验
准确吸取标准品溶液0.2mL，分别置5只10mL容量瓶中，按标准曲线项下操作，测定吸收度，计算相对标准差（RSD）为2.6%。
加样回收率实验
准确吸取0.1、0.2、0.2、0.2、0.1mL标准品溶液于5只l0mL容量瓶中，再分别准确加入样品液0.3mL，照标准曲线制备项下操作，计算加样回收率，结果见表28—3。
加样回收率实验
加标准品质量/μg
0.3mL样品中相当
金雀黄素的量/μg
测得相当金雀
黄素的含量/μg
平均回收率/%
7. 结果计算
样品中大豆总异黄酮的百分含量（以金雀异黄素计算）按稀释度和金雀异黄素标准曲线的相应量计算。
注释&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
若受试物为大豆的制品，如水豆腐、干豆腐、豆芽、豆豉等可采用食品粉碎机破碎后冷冻干燥，分别取干重为l0g的受试样品置于锥形瓶中，加入石油醚50mL，放置24h，过滤，残渣用滤纸筒包好，置于水浴上的索氏提取器中用甲醇提取6h，注意温度低于70℃。提取液回收甲醇，残渣上大孔吸附树脂柱，用水洗脱除去糖类成分，续以95%的乙醇洗脱，将乙醇洗脱液浓缩，干燥，以95%乙醇定容为25mL。豆浆、豆汁等液体大豆饮品可在60℃水浴上蒸干，取干重为10g的干燥物与干燥后的水豆腐等一样处理，得到不同的样品95%乙醇溶液。
二、大豆异黄酮的测定方法（高效液相色谱法）
本方法适用于大豆制品中大豆异黄酮的测定。
本方法大豆异黄酮染料木素的最低检出限为10ng；大豆苷元的最低检出限为30ng。
大豆异黄酮（soybean
isoflavones，简称ISO）是一类从大豆中分离提取的具有抗氧化、抗肿瘤、改善心血管功能的主要活性成分。目前发现的大豆异黄酮包括游离型苷元和结合型的糖苷两类共有12种，染料本素（Genistein，G）和大豆苷元（Daidzeiu，D）是其中两种重要化合物。本法用80%乙醇作为溶剂，提取样品中的染料木素、大豆苷元，以反相高效液相色谱分离，在紫外检测器260nm条件下检测其峰面积，以染料木素和大豆苷元两项含量之和计算大豆异黄酮含量。
&&& 2. 仪器
（1）LC高效液相色谱仪，C—RIB色谱处理机。
（2）检测器：SPD—2AS紫外检测器。
（3）离心机。
（4）超声波振荡器。
（1）甲醇（色谱纯）。
（2）乙醇（优级纯）。
（3）双重蒸馏水。
（4）大豆异黄酮标准品：染料木素与大豆苷元标准品（美国Sigma公司产品），以染料木素的大豆苷元两项之和作为大豆异黄酮含量计算。
（5）大豆异黄酮标准溶液：准确称取染料木素标准品5.0mg，大豆苷元标准品3.2mg，各自用流动相“甲醇+水（60+40）”定容至100mL，配制成50μg/mL的染料木素和32μg/mL的大豆苷元标准溶液。
4. 测定步骤
（1）样品处理：
固体样品：准确称取一定量固体粉末样品于100mL容量瓶中，定量加入80%乙醇，经超声振荡5min，加水补足至刻度，待提取液略澄清后经离心分离（3000r/min，5min），取上清液经0.45μm滤膜过滤后待进样。
b. 液体样品：准确吸取2.0mL液体样品，加入80%乙醇摇匀并定容100mL，澄清后同上述步骤。
（2）色谱分离条件：
色 谱 柱：Shim—Pack CLC—ODS，6mm& l50mm，5μm。
流 动 相：甲醇+水（60+40），临用前用超声波除气。
速：0～5min，为1.0mL/min；5～10min为1.6mL/min。
温：40℃。
检测波长：UV260nm。
敏度：0.016AUFS。
样量：l0μL。
（3）样品测定：准确称取样品处理液和标准液各l0μL（或相同体积）注入高效液相色谱仪进行分离，以其标准溶液峰的保留时间进行定性，利用峰面积求出样液中待测物质的含量。
5. 结果计算
X——样品中染料木素/大豆苷元的含量（μg/g）；
&S1——样品峰面积；
c ——标准溶液浓度（μg/mL）；
&S2——标准溶液峰面积；
V——样品定容体积（mL）；
m ——试样质量（g）。
样品中大豆异黄酮含量X（μg/g）=Xg+Xd(Xg、Xd分别为样品中染料木素及大豆苷元的含量)
（1）本法染料木素浓度在0.01～0.1mg/mL范围内呈直线关系，相关系数为0.9996；大豆苷元浓度在0.003～0.03mg/mL范围内呈直线关系，相关系数0.9945。
（2）精密度：同一样品依本法重复6次，染料木素、大豆苷元的相对标准差（RSD）分别为3.1%及1.2%。
（3）回收率：依本法各取试样9份，每3份为一组，分别加入不同量标准品进行试样处理，染料木素添加回收率为95.0%～103.7%、大豆苷元添加回收率为95.8%～105.5%。
第三节 总皂苷的测定方法（分光光度法）
本方法适用于功能性食品中总皂苷的测定。
本方法人参皂苷Re的最低检出量为2μg/mL。
一、方法提要
样品中总皂苷经提取、PT—大孔吸附树脂柱预分离后，在酸性条件下，香草醛与人参皂苷生成有色化合物，以人参皂苷Re为对照品，于560nm处比色测定。
二、仪器&&&
1.722分光光度计。
2.PT—大孔吸附树脂柱（河北省津杨滤材厂）。
3.超声波振荡器。
&&& 三、试剂
1.甲醇（分析纯）。
2.乙醇（分析纯）。
3.人参皂苷Re标准品（中国药品生物制品检定所）。
4.5％香草醛溶液：称取5g香草醛，加冰乙酸溶解并定容至l00mL。
5.高氯酸（分析纯）。
6.冰乙酸（分析纯）。
7.人参皂苷Re标准溶液：精确称取人参皂苷Re标准品20.0mg，用甲醇溶解并定容至10mL，即每1mL含人参皂苷Re2.0mg。
8.重蒸水。
四、测定步骤
1.样品处理：
（1）固体样品
称取1.0g左右样品于100mL烧杯中，加入20～40mL
85%乙醇，超声波振荡30min，再定容至50mL，摇匀，放置，吸取上清液1.0mL挥干后以水溶解残渣，进行柱分离。
（2）液体样品
含乙醇的酒类样品：准确吸取1.0mL样品放于蒸发皿中，蒸干，用水溶解残渣，用此液进行柱层析；非乙醇类液体样品：准确吸取1.0mL样品（如浓度高或颜色深，需稀释一定体积后再取1.0mL）直接进行柱分离。
以PT—大孔吸附树脂柱进行层析分离，准确吸取上述已处理好的样品溶液1.0mL上柱，用15mL水洗柱，以洗去糖分等水溶性杂质，弃去洗脱液，再用20mL85%乙醇洗脱总皂苷，收集洗脱液于蒸发皿中，于水浴上蒸干，以此作显色用。
在上述已挥干的蒸发皿中准确加入0.2mL
5％香草醛冰乙酸溶液，转动蒸发皿，使残渣溶解，再加0.8mL高氯酸，混匀后移入l0mL比色管中，塞紧盖子于60℃以下水浴上加温15min取出，冷却后准确加入冰乙酸5.0mL，摇匀后以1.0cm比色皿、于560nm处与人参皂苷Re标准管同时比色。
4标准曲线的绘制：
吸取人参皂苷Re标准溶液（2.0mg/mL）0、20、40、60、80、100μL（相当于人参皂苷Re0、40、80、120、160、200μg），于10mL比色管中，用氮气吹干，同4.（3）显色步骤测定吸光度。并绘制标准曲线。
人参总皂苷浓度为20～200μg/mL之间与吸光度值呈线性关系，相关系数（r）0.999。
五、结果计算
X——样品中总皂苷（以人参皂苷Re计）（g/kg或g/L）；
&m——试样质量或试液体积（g或mL）；
&V1——样品提取液总体积（mL）；&
&V2——样品提取液测定用体积（mL）；
m1——从标准曲线查得待测液中人参皂苷Re量（μg）。
1.人参系五加科植物是人参Panax ginseng C A
Meyer的根，含有多种人参皂苷(ginsenoside)，多数为达玛烷型皂苷，如人参皂苷Ral、Ra2、Rbl、Rb2、Rb3、Re、Rd等；少数为齐墩果酸型（C型）皂苷，如人参皂苷Re。由于苷元不同，达玛烷型皂苷又分为：20S—原人参二醇类皂苷（A型）和20S—原人参三醇类皂苷（B型）。其中，A型和B型皂苷酸水解后，分别得到人参二醇（Panaxadial）和人参三醇（panaxatriol）。除人参外，五加科的西洋参、三七、刺人参、刺五加和葫芦科的绞股蓝中亦含有与人参皂苷类似的化合物。当保健食品原料配方中含有上述多种原料时，即以本法“总皂苷（以人参皂苷Re计）”报告检测结果。
2.对于人参、西洋参、绞股蓝纯品或以其为主要原料加工的保健食品，按《中华人民共和国药典》2000年版一部第99页，以薄层色谱法进行鉴定试验，将受试品色谱与对照药材色谱及对照品色谱进行比较确定其主要原料后，人参、西洋参制品仍以人参皂苷Re为对照品进行检测，而绞股蓝制品以绞股蓝总皂苷（中国药品生物制品检定所）为对照品进行检测，分别以“人参总皂苷”、“西洋参总皂苷”、“绞股蓝总皂苷”报告检测结果。
3.回收率：90%～105%。
第四节 褪黑素的测定方法（高效液相色谱法）
本方法适用于功能性食品中褪黑素片剂的测定，非添加褪黑素的天然食品可参照此法。
本方法褪黑素的最低检出量为25ng。
一、方法提要
样品中的褪黑素用甲醇提取后，经高效液相色谱分离，在紫外检测器上检测，波长260mm，用外标法定量，根据峰面积值计算样品中褪黑素的含量。
&&& 二、仪器
1.高效液相色谱仪(Waters2690型)带996型紫外线检测器。
