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单页修改——流式检测细胞凋亡
& &Annexin V是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。在细胞发生凋亡时，细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（PS）由质膜内侧翻向外侧，而Annexin V与PS有高度的亲和力，可以与暴露在细胞外侧的PS结合。在细胞发生凋亡时，PS的外翻要早于细胞核的改变，因此与DNA碎片检测比较，使用Annexin V可以更早的检测到细胞的凋亡。但是细胞死亡时也会发生PS的外翻，所以Annexin V常与鉴定细胞死活的核酸染料PI结合使用来区分凋亡细胞（Annexin V+/PI-）和死亡细胞（Annexin V+/PI+）。&
操作步骤：
1.&用不含EDTA的0.25%胰酶消化各组细胞，收集后1000rpm离心5min，PBS重悬。
2.&PBS将细胞润洗2次，1500rpm离心5min。
3.&各组样品分别依次加入500μL Binding Buffer，5μL Annexin V-FITC，5μL PI，混匀，室温避光反应5~15min。
4.&流式细胞仪上机检测，CELLQuest软件获取和分析实验数据。
&注意事项：上机检测时必须设1个阴性对照（正常细胞不加Annexin V-FITC和PI）和2个阳性对照（凋亡效果最明显的细胞组只加5μL Annexin V-FITC单标和只加5μL PI单标）。
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流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程.pdf
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流式细胞仪——细胞凋亡检测及相关分子检测
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　　1、细胞DNA含量分布（由细胞DNA降解方式检测细胞凋亡）
　　*收集已固定的单细胞悬液约5×105~1×106/ml；
　　*离心除去固定液，3mlPBS重悬细胞；
　　*1500rpm离心，5分钟，弃去PBS；
　　*加PI染液1ml，室温避光20分钟；
　　*调整细胞浓度5×105/ml；
　　*上机检测。
　　2、磷脂酰丝氨酸外翻分析检测细胞凋亡
　　1）常规制备单细胞悬液，用PBS洗两次。（若为全血要先溶血），取约5×106个细胞，1500rpm离心，弃上清，用400μl1×BindingBuffer重悬；
　　2）分成a、b、c、d、e五管，每管约1×106个细胞
　　a）阴性对照，不加任何试剂；
　　b）阳性对照，加2%多聚甲醛固定30分钟，加AnnexinV5μl，室温10min，用1×BindingBuffer洗一次，弃上清再加190μl缓冲液、10μlPI避光15分钟
　　c）加10μlPI，避光孵育15分钟；
　　d）加5μlAnnexinV液，室温避光孵育15min；
　　e）加10μlPI和5μlAnnexinV液，室温避光孵育5min；
　　3）每管各加400μl1×BindingBuffer.
　　4）上机检测。
　　注意a.操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞；
　　b.操作时注意避光；
　　c.反应完毕后尽快检测，最好在一小时内检测。
　　3、用单克隆抗体APO2.7检测细胞凋亡
　　1）放置0.5~1×106个细胞到试管中；
　　2）室温离心200g，6min；
　　3）弃上清，加入100μl冷的（4℃）在PBSF溶液中含100μg/ml的digitonnin，轻轻地重悬细胞，在冰上孵育20min；
　　4）加入2ml冷的（4℃）PBSF液，室温离心200g，6min；
　　5）弃上清，加入20μlPE标记的Apo2.7单克隆抗体和80μlPBSF液，用vortex轻轻震荡，室温避光孵育15分钟；
　　6）加入2mlPBSF液，室温离心200g，6min；
　　7）弃上清，加入1mlPBSF液重悬细胞；
　　8）避光保存，直到流式细胞仪检测。
　　PBSF：含2.5%FCS（v/v）和0.01%NaN3（w/v）的PBS。（医学教育网搜集）
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流式检测凋亡的讨论 14:28来源：丁香园 点击次数： 15397 关键词： 流式 检测 凋亡 关于凋亡的流式检测wanhood一、PI单染色法基本原理其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：1.细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。2.光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用于活细胞的分类。试剂与仪器PBS溶液（配制方法见附录）；PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保存。70%乙醇400目筛网流式细胞仪实验步骤1.收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。2.3ml　PBS洗涤1次。3.离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃，1—2小时。4.离心弃去固定液，3mlPBS重悬5min。5.400目的筛网过滤1次，500—1000r/min离心5min，弃去PBS。6.用1ml　PI染液染色，4℃避光30min。7.流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激光光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光分析PI荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。8.结果判断：在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上，凋亡细胞与正常细胞相比，前散射光降低，而侧散射光可高可低，与细胞的类型有关；在分析PI荧光的直方图时，先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片，在PI荧光的直方图上，凋亡细胞在G1/G0期前出现一亚二倍体峰。如以G1/G0期所在位置的荧光强度为1.0，则一个典型的凋亡细胞样本其亚二倍体峰的荧光强度为0.45，可用鸡和鲑鱼的红细胞的PI荧光强度做参照标准，两者分别为0.35和0.7，可以确保在两者之间的不是细胞碎片而是完整的细胞。注意事项细胞凋亡时，其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低，或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。二、Heochst 33342/PI双染色法基本原理经固定的凋亡细胞其染色体荧光染料的DNA可染性性下降。细胞一经固定就不再是活细胞，而且细胞固定过程对细胞膜的通透性也有影响。因此发展了用“细胞活性”鉴定染料染色的流式细胞仪检测方法。这些方法细胞不经固定就直接用DNA染料染色，且染料的浓度要比固定细胞所用的浓度要低得多。流式细胞仪通常根据细胞膜完整性将细胞分为“活细胞”和“死细胞”，因此正常细胞和凋亡细胞归为活细胞。活细胞染料如Hoechst 33342能少许进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高，Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度增高的机制与凋亡细胞膜通透性发生改变有关，凋亡细胞早期细胞膜的完整性没有明显性改变，但细胞膜的通透性已有增强，因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342比正常细胞的多。此外，还与凋亡细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA结合以及凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst 33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等有关。既然Hoechst 33342进入凋亡细胞中比正常细胞更容易，而EB、PI或7-AAD等染料是不能进入细胞膜完整的活细胞中，即正常细胞和凋亡细胞在不经固定
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