跑western blot上样体积，我已经调整了上样量为什么我的内参还是跑不齐

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2017-08-18 01:58 标签： westernblot上样量
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。。。。。。。
1. protein - blot 之前 用Bradford 测一下总蛋白量，估摸一下 2. 做完第一次后，用photoshop 软件测一下 各个内参条带的 光密度值，这样可以给 第二次调整的时候 一个参考....
内参一般是指待测样品中含有的一个表达水平稳定的蛋白质，而不是与待测样品相区分的另外一种样品。楼主所说的内参是否与其他的什么概念混淆了？如果给更具体的信息，我可以继续回答。 Marker上样量同两个因素有关，一个是产品本身的浓度，这方面...
肯定需要内参的，否则怎么知道蛋白增减是由于加样量不同造成的，还是由于蛋白表达水平不同造成的？杂志上现在发的文章很少会描述计算方法的细节，但通常都有一个图表显示内参。如果你想找具体的计算方法，最好找一些硕士或博士论文，那里面的材...
在进行Western blot检测前，先用其他方法检测样品浓度，比如通过BCA法，Lowry法，Bradford法等。检测后根据样品浓度调整上样体积，这样既可保证上样量一致。 如果无法检测样品浓度，可以先在SDS-PAGE跑完后进行考染或者银染，根据SDS-PAGE的结果...
那很有可能是定量的时候不准，建议你根据内参条带的亮度调整上样量，保证内参一致的情况下再看目的条带的变化
会出现你说的情况， 你可以试一试，把曝光时间延长，即使有差异的条带也会全部一致的。 如果是上样量过大也是一样的效果。
Western Blot 为什么必须要用内参 要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是 Western Blot 。 因为 Western Blot 操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相 对变化。虽然，...
搞不太清楚你想说什么。内参抗体一般选择 β-actin，GAPDH。hsp90也OK。一般内参抗体都是鼠源的埃既然一抗是鼠源，二抗是接HRP的羊抗鼠就很好理解埃
两个主要作用，内参一般为每种细胞都表达的管家基因，内参的亮度可以指示蛋白的量，也就是说跑多个蛋白样品的时候可以用来调平上样量。另外就是可以通过内参条带的美观度来指示你提取蛋白的质量，有无降解等。
非常不建议你这样上样！ 如果你两次上样的样品在浓缩胶里面没有汇合到一起的话，你跑出来的样用抗体孵育就很可能出现两条条带，根本没法比较大校 我一般上样都在10～20ul左右，完全没问题。不知道你怎么要上这么多……您所在位置： &
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WesternBlot基本概念.doc 35页
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Western Blot基本概念印迹技术
1975，Edwen Southern提出分子印迹概念。
概念：将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于固定化介质上并加以检测分析的技术。目前主要应用于DNA,RNA，蛋白质的检测。
蛋白质免疫印迹法
Western blotting: 免疫印迹法是检测蛋白质混合溶液中某种特定目的蛋白质的定性方法，也可以作为确定同一蛋白质在不同细胞或者同一种细胞不同条件下的相对含量的半定量方法。由于其检测往往需要抗体，所以也被称为免疫印迹技术。
1 检测样品中特异蛋白存在与否
2 细胞中特异蛋白的半定量分析
3 蛋白质分子相互作用的研究
1 细胞裂解物的准备；
2 细胞裂解物的蛋白定量；
3 细胞裂解物的SDS；
4 蛋白质的转移；
6 目的蛋白质的检测。
免疫印迹只能检测目的蛋白的相对含量
测定相对含量时，需要内参照
选择合适的反应条件：SDS胶浓度；转移膜的选择；转移时间的选择
注意电极的正负极
抗体反应时，注意驱除反应袋内气泡
操作要轻柔。western blot操作步骤年鄙人做western的时候，发现目前的资料都很老，网上的资料也大多互相传抄，说法各异，于是综合了目前网上所能找到的资料和个人实际经验，编辑了这份western blot操作步骤2012版，内容包括主要操作步骤和所需要注意的有用的细节，并附上参考文献（原谅我无法像Endnote那样一一注明文献出处，只能大概标注出引用的参考资料），希望对大家有帮助。鄙人按下文的步骤操作已经做出来了稳定可重复的、背景干净的western条带了，所以相信你也行。为了节省时间，鄙人总结了一下western blot Quick Guide和一天做出western的具体时间规划，附在文末。初次发这么长的帖子，难免有错，欢迎批判指正。
蛋白质印迹的发明者是斯坦福大学George Stark。Neal Burnette于1981年所著的AnalyticalBiochemistry中首次被称为Western Blot。最开始做印迹的是一个叫Southern的科学家，但印迹的对象是DNA链，他把这种技术称为Southern blot，后来出现了两个过程相似，但是对象不同的印迹方法，一个针对RNA，一个对蛋白质，人们分别把这两种技术的称为Northern和Western，与这两个技术的发明人没有关系了。