2.超声波振荡器
3.离心机(5000r/min)。
4.微孔过滤器（滤膜0.5μm）
1.甲醇(色谱纯，含量&99.9%)。
2.水（超纯水）
3.褪黑素标准品(纯度99.9％以上)。
4.褪黑素标准溶液：准确称取10mg褪黑素标准品于10mL容量瓶中，用甲醇定容。然后放置超声波振荡器中充分溶解，浓度为1.000mg/mL。用移液管准确移取上述溶液5mL于10mL容量瓶，配制成浓度为0.500mg/mL的标准液。采用相同步骤分别配制浓度为0.250、0.125、0.063mg/mL的标准液。
四、测定步骤&
1.样品处理
取一片样品(标示含1mg褪黑素)，放入小乳钵中研磨成粉末状后倒入5mL离心管中，用甲醇冲洗乳钵3次，倒入离心管中，并定容至刻度。混匀后放入超声波振荡器中萃取10min，然后离心10min(5000r/min)，把上清液移至5mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。混匀后经0.5μm微滤膜加压过滤，滤液待上机测定。
2.色谱分离条件
色谱柱：Nova—PakC18柱3.9mm&l50mm。
流动相：甲醇+水（1+1）。&&
波&& 长：260nm
流&& 速：1.0mL/min
进 样 量：10μL
3.标准曲线的绘制，将配制成的褪黑素标准液（0.063、0.125、0.250、0.500、1.000mg/mL）依次进样10μL，测定各浓度相应的峰面积值，绘制标准曲线。
回归方程：y=1.5351&10-6 x-2.7416&10-2
，r=0.9991。
线性范围：0.063~1.000mg/mL
4.样品测定
取样品处理液10μL注入高效液相色谱仪分离测定，以标准品峰的保留时间定性，并根据样品组分的峰面积在标准曲线上查出相应组分含量。
五、结果计算
式中X——褪黑素的含量（mg/100g）;
m1——从标准曲线上查得相应的黑素的质量（μg）；
V1——样品定容总体积（μL）
V2——进样量（μL）
M——样品质量（g）
肉碱（L&——Carnitine）的测定方法（高效液相色谱法）
本方法适用于添加左旋肉碱的功能性食品中肉碱的测定。
本方法肉碱最小检出量为1.82μg。
一、方法提要
样品的水溶液用高效液相色谱法将左旋肉碱分离，经紫外检测器检测，测定出相应的峰面积，用外标或内标法定量。
1.Bio—Rad700高效液相色谱仪，UV-1706紫外检测器。
2.超声波振荡器。&&
3.微孔过滤器(滤膜0.45μm)。
三、试剂&&
1.甲醇：色谱纯(浙江黄岩化工实验厂)。
2.水：为三蒸水并经Milli—Q超纯处理。
3.离子对色谱试剂：IPR—B7(庚烷磺酸钠·C7H15SO3Na)：天津市化学试剂二厂。
4.磷酸(H3PO4)：分析纯。
5.氢氧化钠(NaOH)：分析纯。
6.左旋肉碱标准品：L—4—氨基—羟基丁酸（C7H15NO3），由瑞士龙沙公司提供。
7.对氨基苯甲酸：C7H7NO2，分析纯：准确称取100mg对氨基苯甲酸用水溶解于100mL容量瓶中，加水至刻度，配成1mg/mL的内标溶液（样品用）；此液用水稀释10倍为0.1mg/mL(标准用)。
8.标准溶液：准确称取25、50、75、100、125mg的左旋肉碱标准品溶于流动相中，用流动相稀释至25mL刻度，配成每1ml的内标溶液（样品用）；此液用水稀释至25mL刻度，配成每1mL含1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg左旋肉碱。
内标法：同上，但内含0.1mg/mL对氨基苯甲酸5mL（最终浓度=0.02mg/mL）。
四、测定步骤
1.样品处理
（1）外标法
准确称取含左旋肉碱500mg左右的样品于50mL容量瓶中，加水约40mL，置超声振荡器中20min助溶，冷却，用水稀释至放刻度，过滤，吸取5mL。滤液于25mL溶量瓶中，用流动相稀释至刻度，经0.45μm滤膜过滤，滤液备用。
（2）内标法
准确称取含左旋肉碱500mg左右的样品于50mL容量瓶中，加水约40mL，及5mL
(1.0mg/mL)对氨基苯甲酸，置超声振荡器中同上处理。
2.色谱分离条件
色谱柱：BIO-RAD BIO—SIL OBS。10 250mm&4mm。
流动相：吸取2.5mL磷酸于475mL水中，加入25mLlmol/L
NaOH摇匀，调整pH2.4，再加入50mg庚烷磺酸钠(B7)，溶解后加入260mL甲醇。
紫外检测器检测波长：2l0nm。
速：1mL/min
灵敏度：0.00l。
进样量：20μL
3.标准曲线的绘制
分别准确吸取以上各种浓度的标准溶液和样品滤液20μL于HPLC中进行测定，记录各组分峰面积，以左旋肉碱的浓度为横坐标，左旋肉碱的峰面积（或与内标峰的面积比值）为纵坐标绘制标准曲线。
左旋肉碱浓度在1.0~5.0mg/mL,线性良好、线性回归方程y=-0.1x，相关系数r=0.9997。
4.样品测定
准确吸取样品滤液20μL于HPLC中，并根据样品组分的峰面积（或与内标峰的面积比值）在标准曲线上查出相应的左旋肉碱的含量。
五、结果计算
&式中& X——左旋肉碱的百分含量(％)；
m1——在标准曲线上查出相应的左旋肉碱质量(mg)；
n——样品的稀释倍数；
m——样品质量（g）；
1000——mg换算成g。
1.关于标准品
左旋肉碱(L—Carnitine)极易吸水变潮，故称量时要注意标准品是否干燥，如潮解不能烘干再用，亦可选用左旋肉碱酒石酸盐(L—Carnitine
tartrate)或消旋肉碱盐酸盐(DL—Carnitine
hydrochloride)等作标准品，但要注意换算：如从L—Carnitine
tartrate换算为L—Carnitine要乘系数0.682，从L—Carnitine换算为L—Carnitine
tartrate要乘系数1.4655。用左旋肉碱酒石酸盐作标准品时，色谱图中在前面多出一个酒石酸盐的色谱峰。
&& 2.本法引自美国药典U.S.P—NF
1995（I），流动相只适用于含杂质较少的样品，如保健食品中配方复杂并添加了中草药、维生素及其他赋形剂等，可将流动相用水或pH2.4的磷酸盐缓冲液稀释3~4倍并适当添加离子对试剂的用量；如样品为口服液或饮料，流动相中水相（pH2.4的磷酸盐缓冲液)与甲醇的比例可延至98：2，庚烷磺酸钠可加至555mg。
3.左旋肉碱才具有生理活性．本法最大的缺点是不能将右旋和消旋的肉碱区分开。
免疫球蛋白IgG的测定方法（单向免疫扩散法）
本方法适用于功能性食品中免疫球蛋白IgG的测定，其中IgG的最低检出限为20μg/mL。
一、方法提要
在含有抗体的琼脂板的小孔中加入抗原溶液，经过扩散后，在小孔周围形成抗原体沉淀环，此沉淀环面积与小孔中的抗原量成正比。测定样品中IgG时，琼脂板中可加入适量的免抗牛IgG抗血清，琼脂板各小孔中分别是加入一系列的己知IgG含量的对照标准品及适量稀释的待测IgG乳粉样品，经过24h扩散后，测量各沉淀环直径。以IgG标准品系列浓度为横坐标，沉淀环直径的平方为纵坐标绘制标准曲线，根据待测IgG样品形成的沉淀环直径查标准曲线得到对应的IgG浓度即可计算其含量。
1.琼脂模板
由二块7.5cm&18cm玻璃板中间隔放一块有机玻璃U形板(厚0.22cm，各边宽lcm，底边长18cm，底边长18cm，两边长7.5cm)构成，用弹簧夹紧。
2.打孔器，Ф 2.5mm。
3.湿盒：有盖搪瓷盘，盘底铺垫纱布3~4层，用0.5%苯酚溶液浸湿纱布。
4.微量进样器。
5.水浴锅。
1.pH6.8磷酸盐缓冲液：称取分析纯的磷酸氢二钾6.8g和氢氧化钠0.94g，加蒸馏水溶解并稀释至1L，混匀。
2.优质琼脂。
3.兔抗牛lgG抗血清(生化试剂)：效价为1:32。
4.牛IgG对照标准品（生化试剂）： Sigma公司提供。
四、测定步骤&&
1.抗体琼脂板的制备
在pH6.8磷酸盐缓冲液中加入1.0%琼脂，加热溶化，冷却到55℃，并在55℃水浴中保温，然后加入抗牛IgG抗血清（效价为1：32，添加量为体积的1/80），迅速混合后倒入琼脂模板内。待琼脂凝固后（需10~15min），将上面的玻璃板小心取去，再取去U形板，用打孔器相隔1.5cm打孔一个，并挑出孔内琼脂块。
2.标准曲线绘制
取牛IgG对照标准品，以pH6.8磷酸盐缓冲液溶解，分别稀释配成浓度为0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.00mg/mL的系列标准溶液。然后，将上述对照标准溶液分别加入抗体琼脂板的小孔中，每小孔5μL(双样)。加样后将琼脂板放入湿盒中，在37℃
放置24h，取出，准确测量沉淀环直径以牛IgG浓度为横坐标，沉淀环直径平方为纵坐标绘制标准曲线。
3.样品中IgG含量的测定
根据样品中lgG含量高低称取适量样品，用pH6.8磷酸盐缓冲液溶解并适当稀释，然后按标准曲线操作步骤在抗体琼脂板小孔中加样，扩散，测量沉淀环直径，根据标准曲线查得样品中相应1gG浓度，并计算样品IgG含量。
说明：观察结果时，可于暗室内，以台灯斜照琼脂板，背后用黑纸作背景，琼脂板玻璃面朝向观察者，将透明厘米尺紧贴玻璃板，测量沉淀环的直径。
1.免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)对增强机体的免疫抗病能力已早为人知。近年来，随着IgG应用于功能性食品的研究，发现IgG在调节动物体的生理功能，如改善胃肠道功能(调节肠道菌群)、促进生长发育等方面起重要作用。有关测定IgG的方法，目前国内外有：电泳法、免疫荧光技术、放射免疫法、高效液相色谱法等。本文介绍的单向免疫扩散法是一种经典方法，设备简单、方法易于推广。
2.本方法在IgG浓度为0.05~1.0mg/mL范围内呈线性关系，对于含有初乳素的奶粉、奶片、胶囊、羊胎素均可测定。
EPA和DHA的测定方法(气相色谱法)
本方法适用于以鱼油为主要成分的功能性食品中EPA和DHA检测，其中EPA的最低检出量为20μg/mL，DHA的最低检出量为60μg/mL。
一、方法提要
样品经三氟化硼甲醇甲酯化后，用正己烷提取，经DEGS气相色谱柱分离，并附氢火焰离子化检测器测定，用相对保留时间定性，与标准系列的峰高比较定量。
1.气相色谱仪：附氢火焰离子化检测器。
2.超级恒温水浴：精度(±0.1℃ )。
3.Eppendorf管(EP管)：0.5～1.0mL。
所用试剂除注明者外，均为分析纯；水为重蒸馏水。
0.5mol/L氢氧化钠甲醇溶液：称取2.0g氢氧化钠溶于少量无水甲醇中，并稀释定容至l00mL。
2. 饱和氯化钠溶液：称取72g氯化钠溶解于200mL蒸馏水中。
3. 三氯化硼甲醇溶液：量取浓度约为47％三氯化硼乙醚溶液30mL，加入到75mL无水甲醇中，混匀。
4. 正己烷。
5. 甲醇：优级纯。
6. EPA和DHA的甲酯标准储备液：采用Sigma公司标准品(cis—5,8,11,14,17—Pentaenoic Acid
Methyl Ester，Approx．99%，cis—4,7,10,13,16,19 Docosahxaenoic Acid
Methyl Ester、Approx．98%)。准确称取0.050gEPA 和0.100gDHA
用正己烷溶解，并定容于10mL容量瓶，此标准储备液EPA浓度为5.0mg/mL,DHA浓度为10.0mg/mL。
(7)FPA和DHA的甲酯标准使用液：将标准储备液用正己烷稀释成EPA浓度为1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mg/mL,
DHA浓度为2.00、4.00、6.00、8.00、10.00mg/mL。
四、测定步骤
1.样品处理
准确吸取10~20μL鱼油于10mL具塞比色管中，加入0.5mol/L氢氧化钠甲醇溶液2mL，充氮气，加塞，于60℃水浴中(约10min)至小油滴完全消失。加入三氯化硼甲醇溶液2mL和正己烷0.5mL，充分振荡萃取，静置分层。取上层正己烷液于EP管中，加少量无水硫酸钠，充氮气，于4
℃冰箱中保存，备色谱分析。
&& 2.色谱参考条件
色谱柱：玻璃柱或不锈钢柱，内径3mm，长2m。内充填涂以8％(质量分数)DEGS+1％(质量分数)H3PO4固定液的60~80目Chromosorb
W. AW. DMCS。
气体流速：载气N2 50mL/min(氮气和空气和氢气之比按各仪器型号不同选择最佳比例)。
温度：进样口210 ℃，检测器21 0℃，柱温190℃。
进样量：1μL。
3.标准曲线的绘制
用微量进样器准确取lμL标准系列各浓度标准使用液注入气相色谱仪,以测得的不同浓度的EPA和DHA的峰高为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。
4.样品测定
准确吸取1μL样品溶液进样，测得的峰高与标准曲线比较定量。
五、结果计算
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&V2
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&V1
式中& X——样品中EPA、DHA的含量(mg/100g)；
&ml——测定用样品液中的质量(μg)；
m——样品的质量(g)；
Vl——加入正己烷的体积(μL)
V2——测定时进样的体积(μL)
EPA和DHA回收率分别为(96.2±3)%和(95.8±4)%，精密度相对标准差分别为1.86%和2.11%。
1.二十碳五烯酸(allc is—5,8,11,14,17 eicosapenoic acid
EPA)和二十二碳六烯酸(allc is—4,7,10,13,16,19 Docosahex—aenoic acid
DHA)为超长链不饱和脂肪酸，具有预防血管疾病、降低血脂、抗癌、抗过敏等作用，因此鱼油制品被广泛应用于医药及保健食品中。
2.鱼油制品用三氟化硼—甲醇溶液酯化。并采用充填8％DEGS+1％H3PO4固定液的色谱柱分离，克服了样品中其他物质的干扰，显示出良好的准确度和精密度。
3.本法同时可以适用于测定油酸、亚油酸和亚麻酸。色谱条件：柱温160
℃，进样口及检测器190℃，其他条件(包括样品处理)与本法相同。
第八节&&&&&&&
超氧化物歧化酶(Superoxide
dismutase，简称SOD)的测定方法
本方法适用于以各类鲜活的动植物组织器官及初加工品(如生鱼片、动物血等初加工肉制品)、乳制品、各类水果蔬菜、果汁等食品中超氧化物歧化酶活性的测定。
超氧化物歧化酶是催化以下反应的金属酶，
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
O +O +2H+ → H2O2+O2
测酶活方法很多，本文介绍氮蓝四唑法与连苯三酚氧化法。
一、氮蓝四唑法
1．方法提要
在电子供体如甲硫氨酸存在下，核黄素受光激发，与电子供体反应被还原。在氧气中，还原的核黄素与氧反应产生O ，O
&将无色(或微黄)的氮蓝四唑还原为蓝色，SOD通过催化O
歧化反应，生成O2与H2O2，从而抑制蓝色形成。按抑制蓝色物形成的50％为一酶活单位。酶活力越高，抑制50％蓝色形成所需酶量越少。
&&& 2．仪器
&&& 荧光灯管。
&&& 离心机。
&&& 分光光度计
&&& pH计。
&&& 3．试剂
(1)磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)，磷酸二氢钾(KH2PO4)，甲硫氨酸(Met)，氮蓝四唑(NBT)，核黄素，乙二胺四乙酸(EDTA)，以上试剂均为分析纯级；所用水为去离子水或同等纯度蒸馏水。
(2)pH7.8，5.0&10-2mol/L的K2HPO4-KH2PO4缓冲液（于冰箱中保存）
4．测定步骤&
(1)酶液的制备：称取5—10g样品，加预先在冰箱中放置的上述K2HP04—KH2PO
4缓冲液，缓冲液的量为所用样品的10倍以上，在4℃条件下或冰浴中研磨成匀浆，四层纱布过滤，滤液经4000r/min离心20min，取上清液用于酶活测定。
(2)酶反应体系液的制备：取上述K2HPO4—KH2PO4缓冲液30mL、依次溶入Met，NBT，核黄素与EDTA，使它们的浓度分别为1.3X10-2mol/L，6.3
10-5mol/L，1.3& 10-
6mol/L与1&10-4mol/L，放冰箱中避光保存。
(3)测酶活在暗光下，取上述酶反应体系液3mL，移人试管中，试管放在一反应小室中，反应小室壁上贴锡箔纸，应将每个试管摆放在照光后所接受光强一致的位置。向每支试管加入25～30m
L酶液。在25~30℃下用光强40001x的荧光灯管(可用15W荧光灯)进行光照，15~20min后，出现颜色变化，停止光照。在560nm波长下比色测量透光度。用未加酶液的反应体系做对照。
5．结果计算
以抑制蓝色形成的50％为一个酶活单位。按下式计算：
样品酶活单位=
式中s——样品照光后的透光度；
a——未加酶之反应液照光后透光度；
b——未加酶之反应液照光前透光度；
n——酶液稀释倍数。
样品酶活单位表示，SOD酶活单位（U）/g干重（g 鲜重或g蛋白）。
(1)进行照光操作时，应注意所用试管的直径与管壁厚度基本一致。
(2)进行比色测定时，应用未加核黄素的酶反应体系液作空白。
二、连苯三酚自氧化法
连苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O
，生成带色的中间产物。在自氧化过程的初始阶段，黄色中间物的积累在滞后30~45s后就与时间成线性关系。中间产物在420nm处有强烈的光吸收，在有SOD存在时由于它能催化生成
生成O2与H2O2，从而阻止了中间物的积累，通过计算就可以求出SOD的活力。
紫外分光光度计。
（1）连苯三酚，K2HPO4·3H2O,KH2PO4,HCL,均为分析纯级；所用水为去离子水或同等纯度蒸馏水。
（2）连苯三酚液：用1&10-2mol/L
HCL将之配成浓度5&10-2mol/L连苯三酚液。
（3）pH8.3，5&10-2mol/LK2HPO4&
-KH2PO4缓冲液。
4．测定步骤
（1）酶液的制备，除使用以上K2HPO4&
-KH2PO4缓冲外，其他同氮蓝四唑法。