一、蛋白质的样品制备：
由于这一步方法各异，具体步骤请参考试剂盒的说明书即可。蛋白质的样品制备是Western Blotting的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题:
& 在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。
& 选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。
& 防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（加入合适的蛋白酶抑制剂）。
& 样品建议分装成合适的量（比如分装出20ul检测蛋白质定量用），然后保存与-20°或-80中长期保存，但要注意不要反复冻融，因为会使蛋白的抗原特性发生改变。
& 若蛋白提取过程存在问题或蛋白发生降解则很难进行好之后的实验，也就很难做出好的结果了。除此之外 loading buffer的作用也不容忽视，切莫使用不新鲜的上样缓冲液，同时在处理时也应注意将样品与loading buffer混合均匀。
二、蛋白质定量
如果要定量的话，一般选择BCA或者Bradford方法，BCA要求检测波长为562nm，Bradford为595nm。具体方法见各试剂盒说明书。为避免假阳性结果，建议先把lysis buffer加入BCA工作液或考马G250混合看是否产生颜色。测完蛋白含量后，计算含50~100ug蛋白的溶液体积即为上样量（一般8cm宽的迷你胶每个泳道最大能承载的蛋白质量为150ug，所以如果从组织提取蛋白的话上样量不宜过大）。网上有人喜欢等质量上样（即每个泳道的上样体积不一但质量一定），也有使用等体积上样（即先把各个样品稀释到某一固定浓度，然后等体积等质量上样，计算上样体积时需包含loading buffer的体积）。按分子克隆的说法，还是使用等体积上样比较好。上样总体积一般不超过15ul，加样孔的最大限度可加20ul样品。上样前要将样品置于烧杯内，将烧杯置于石棉网上用酒精灯加热至沸腾，在沸水中煮3~5min使蛋白充分变性。也可以使用PCR仪95°加热5min，效果佳，操作方便。之后样品可以在4冰箱短时间保存，也可在-20°冰箱保存数月，但是反复冻融会使蛋白质的抗原
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【求助】Western Blot 内参总是不齐，含泪请求高手赐教。
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这个帖子发布于6年零93天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我做的是肝组织WB，内参用的GAPDH，抗体比较稳定，师兄师姐做着都比较好。我一般测完浓度后按照上样量为25ug计算出上样体积，然后再根据曝光结果调整上样量。可是每次调整了一个样本的量，下次做出来结果另一个又不齐了。
有两次，我跑了4块完全相同的胶，上样样品、顺序、体积完全一样，各种条件均一致，结果内参仍然不齐，而且每块胶不齐的情况都各不一样。实在不知道该怎么调了，非常抓狂。
希望大家给点意见啊。我已经从测蛋白浓度、处理样品、上样手法等方面做过各种努力，实在不知道怎么调整了。谢谢先。
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你的问题主要出在曝光上。这是个技术活，技术含量很高的。最好找高手带你做几次。如果你不是高手，定量时候就尽量不要指望曝光结果了。把定量重点放在制作样品环节上面比较实在。
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你的样品是如何贮存的，看看是不是蛋白样品有沉淀；还有就是如楼上所言，曝光过程中的淬灭现象，导致内参不平。
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相见悠扬ai 我做的是肝组织WB，内参用的GAPDH，抗体比较稳定，师兄师姐做着都比较好。我一般测完浓度后按照上样量为25ug计算出上样体积，然后再根据曝光结果调整上样量。可是每次调整了一个样本的量，下次做出来结果另一个又不齐了。
有两次，我跑了4块完全相同的胶，上样样品、顺序、体积完全一样，各种条件均一致，结果内参仍然不齐，而且每块胶不齐的情况都各不一样。实在不知道该怎么调了，非常抓狂。
希望大家给点意见啊。我已经从测蛋白浓度、处理样品、上样手法等方面做过各种努力，实在不知道怎么调整了。谢谢先。western过程中有几个步骤容易导致误差（我的经验）1、蛋白定量：解决方法：一定要所有样本一起定量，并且定量时候做复孔，以防定量不准。2、上样量以及上样过程：由于枪的差异，枪头的差异，尽量用同一把枪，并且在计算上样量时，一定要调整体积相同，切记！如果可能，调整浓度使得上样体积为10ul，2ul，这样做是为了能够很清楚的看到吸取的体积是否准确。（枪头在2，10ul处有明显的特征）。
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