（2）连苯三酚自氧化速率的测定：取4.5mL pH8.3，5&10-2mol/L
-KH2PO4缓冲液,在25℃水浴中保温15min，加入10μL5&10-2mol/L连苯三酚液，迅速摇匀（空白以K2HPO4-KH2PO4缓冲液代替），倒入光径1cm的比色杯内，在420nm波长下于恒温池中每隔30s测A值一次。计算线形范围内每1minA的增值，此即为连苯三酚的自氧化速率，要求自氧化速率控制在0.070OD/min左右。
（3）酶活测定：测定方法与测连苯一酚自氧化速率相同，在加入连苯三酚之前，先加入待测SOD酶液，缓冲液减少相应体积。计算加酶后连苯三酚自氧化速率，按以下公式计算酶活。
5．结果计算
样品酶活单位表示同氮蓝四唑法。
样品酶活单位=
式中A420nm/min——酶样品在420nm处每分钟光密度变化值；
V——反应液体积；
n——酶液稀释倍数。
总谷胱甘肽（GSH）含量的测定方法（循环法）
一、方法提要
在还原性辅酶II（NADPH）和谷胱甘肽还原酶（GR）维持谷胱甘肽总量不变的条件下，GSH和DTNB反应，在此反应中，NADPH量逐渐减少，TNB量逐步增加，TNB在412nm吸收增加的速率A412/min与样品中总谷胱甘肽量呈正比。由于采用了γ-GT（γ-谷氨酸转肽酶）抑制剂（SBE抗凝剂）和快速测定，克服了血浆中谷胱甘肽含量极低，离体后消退极快，不易准确测定的困难。本法灵敏度可达0.1nmol/L左右，加收率93%-106%。由于GSH和GSSG循环交替，周而复始总量不变，故称此为循环法（Recirculating
Assay）,是目前较灵敏的测定总GSH（即GSH+GSSG）方法。
带动力学功能的分光光度计（或普通分光光度计）。
高速离心机。
常规的玻璃设备等。
1.& 0.125mol/L
Na2HPO4-NaH2PO4。
2.& 6.3mol/L EDTA缓冲液，pH7.5（0~4℃保存）。
3.& 6.0mmol/L DTNB: 23.8mg DTNB (FW 396.4)
溶于10mL上述缓冲液中（0℃以下冰冻保存）。
2.1mmol/L NADPH：17.5mg NADPH(FW 833.4)溶于10mL上述缓冲液中（使用当天配制）。
50u/mL谷胱甘肽还原酶(GR)。
以上述缓冲液稀释商品GR至要求浓度。例如取0.260mL GR(Sigma,
500u/2.6mL)加上述缓冲液0.74mL（使用当天配制）。
SBE抗凝剂（PH7.4）：内含0.8mol/L& l-丝氨酸。
0.8mol/L H3BO3。
0.05mol/L EDTA，以浓NaOH调pH至7.4（室温存放）。
10%TCA（三氯醋酸），室温存放。
10.&& 0.3mol/L
Na2HPO4（室温存放）。
四、测定步骤
GSH标准系列
称取15.3mg GSH，用双蒸馏水准确稀释至100mL，得0.5mmol/L
GSH。取此液0.08mL，加双蒸馏水1.92mL，得20nmol/L
标准液，再顺序1：1稀释制做标准曲线时，各取0.2mL，则得4、2、1、0.5、0.25nmol/L标准系列。
样品液制备
血浆：取1.5mL静脉全血迅速放入含0.09mL
SBE的小离心管中混匀，即刻高速（约10000r/min）离心1.5min，取出上层血浆0.6mL，移入含0.24mL
6.0mmol/L DTNB的小管中，混匀，迅速取出0.35mL（内含0.1mL
DTNB和0.25mL血浆）移入1mL比色杯中测总GSH。从取入血开始测定应控制在3min之内，大鼠、猪血1.5h内。
全血：取0.1mLSBE抗凝全血，移入含0.5mL
10%TCA小离心管中，混匀，高速离心2min，取上清液0.1mL，加入0.4mL 0.3mol/L
0.5mL上述缓冲液，混匀。取此全血制备液0.1mL移入比色杯中测总GSH。速冻组织（心、肝、肾等）：约1g组织块，加5mL 10%
TCA匀浆，10000r/min离心5min，取上清液0.1mL，加入0.4mL 0.3mol/L
0.5mL上述缓冲液，混匀。取此组织制备液0.1mL移入比色杯中测总GSH。
若采用有动力学功能的分光光度计，则令条件为：波长412nm，吸收范围0~3.0，延后时间20min，反应时间2min；若为普通分光光度计，则人工定时读A412nm，计算出A412/min。总GSH测定步骤操作（见表28-4）
表28-4& 总GSH测定步骤
试剂或样品
样& 品&& 管
2.1mmol/L& NADPH/mL
6.0mmol/L& DTNB/mL
GSH标准系列/mL
DTNB血浆/mL
全血制备液mL
组织制备液/mL
缓冲液（pH7.5）/ mL
直接加在1mL比色杯（1cm光径）中
50u/mL GR/mL
加在比色杯壁上，比色前混匀，即刻开始读A412/min
五、结果计算
制作A412/min-nmol
GSH标准曲线，从样品的A412/min计算出反应管中GSH的nmol量G。
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
血浆：G/ 0.25 mL = nmol GSH/mL 血浆
红细胞：G&90 / （0.1 mL&血球容积比）= nmol GSH/mL红细胞
组织：G&50/（0.1mL&匀浆组织块质量（g））= nmol
GSH/g组织&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
第十节 大蒜辣素含量的测定方法（重量法）
一、方法提要
大蒜中蒜氨的亚砜基、大蒜辣素硫代亚砜基及其转化产物的硫醚基（—S—，—S—S—，—S—S—S—等）被浓HNO3氧化成硫酸根离子，与氯化钡反应生成硫酸钡沉淀，用重量法测定，根据测得的硫酸钡重量换算成大蒜辣素含量。
高温电炉（马福炉）。
组织捣碎机等。
1：1盐酸溶液。
5%氯化钡溶液。
0.1%甲基橙溶液。
2%硝酸银溶液（贮于棕色瓶内）。
10%氢氧化钠溶液等（试剂均为A.R.）。
四、测定步骤
样品液制备
取有代表性的新鲜蒜剥去皮，用组织捣碎机捣成糊状，准确称取5g，加浓硝酸2mL，用玻璃棒压磨至呈黄色，放置5min，用蒸馏水移至100mL容量瓶内，定容混匀干过滤，弃去最初数毫升滤液，取滤液80mL放入烧杯中，加甲基橙指示剂2滴，滴加10%氢氧化钠溶液至黄色，再滴加1：1盐酸至红色，并多加1mL，在砂浴上浓缩至约50mL。
将浓缩液放电炉上热至微沸，取下加入10mL5%氯化钡溶液，搅拌均匀，在90℃水浴中保温2h，用致密无灰滤纸过滤，以热蒸馏水洗至无氯离子（滤液加硝酸银溶液不混浊）。
烘干及灰化
将沉淀连同滤纸放入已知质量的坩埚中，在低温电炉上烘干并使滤液炭化，再放入高温电炉中于600℃下灼烧30min至灰分变白，取出冷却称重。
五、结果计算
根据硫酸钡质量按下式计算：
&&&&&&&&&&&&&&&&
32.06&m1&162.264&V0
大蒜辣素含量（%）=&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&
233.39&m2&V&32.06&2
32.06：硫的相对分子质量；
233.39：硫酸钡相对分子质量；
162.264：大蒜辣素相对分子质量；
m1：硫酸钡质量（g）；
m2：样品质量（g）；
V0：样品提取液总体积（mL）；
V：吸取提取液体积（mL）。
核苷酸含量的测定方法（HPLC法）
一、方法提要
食品中核苷酸经冷的HClO4提取，HPLC色谱阴离子柱分离，检测波长为260nm，与标准峰面积比较，进行定量测定。
岛津高效液相色谱仪LC-4A，SPD-2AS紫外-可见分光光度检测器。
三、试剂。标准品：5ˊ-肌苷酸钠（5ˊ-IMP），5ˊ-鸟苷酸钠（5ˊ-GMP），5ˊ-尿苷酸钠（5ˊ-UMP），5ˊ-胞苷酸钠（5ˊ-CMP），5ˊ-腺苷酸钠（5ˊ-AMP），次黄嘌呤均系日本生产，KH2PO4，HC1O4，KOH均为分析纯。
四、测定步骤
样品液制备
市售新鲜食品绞碎，混匀。称取适量放入100mL烧杯中，加入冷的5%HC1O4溶液30mL，混匀，4℃冰箱内放置1h。取出后，均质，将匀浆液移入50mL容量瓶中，用5%
HC1O4溶液定容至50mL，通过滤纸过滤，取滤液5.0mL，移入10mL量瓶中，用3mol/L
KOH溶液调pH至中性，以蒸馏水稀释至10mL,混匀。离心，上清液用0.45μm的水系滤膜过滤，滤液用高效液相色谱仪进行分析。
5ˊ-AMP、GMP、UMP、IMP均以0.10、0.20、0.30、0.40、0.50μg不同浓度的混合液分别进样，计算峰面积和含量的回归方程。
色谱柱：岛津LC用ISA-07/S2504离子交换柱，直径4.0mm&25cm；
柱温：60℃；
流动相：0.2mol/L KH2PO4溶液，pH4.5；
流速：1.5mL/min；
检测波长：260nm。
五、结果计算
根据样品液峰面积，由回归方程式计算出样液中各核苷酸含量，再换算成样品5ˊ-AMP等核苷酸含量（mg/100g）。
糖精含量的测定方法（比色法）
一、方法提要
糖精为白色结晶或粉末，无臭或微有酸性芳香气，味极甜。糖精与硫代二苯胺和醋酸铜作用生成很稳定的红色化合物，所呈现的色泽与糖精的含量成正比，可与标准比色定量。本法的特点：简便、快速、反应专一、颜色稳定。
分光光度计。
分液漏斗（250mL）。
硫代二苯胺溶液：称取1.0g硫代二苯胺，加少量无水乙醇溶解后，移入100mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度。临用时配制（只能用1天）。
2.& 0.5%醋酸溶液。
3.& 0.5%醋酸铜溶液：称取醋酸铜0.5g，加入0.5%醋酸溶液100mL。
4. 糖精钠标准贮备液：称取糖精钠100
mg，加入50%乙醇溶解后，移入100mL容量瓶中，加入50%乙醇至刻度，摇匀。1mL含糖精钠1mg。
四、测定步骤
1.样品处理
（1）不含蛋白质、脂肪的液体样品
如果汁、果露、汽水、酸梅汤、麦精露、格瓦斯、各种可口可乐、矿泉水等。首先将样品倒入烧杯中，用玻璃棒不断地搅拌除去CO2，称取25g（或25mL样品，置于125mL分液漏斗中，加入5mL10%H2SO4摇匀，用乙醚（30，10，10mL）萃取三次，每次摇3min，弃去水层，合并乙醚层。再用1%碳酸氢钠（NaHCO3）溶液萃取乙醚中的糖精，萃取二次，每次25mL，弃去乙醚层，向水层加入10mL10%盐酸溶液酸化，然后用乙醚提取三次（30，10，10mL）。将乙醚提取液用100mL酸性水（pH4~6）洗涤一次，弃去水层，将乙醚层移入100mL烧杯中，于40℃左右水浴上蒸发至1mL以下，用5mL50%乙醇洗入15mm&180mm试管中，加入醋酸铜溶液和硫代二苯胺溶液各1mL，再加乙醇3mL，将试管置65~70℃水浴中50min，并不断地摇动。然后移入50mL分液漏斗中，用2mL无水乙醇洗涤试管后合并于分液漏斗中。加入5mL苯或二甲苯，再加15mL水，振摇5~10min，弃去水层。加1g无水硫酸钠脱水。以空白液为参比，用1cm比色杯，于510nm处测定消光值，从标准曲线上查出相应的浓度。按下式计算含量。
（2）含酒清的液体样品
准确吸取样品10mL，加入10mL水，加4%氢氧化钠使成碱性，于沸水浴上蒸去酒精，然后移入125mL分液漏斗中，以下按（1）不含蛋白质、脂肪的液体样品操作。
2.标准曲线的绘制
准确吸取糖精钠标准贮备液1mL，置于100mL容量瓶中，加入50%乙醇稀释至刻度，摇匀。1mL含10μg糖精钠。取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL（相当于糖精钠0、5、10、20、30、40、50μg）,分别置于15mm&180mm试管中，加入醋酸铜溶液和硫代二苯胺液各1mL，以下按（1）不含蛋白质、脂肪的液体样品操作。
五、结果计算
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
糖精钠（mg/kg或L）=&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
式中 V：相当于糖精钠标准浓度（μg）；
m：样品质量（g）。
颜色反应达到最大强度时各试剂的用量为：硫代二苯胺10mg；醋酸铜5mg；0.5%醋酸1mL。
当溶液为中性或碱性，以及醋酸铜过量时，将产生沉淀。
反应时间（当70℃时）以45~50min为宜。
提取剂以二甲苯为最好，氯仿最差。
山梨酸、苯甲酸、对-羟基苯甲酸、脱氢醋酸等食品添加剂均无干扰。
牛磺酸含量的测定方法（HPLC法）
一、方法提要
牛磺酸普遍存在于动物体内，特别是海洋生物体内，据文献报道，牛磺酸以游离形式存在，不掺入蛋白质，并具有多种生理、药理作用，常用的含量测定方法有：酸碱滴定法、荧光法、液体闪烁法、氨基酸自动分析仪法和薄层扫描法等。采用高效液相色谱2，4-二硝基氟苯（DNFB）柱前衍生化法测定海洋生物和有关制剂中牛磺酸的含量，该方法具有操作简便、快速、准确、重现性好等特点。
高效液相色谱仪，紫外分光光度检测器，微处理机。
碳酸氢钠。
磷酸氢二钠。
磷酸二氢钠均为分析纯。
2，4-二硝基氟苯为生化试剂（Merck公司）。
四、测定步骤
色谱柱：4.6mm i.d.&250mm，SpherisordC-18.5μg。
流动相——A：CH3CN—H2O（1：1），B：pH7磷酸缓冲液，浓度为30%A。
检测波长：360nm。
流速：1mL/min。
纸速：0.5cm/min。
标准曲线制作
（1）精确称取牛磺酸对照品10mg，置50mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，即得牛磺酸对照液。
（2）精密吸取对照液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mL，分别置于10
mL容量瓶中，加蒸馏水使总体积均为0.5mL，然后依次各加入0.5mol/L
NaHCO3(pH9)溶液lmL，1%2，4-二硝基氟苯乙腈溶液1mL。摇匀，置60℃水浴中避光加热60min后取出，加pH7磷酸盐缓冲液至刻度，摇匀，分别取4μL进样测定，以浓度为横座标，以峰面积为纵座标，进行线性回归。
样品测定。
精密称取样品2g，置25mL容量瓶中加蒸馏水然释至刻度，精密吸取0.5mL，按上述同样条件反应后取4μL进行测定。
五、结果计算
根据待测样液色谱峰面积，由标准回归方程式中得样液中牛磺酸含量，计算出样品中含量（mg/100g）。
第十四、甘草苷含量的测定方法（HPLC法）
一、方法提要
甘草苷系天然甜味剂，是由甘草之根中提取出来。溶于水、乙醇中，不溶于乙醚、氯仿。采用反相离子对分配型高效液相色谱法同时测定食品中甘草苷和糖精钠甜味剂。样品溶液经预柱（Sep-pak
C-18）处理后，用高效液相色谱法测定。操作简易、迅速。酱油、豆酱中甘草苷和糖精钠的添加回收率分别为99.5%和97.8%，定量限界均为0.005g/kg。
高效液相色谱仪。
离心机等。
离子对试剂：0.1mol/L十六烷基三甲基铵氯化物（CTA）。
洗脱溶液：乙醇-0.05mol/L磷酸二氢钠溶液（1：1）用磷酸调pH为3。
四、测定步骤
取试样5g，加0.1mol/L十六烷基三基铵氯化物（CTA）。溶液5ml，加蒸馏水至100ml，取此溶液20mL，通过预柱（Sep-Pak
C-18）2mL/min,用10mLab蒸馏水洗涤，然后用8ml洗脱溶液洗脱，洗脱液中加0.1mol/L CTA溶液至10
mL，取其50μL进高效液相色谱仪。
豆酱、腌鱼
取试样5g,加5%氨水20mL，用组织捣碎机捣碎，加蒸馏水至50mL。时时振摇，放置1h,离心分离（3000r/min）10min,取上清液25mL于烧杯中，加0.1mol/L
溶液2.5mL，用1mol/L磷酸调pH至酸性（pH3～6）.加蒸馏水至50mL，离心分离，除去不溶物，取此溶液20mL。和酱油同样用预柱处理，制成试验溶液进高效液相色谱仪。
高效液相色谱条件
柱：Li Chrosorb RP-18(5μm)直径4mm&250mm，保持柱：Li Chrosorb
RP-18直径4mm&4mm，流动相：乙醇-0.05mol/L磷酸二氢钠（2：3）溶液中含0.02mol/L
CTA。用磷酸调pH为3.0，流动相流量：1.0mL/min，柱温：40℃,测定波长，254nm，样液注入量：50μL。
五、结果计算
根据待测样液色谱峰面积，由标准回归方程式中得样液中甘草苷含量，计算出样品中含量（mg/100g）。
膳食纤维含量的测定方法（DNF法）
一、方法提要
样品在硫酸月桂酯钠存在下，细胞内容物被溶出，洗脱后测定其残渣。该法又叫中性洗涤剂纤维素法。此法测得值包括纤维素、半纤维素、木质素的总量。
高温炉等。
1.中性洗涤剂溶液：称取30g硫酸月桂酯钠，18.61g
EDTA·2Na·2H2O，6.81g硼酸钠（含10个结晶水），4.56g
磷酸氢二钠，10mL甘油单醚，加水至1L。用碳酸钠或盐酸调pH为6.9~7.1。该液低温保存时析出结晶，可加热溶解后再用。
3.无水亚硫酸钠。
四、测定步骤
称到0.5-1.0g风干粉碎样品（一般用20-30目为宜）置于广口三角烧瓶中，加入100ml中性洗涤剂溶液，10ml萘烷，0.5g亚硫酸钠，加热回流，使之在5min内沸腾，并维持微沸60min。抽滤，开始时慢慢抽滤。用90-95℃热蒸馏水充分洗残渣，再用丙酮洗二次，风干后，于100-105℃下干燥至恒重。然后放在500℃高温炉中灰化3h，求其质量，前后质量之差即为DNF量。
五、结果计算
&&&&&&&&&&&&&&
DNF质量（g）
&&&&&&&&&&&&&&
样品质量（g）
脂肪含量高的样品的测定时产泡特别多，影响过滤应先脱脂。
淀粉含量高的样品，煮沸后过滤困难，且淀粉中也包含DNF，使测定值偏高。一般应先用胰酶处理：取0.5g样品置于广口瓶中，加蒸馏水煮沸5min，冷却后加1/15mol/L磷酸盐缓冲液30mL（pH6.8），20mL
10g/L胰酶溶液，加氯化钠使反应时浓度达10mmol/L，再加2~3滴苯，40℃保温24h，3000r/min离心，弃去上清液残渣移入锥形瓶中，按常规测定DNF值。
枸杞子多糖含量的测定方法（分光光度法）
一、方法提要
先用80%乙醇提取以除去单糖、低聚糖、甙类及生物碱等干扰成分，然后用蒸馏水提取其中所含的多糖类成分。多糖在硫酸作用下，水解成单糖，并迅速脱水生成糠醛衍生物，与苯酚缩合成有色化合物，用分光光度法测定其枸杞子多糖含量。本法简便，显色稳定，灵敏度高重现性好。
721型（或其它型）分光光度计。
1.葡萄糖标准液：精确称取105℃干燥恒重的标准葡萄糖100mg，置100mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度。
2.苯酚液：取苯酚100g，加铝片0.1g，碳酸氢钠0.05g，蒸馏收集182℃馏分，称取此馏分10g，加蒸馏水150g，置棕色瓶中备用。
四、测定步骤
枸杞多糖的提取与精制
称取剪碎的枸杞子100g，经石油醚（60~90℃）500mL回流脱脂二次，每次2h，回收石油醚。再用80%乙醚500mL浸泡过夜，回流提取二次，每次2h。将滤渣加渣加蒸馏水3000mL,90℃热提取1h，滤液减压浓缩至300mL，用氯仿多次萃取，以除去蛋白质加活性炭1%脱色，抽滤，滤液加入95%乙醇，使含醇量达80%，静置过夜。过滤，沉淀物用无水乙醇、丙醇、乙醚多次洗涤，真空干燥，即得枸杞多糖。
标准曲线制备
吸取葡萄糖标准液10、20、40、60、80、100μL，分别置于带塞试管中，各加蒸馏水使体积为2.0mL，再加苯酚试液1.0mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0
mL，摇匀后放置5min，置沸水浴中加热15min，取出冷却至室温；另以蒸馏水2mL，加苯酚和硫酸，同上操作做空白对照。于490nm处测吸光度，绘制标准曲线。
换算因素的测定
精确称取枸杞多糖20&mg，置100mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度（贮备液）。吸取贮备液200mL，照标准曲线制备项下的方法测定吸光度，从标准曲线中求出供试液中葡萄糖的含量，按下式计算因素F=m/(ρ&D)，式中m为多糖质量（μg），ρ为多糖液中葡萄糖的浓度，D为多糖的稀释因素。测得F=3.19。
4. 样品溶液的制备
精确称取样品粉末0.2g，置于圆底烧瓶中，加80%乙醇100mL回流提取1h，趁热过滤，残渣用80%乙醇洗涤（10mL&3）。残渣连同滤纸置于烧瓶中，加蒸馏水100mL，加热提取1h，趁热过滤，残渣用热水洗涤（10mL&3），洗液并入滤液，放冷后移入250mL量瓶中，稀释至刻度，备用。
样品中多糖含量测定。吸取适量样品液，加蒸馏水至2mL，按标准曲线制备项下方法测定吸光度。查标准曲线得样品液中葡萄糖含量（μg/mL）。
五、结果计算
按下式计算样品中多糖含量：
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
多糖含量（%）=&&&&&&&&&&&&&&&
ρ：样液葡萄糖浓度（μg/mL）；
D：样品液稀释因素；
F：换算因素；
m:样品质量（μg）。
香菇多糖的测定方法（HPLC法）
一、方法提要
采用高效色谱法分析香菇多糖，选用TSK
SW凝胶排斥色谱柱为分离柱，香菇样品经简单的预处理，在示差折光检测器中进行检测，以不同分子量标准右旋糖酐作标准，同时测定样品多糖的分子量分布情况及含量。该方法较其他多糖测定法具有快速、简便、准确等优点，是目前较为行之有效的测定方法。
高效液相色谱仪，包括126双溶剂微流量泵，156示差折光检测器，System Gold
控制及数据处理系统（带有分子量计算辅助软件）。分离柱：4000SW Spherogel
TSK(i.d.13μm，直径7.5mm&300mm)。带微孔过滤器（带0.3μm微孔滤膜）。实验室常用玻璃器皿。
右旋糖酐。
无水硫酸钠。
碳酸氢钠。
双蒸溜水。
四、测定步骤
分子量标准曲线制备
精确称取不同分子量的右旋糖酐标准品0.100g，用流动相溶解并定容至10mL。分别进样20μL,由分离得到各色谱峰的保留时间，将其数字输入分子量软件中，经校准后建立分子量对数值（logmW）与保留时间（RT）的标准曲线。结果表明，分子量在200&106至3.9&104范围内具有良好线性。
色谱条件。流动相：0.2mol/L硫酸钠溶液，流速：0&.8mL/min。检测条件：示差检测器（以流动相作参比液，灵敏度16AUFS）。
3.& 标准工作曲线。
精确称取相对分子质量50000的右旋糖酐0.100g，定容在5mL定量瓶中，再进一步稀释为10、5、2、1mg/
mL标准液。分别进样，根据浓度与峰面积关系绘制曲线。
样品预处理和测定。
称取一定量样品（多糖含量应大于1mg），用流动相溶解并定容至100mL，混匀后经0.3μm的微孔滤膜过滤后即可进样。若样液不易过滤，可将其移入离心管中，在5000r/min下离心20min，吸取5mL左右的上清液，再经0.3μm的抽孔滤膜过滤，收集少量滤液按色谱条件进样测定。
五、结果计算
1.分子量分布计算
等测样品经分离后得到不同分子量峰的保留时间值，通过分子量标准工作曲线即可计算出多糖分了量分布。该计算程序由分子量辅助软件自动进行。
2.多糖含量计算
选择与待测样品多糖分子量相近标准右旋糖酐为基准物质，用峰面积外标法定量，计算公式如下：
&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&ρ&V
含量[mg/100g(或mL)]=&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
(以右旋糖酐计)
ρ：进样样液多糖浓度（mg/mL）；
m:样品质量（g或mL）；
V：提取液的体积mL。
磷脂含量的测定方法（分光光度法）
一、方法提要
样品中磷脂，经消化后定量成磷，加钼酸铵反应生成钼蓝，其颜色深浅与磷含量（即磷脂含量）在一定范围内成正比，借此可定量磷脂。
分光光度计。
消化装置等。
72%高氯酸。
5%钼酸铵溶液。
2，4-二氯酚溶液：取0.5g2，4-二氯酚盐酸盐溶于20%亚硫酸氢钠溶液50mL中，过滤，滤液备用，临用现配。
磷酸盐标准溶液：取干燥的磷酸二氢钾（KH2PO4）溶于蒸馏水并稀释至100mL，用水100倍稀释，配制成含磷10μg/mL溶液。
四、测定步骤
1.脂质的提取
将供检样品粉碎，脱脂，再过柱（将活化的硅胶，按每分离1g样品用8g的比例，用正已烷混匀装柱），以苯：乙醚（9：1）、乙醚各300mL依次洗脱溶出中性物质。用200mL三氯甲烷、100mL含5%丙酮的三氯甲烷洗脱，溶出糖质。再用100mL含10%甲醇的丙酮，400mL甲醇洗脱，得磷脂，供分析用。
取含磷约0.5~10μg的磷脂置于硬质玻璃消化管中，挥去溶剂，加0.4mL高氯酸加热至消化完全，若不够再补加0.4mL高氯酸继续消化至完全。
向消化好试管中加4.2mL蒸馏水，0.2mL钼酸铵溶液，0.2mL二氯酚溶液。试管口上盖一小烧杯，放在沸水浴中加热7min，冷却15min后，移入1cm比色皿中，于波长630nm处测定吸光度。同时用磷标准0～14μg制作工作曲线，求磷含量。
五、结果计算
&&&&&&&&&&&&&
供试磷脂的总磷量（mg）
总磷（%）=&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&供试磷脂的质量（mg）
磷脂含量（%）=总磷（%）&25
脂肪中磷脂占24.6%，糖脂占9.6%，中性物质占65.8%。
花生四烯酸含量的测定方法（GC）
一、方法提要
花生四烯酸（AA）为二十碳不饱和脂肪酸，在体内能转化成一系列生物活性物质，具有重要的生理功能。AA含量测定可利用有机溶剂将组织中的花生四烯酸分离提取出来，经甲酯化，采用气相谱法测定。
HP5840A型气相色谱仪。分离柱为长2m内径4mm螺旋形玻璃管，载体：Chromosorb W
AW,DMCS,80～100目；固定液：10�GS（二乙二醇丁酸酯），柱温：190℃，检测器：FID，温度300℃，气化温度280℃，载气：高纯氮；流速60mL/min，燃气；高纯氢，30mL/min,助燃气：压缩空气，250mL/min，记录速度5mm/min。
花生四烯酸甲酯。
KOH（A.R.）。
0.5mol/L KOH-甲醇溶液。
四、测定步骤
样品AA提取及甲酯化
血中红细胞膜样品制备：以血离心去血浆层得红细胞，用等渗溶液洗三次，再用10mmol/L
Tris缓冲液溶血，离心去血红蛋白。红细胞膜以相同的缓冲液洗三次，得到乳白色红细胞膜。取适量待测样品，放入到带塞玻璃试管中，加2.5&mL氯仿-甲醇混合液（2：1体积分数），振摇1min，以3500r/min离心12min，小心吸出全部液体，将其转移到另一试管中，氮气吹干，再用1mL磷脂溶液溶解，将溶解液转移至10mL容量瓶中，加入1mL
KOH-甲醇溶液，振荡1min，室温放置15min，加蒸馏水至刻度，摇匀，静置分层，取1μL进行气相色谱分析。
标准花生四烯酸甲酯1mg/mL，进样1μL。
五、结果计算
将待测样品与标准样保留时间比较定性，采用外标定量。
β-胡萝卜素含量的测定方法（HPLC法）
一、方法提要
β-胡萝卜素为脂溶性维生素A的前体，存在各种动植物体中，所以可直接用有机溶剂提取后进行检测。利用反相色谱法分析。
高效液相色谱仪，紫外检测器，记录仪或积分仪，分析天平等。
无水硫酸钠。
乙酸乙酯。
BHT（叔丁基羟基甲苯）。
氢氧化钾。
8. β-胡萝卜素标准液：准确称取标样5.000mg，乙酸乙酯溶解并定容50mL。冰箱中保存，上机前再稀释50倍。
四、测定步骤
1.样品处理
取样品的可食部分洗净切碎，置组织捣碎机捣碎成浆状，称5～10g样品，放入研钵中，同时加少量甲醇、已烷研磨，然后倒入布氏漏斗抽滤，并不断用甲醇、已烷冲洗研钵及残渣，直至残渣为白色。将含有样品的溶液倒入事先装有50mL已烷的分液漏斗中，用蒸馏水冲洗抽滤瓶2～3次，洗液并入分液漏斗中，振摇分液漏斗后静止分层，将下层溶液放入装有30mL正已烷的另一分液漏斗中，向第一分液漏斗中加10mL20%
氢氧化钾的甲醇溶液，振摇后分层，上层为黄色溶液。将下层放入另一分液漏斗中，处理同上。合并二次正已烷提取液，用蒸馏水洗至中性，然后用无水硫酸钠脱水，提取液转移到100mL棕色容量瓶中，加0.1gBHT,并用已烷冲洗分液漏斗数次，最后定容至刻度。上机前取1～2mL提取液于小试管中，氮气吹干，用1.0mL乙酸乙酯溶解后上机。
2.色谱条件
色谱柱：μ-Bondapak C-18直径300mm&3.9mm）；
流动相：100%甲醇；
流速：1.2mL/min；
检测器：可见光440nm；
衰减：0.08AT；
纸速：0.4cm/min；
柱温：室温；
进样量：20μL 。
五、结果计算
根据标准样品的保留时间定性，标准的峰高或峰面积与样品峰的比较而定量。
β-胡萝卜素遇光和氧都会迅速破坏，所以样品应避光保存，所用标准β-胡萝卜素必须临时配制。
第二十一节&
维生素E和胡萝卡素含量的测定方法
一、方法提要
采用石油醚直接冷磨匀浆法提取，不需皂化等操作手续，样品提取液通过氧化铝柱后，维生素E、胡萝卜素被定量吸附，用乙酸乙酯-石油醚混合溶剂分次洗脱出维生素E、胡萝卜素，提高了分离效果，可进行两种维生素含量测定。适合脂肪含量低的食品分析。
岛津RF-510荧光分光光度计。
721型分光光度计（或其他光电比色计）。
乙酸乙酯。
石油醚（60~90℃）。
无水硫酸钠。
标准品：dl-α生育酚以石油醚（60～90℃）稀释至5μg/mL。
氧化铝层析柱：使用前先做维生素E、胡萝卜素吸附洗脱回收实验，必要时需活化处理。取25～27cm层析柱（层析部分：内径0.8cm,长9cm）在细颈端填塞脱脂棉，装入氧化铝3～4g至低于细颈上端0.5cm处，用手轻轻拍柱使氧化铝均匀，上加0.5g无水硫酸钠，在层析分离时先用部分石油醚过柱，再加样品液。
四、测定步骤
1.样品液制备
称取5～10g植物样品（或其他食品），加一定量无水硫酸钠和石英沙，再加石油醚，在玻璃乳钵内磨匀成浆，静置，用玻璃吸管取上清液，移入50mL容量瓶中，重量提取4～5次至刻度。
取5mL石油醚提取液加到氧化铝柱内，开启水泵让石油醚提取液过柱，弃去石油醚流下液。改用含3%乙酸乙酯的石油醚洗脱，弃去部分洗脱液（约3mL），收集洗脱液至15mL，即为样品胡萝卜素测定液。再用含90%乙酸乙酯的石油醚洗脱，弃去部分洗脱液（约3mL），收集洗脱液至15mL，即为样品维生素E测定液。取2.5mL胡萝卜标准液（5μg/mL）和2.5
mL维生素E标准液（5μg/mL）混合液，按上操作，收集即为标准测定液。另取5mL石油醚代替5mL标准混合液，同上处理，即为试剂空白液。
在岛津RF-510荧光分光光度计上，激发波长295nm，荧光波长325nm，狭缝10nm，灵敏度开关置于50(狭缝和灵敏度开关根据需要调节)，用1cm比色皿（以试剂空白调荧光强度为零），读样品测定液和标准测定液荧光强度，测定维生素E。在721型或其他分光光度计上，波长为448nm，2cm比色皿（以试剂空白调光密度为零），读样品测定液和标准液光密度，测定胡萝卜素。
五、结果计算
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&50&100
样品维生素E含量(mg/100g)=&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&B&&&&
&&&&&&&&&&m&1000
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&50&100
样品胡萝卜维含量(mg/100g)=&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&m&1000
A：样品液荧光强度；
B：维生素E标准液荧光强度；
C：样品液光密度值；
D：胡萝卜素标准液光密度值；
m:样品质量（g）。
第二十二节&
微量硒含量的测定方法（分光光度法）
一、方法提要
硼氢化钾在酸性溶液中（1.5～4.0mol/L盐酸浓度）使硒（IV）还原成H2Se挥发分离出来，用邻菲罗啉铁（III）溶液吸收。H2Se再还原邻菲罗啉铁生成橙红色邻菲罗啉亚铁，其颜色深度与硒的浓度在一定范围内符合比尔定律。用氢化物分离一邻菲罗啉铁分光光度法测定微量硒含量的方法，操作较简便，干扰离子少，相对误差在1%以下，最低检出限为0.2μg。
分析天平（感量0.0001g）。
721型分光光度计（或其他分光光度计）。
氢化物发生及吸收装置。
凯氏消化瓶（50mL）。
砂浴或控温电炉。
1.硒标准溶液：将光谱纯硒溶于少量硝酸中，加水配成1.00mg/mL硒贮备液，使用时用0.05mol/L
H2SO4稀释成1.00μg /mL硒的标准液。
2.硼氢化钾溶液（3%）：将硼氢化钾3g溶于100mL0.5%KOH的水溶液，滤去不溶物，贮于聚乙烯瓶中。
3.硒化氢吸收液：在50mL醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4）中，加入75mL0.2%邻菲罗啉水溶液及5mL含Fe+++2
mg/mL的硫酸铵水溶液，加蒸馏水至500mL。
4.pH4的醋酸-醋酸钠缓冲液0.2mol/L NaAC18mL与0.2mol/L HAC 82mL混合即成。
200g/L亚铁氰化钾溶液。
5mol/L HCl溶液。
四、测定步骤
1.标准曲线制备。
取0～10μg硒（IV）标准液，依次加到氢化物发生及吸收装置的反应瓶中，均加5mol/L盐酸15mL，以蒸馏水补充至30mL。在U型玻璃吸收管中装入7.0mL吸收液，在筒形加液漏斗中加入KBH4溶液20mL，盖好塞子，通氮气（或用给气球打气）加压，缓缓开启活塞，让KBH4溶液在3.5~4min内全部加到反应瓶中，控制加入速度以保持吸收液气泡升至吸收管半球部为宜。加完后，鼓气约1min，有助于将可能残存的H2Se自反应液中带出。吸收完后，于25℃室温下放置15min，颜色可达稳定，在508nm下测定吸收液的光密度。以光密度为纵坐标，相应硒含量为横坐标制备工作曲线。
2.样品液制备及硒的测定。
称取1～2g粉碎样品，放50mL凯氏消化瓶中，加硝酸-硫酸（2：1）10mL，在砂浴或电炉上消化至溶液呈现亮绿色，冷却，转移到50mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，混匀。取样品液5~10mL（依硒含量而异）置于反应瓶中，加1mL
200g/L亚铁氰化钾溶液及15mL
5mol/L盐酸，加蒸馏水至30mL，接好发生装置，通气3～4min后，再接上吸收管，从筒形加液漏斗中加入KBH4溶解20mL，按制备标准曲线操作，盖上塞子，（通氮气/或用给气球打气）加压，缓缓开启活塞，把KBH4溶液加入反应瓶中，加完后，鼓气约1min,15min后在508nm下，以试剂空白作参比测定样品液光密度。查标准曲线即可计算出样品中硒含量。
五、结果计算
Y=&&&&&&&&&&&&&&&
Y：样品中硒含量（μg/100g）；
A：查标准曲线得样品测定液中硒量（μg）；
V：用于测定的样品液体积（mL）；
m：样品质量(g)。
1.精细地消化样品是准确测定微量硒的关键所在，若消化不到终点则结果偏高，加热时间过长，或温度太高又会造成硒的逸失（温度控制在100℃左右）。一般以溶液呈现亮绿色为宜。
2.大部分离子不干扰硒的测定，Cu++和大于1000μgFe+++的干扰可直接在反应瓶中加入K4Fe(CN)6溶液，使它们生成沉淀而掩蔽；Ag+可以在处理样品时加入NaCl溶液使之沉淀，过滤除去，I-、S2+、S2O2-3、SCN-有较严重干扰，但可在样品消化处理时除去，反应液中存在硝酸、硫酸时不干扰硒的测定。
3.反应液中KBH4量在0.4～0.7g时，吸收值有较稳定的量高值。吸收完后，于25℃室温下放置15min颜色达到稳定，24h不变。
第二十三节 有机锗含量的测定方法（分光光度法）
一、方法提要
用混酸（发烟硝酸+浓硫酸）回流消化，或用干灰化法（600～650℃灰化完全）灰化样品，Fe（OH）3共沉淀富集锗，苯基荧光酮-溴化十六烷基三甲按（CTMAB）胶束增溶分光光度法测定锗含量。本法灵敏度高，检出限为198ng/g,方法操作简便，精密度好。
751紫外可见分光光计。
磁力搅拌器。
样品消化装置，玻璃设备等。
Fe2(SO4)3。
发烟硝酸。
GeO2（光谱纯）。
8.& 0.03%苯基荧光酮（CTMAB）：称0.03g溶于50mL无水乙醇中，加5mL
1.5mol/L H2SO4lmL，再加去离子水定容至100mL。
9.& 0.9%CTMAB：0.9gCTMAB溶于去离子水中，加9mol/L
H2SO4lmL，再加去离子水定容至100mL。
四、测定步骤
1.样品液的制备
称取粉碎样品3.0g，置250mL圆底消化瓶中，加混酸（5ml浓硫酸，15ml发烟硝酸）小火回流消化至不冒NO2烟雾，消化液呈淡黄色，如试样难消化，可补加发烟硝酸3～5mL继续消化。将消化液冷至室温，加5mLH2O2酶（30%），小火加热，反应完毕后，即消化液呈透明无色，冷至室温。完全转移至烧杯中，于冰浴中，滴加饱和NaOH中和至pH2～4,加10mL3.8�2(SO4)3,于中和液中，在pH计控制磁力搅拌下，用稀NaOH溶液调pH至7.5，此时铁与锗一起共沉淀，继续搅拌5min使沉淀完全，2000r/min
离心10min，弃上清液得共沉淀物。将沉淀物用少量3mol/L
HC1溶解，并完全转移到125mL分液漏斗中，加浓HC1使HC1浓度为9mol/L,充分摇匀后用10mL
CCl4萃取2次，合并CCl4层萃取液，以9mol/LHCL洗涤，除掉上层洗液。准确移取10.0mL去离子水于CCl4层中进行反萃取。
2. 工作曲线制备
准确称取0.1400g
GeO2(光谱纯，称前于110℃干燥2h)，制备成5μg/mL的锗标准液。准确称取不同量标准液（0～
0.5μg/mL）,于10mL试管中，均加去离子水至5mL，加0.03%苯基荧光酮2mL，0.9%CTMAB 1.5m
H2SO41mL，混匀，补加去离子水至刻度。放置10min后于514nm测定吸光度。以锗的不同浓度与对应的吸光度制作工作曲线。
3. 样品液测定
精确吸取5mL水层萃取液放入10mL带塞试管中，同工作曲线操作加苯基荧光酮，CTMAB，H2SO4及测定吸光度。
五、结果计算
由工作曲线查得样品液中锗含量（μg/mL）：
&&&&&&&&&&&&&&
样品中锗含量（μg/g）=
&&&&&&&&&&&&&&&&&
m：样品质量（g）;
ρ：查工作曲线得样品液中锗含量（μg/mL）；
V：样品液体积（mL）。
第二十四节&
茶多酚含量的测定方法（高锰酸钾直接滴定法）
一、方法提要
茶叶茶多酚易溶于热水中，在用靛红作指示剂的情况下，样液中能被高锰酸钾氧化的物质基本上都属于茶多酚类物质。根据消耗1mL
0.318g/100mL的高锰酸钾相当于5.82mg茶多酚的换算常数，计算出茶多酚的含量。
分析天平。
电热水浴锅。
电动搅拌机。
250mL抽滤瓶（附65mm细孔漏斗）。
500mL有柄白瓷皿。
100mL容量瓶。
5mL胖肚吸管等。
0.1%靛红溶液：称取靛红（G.R.）1g加入少量水搅匀后，再慢慢加入相对密度1.84的浓硫酸50mL，冷后用蒸馏水衡释至1000mL。如果靛红不纯，滴定终点将会不敏锐，可用下法磺化处理：称取靛红1g，加浓硫酸50mL，在80℃烘箱或水浴中磺化4～6h，用蒸馏水定容至1000mL，过滤后贮存于棕色试剂瓶中。
0.630%草酸溶液：准确称取草酸（H2C2O4·2H2O）6.3034g，用蒸馏水溶解后定容至1000mL。
3.& 0.127%高锰酸钾溶液的配制及标定：称取AR的
KMO41.27g，用蒸馏水溶解后定容至1000mL，按下面方法标定。
准确吸取0.630%草酸10mL放在250mL三角瓶中（重复2份），加入蒸馏水50mL，再加入浓硫酸（相对密度1.84）10mL，摇匀，在70～80℃水浴中保温5min，取出后用已配好的高锰酸钾溶液进行滴定。开始慢滴，待红色消失后再滴第2滴，以后可逐渐加快，边滴连摇动，待溶液出现淡红色保持1min不变即为终点（约需25mL左右）。按下式计算高锰酸钾的当量数（1mL0.630%草酸消耗2.5
mL0.127%高锰酸钾）。
10&0.630%=耗用KMnO4毫升数&ω
ω(KMnO4浓度，%)=
KMnO4毫升数
四、测定步骤
1.供试液的制备
准确称取茶叶磨碎样品1g，放在200mL三角烧瓶中，加入沸蒸馏水8mL
,在沸水浴中浸提30min，然后过滤、洗涤，滤液倒入100mL，容量瓶中，冷至室温，最后用蒸馏水定容至100mL刻度，摇匀，即为供试液。
取200mL蒸馏水放在有柄瓷皿中，加入0.1%靛红溶液5mL，再加入供试液5mL。开动搅拌器，用已标定的KMnO4溶液进行连搅拌边滴定，滴定速度不宜太快，一般以1s1滴为宜，接近滴定终点时再应慢滴。滴定溶液由深蓝色转变为亮黄色为止，记下消耗高锰酸钾的毫升数为A值。为避免视觉误差，应重复二次滴定取其平均值，然后用蒸馏水代替试液，做靛红空白滴定，所耗用高锰酸钾的毫升数为B值。
五、结果计算
茶多酚含量（%）=（A-B）&ω &0./（0.318&m &V / T）
&&&&&&&&&&&&&&&&&
A：样品液消耗KMnO4量（mL）；
B：空白液消耗KMnO4量（mL）；
ω：KMnO4浓度（%）；
m：样品质量(g)；
V：吸取样品液量（mL）；
T：提取样品液量（mL）。
配制好的高锰酸钾溶液必须避光保存，使用前需重新标定。一般情况下，一星期标定一次。
滴定终点的掌握上以出现亮黄色为止，溶液颜色的变化是由蓝变绿，由绿逐渐变黄。在观察时，以绿色的感觉消失开始出现亮黄为终点。红茶的终点颜色稍深（土黄色），绿茶的终点颜色稍浅（浅黄色）。
3. 制备好的供试液不宜久放，否则引起茶多酚自动氧化，测定数值将会偏低。
第二十五节&
儿茶素含量的测定方法（香荚兰素比色法）
一、方法提要
儿茶素和香荚兰素在强酸性条件下生成橘红到紫红色的产物，红色的深浅和儿茶素的量呈一定的比例关系。该反应不受花青甙和黄酮甙的干扰，在某种程度上可以说，香荚兰素是儿茶的特异显色剂，而且显色灵敏度高，最低检出量可达0.5μg。
1.& 10μL或50μL的微量注射器。
10~15mL具塞刻度试管。
分光光度计。
95%乙醇（A.R.）。
盐酸（G.R.）。
1%香荚兰素盐酸溶液：1g香荚兰素溶于100mL浓盐酸（G.R.）中，配制好的溶液呈淡黄色，如发现变红，变蓝绿色者均属变质不宜采用。该试剂配好后置冰箱中可用1天，不耐贮存，宜随配随用。
四、测定步骤
称取1.00g~5.00g磨碎干样（一般绿茶用1.00g，红茶用2.00g）加95%乙醇20mL，在水浴上提取30min，提取过程中要保持乙醇的微沸，提取完毕进行过滤。滤液冷后加95%乙醇定容至25mL为供试液。
吸取10μL或20μL供试液，加入装有1mL95%乙醇的刻度试管中，摇匀，再加入1%香荚兰素盐酸溶液5mL，加塞后摇匀显出红色，放置40min后，立即进行比色测定消光度（E），另以1mL95%乙醇加香荚兰素盐酸溶液作为空白对照。比色测定时，选用500nm浓长，0.5cm比色杯（如用1cm比色杯进行测定，必须将测得的消光度除以2，折算成相当于0.5cm比色杯的测定值，才能进行计算含量）。
五、结果计算
当测定消光值等于1.00时，被测液的儿茶素含量为145.68μg，因此测得的任一消光度只要乘以145.68，即得被测液中儿茶素的微克数。按下式计算儿茶素总含量。
&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&V总
儿茶素总量（mg/g）=&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&1000&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&V&m
E：样品光密度；
V总：样品总溶液量（mL）；
V：吸取的样液量（mL）；
m：样品质量（g）。
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1 McCord J M,Fridovich I,SAn enzymic
function for erythrocuprein (bemocuprein).J Biol
Chem,9~6055
2 Beauchamp C,Fridovich I,SImproved assays
and an assay applicable to acrylamide gels.Anal
Biochem,~287
3邓碧玉，袁勤生，李文杰.改良的连苯三酚自氧化测定超氧化物歧化酶活性的方法.生物化学与生物物理进展，）：163
邹国林，桂兴芬，钟晓凌，朱汝蹯.一种SOD的测活方法——邻苯三酚自氧化法的改进.生物化学与生物物理进展，1986，（4）：71~73
5 王光亚.保健食品功效成分检测方法.北京：中国轻工业出版社，2002
6 何照范，张迪清.保健食品化学及其检测技术. 北京：中国轻工业出版社，2002
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