DNA甲基化检测实验；一、重亚硫酸盐的测序法实验流程（BSP）；（BisulfiteGenomicSequenc；原理：结合重亚硫酸盐的测序法是一种灵敏的能直接检；?特异性高，它能够提供特异性很高的分析结果，这是；法所不能比拟的；；?灵敏度高，可以用于分析少于100个细胞的检测样；析就能得到各个DNA分子精确的甲基化位点分布图；重亚硫酸盐测序法技术实验流程；
DNA甲基化检测实验
一、重亚硫酸盐的测序法实验流程（BSP）
（Bisulfite Genomic Sequence）
原理：结合重亚硫酸盐的测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA甲基化模式的方法。重亚硫酸盐处理后，用针对改变后的DNA序列设计特异性引物并进行聚合酶链式反应（PCR）。 PCR产物中原先非甲基化的胞嘧啶位点被胸腺嘧啶所替代，而甲基化的胞嘧啶位点保持不变。PCR产物克隆后进行测序。通过这个方法能得到特定位点在各个基因组DNA分子中的甲基化状态。该方法特点是：
? 特异性高，它能够提供特异性很高的分析结果，这是所有其他研究甲基化的分析方
法所不能比拟的；
? 灵敏度高，可以用于分析少于100个细胞的检测样品。用微量的基因组DNA进行分
析就能得到各个DNA分子精确的甲基化位点分布图。
重亚硫酸盐测序法技术实验流程
A． DNA制备
用DNA抽提试剂盒（Promega, cat. no. A1125）抽提组织，细胞培养物，石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。
B． 重亚硫酸盐处理
C． DNA纯化
用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重亚硫酸盐处理后的DNA样品。
D． PCR扩增
E． PCR产物琼脂糖电泳后回收纯化
F． PCR产物连接到pMD19-T (Takara) 载体中克隆及测序。
G． 用分析软件对各样本测序结果进行甲基化程度分析
二、甲基化特异性的PCR实验流程
（methylation-specific PCR, MSP）
原理：甲基化特异性的PCR是一种灵敏度高且操作相对简单的甲基化研究方法。重亚硫酸盐处理DNA后，基因组DNA
发生的由甲基化状态决定的序列改变。随后进行引物特异性的
PCR。该方法引物设计是关键。MSP中设计两对引物，即一对结合处理后的甲基化DNA链（引物对M），另一对结合处理后的非甲基化DNA链（引物对U）。检测MSP扩增产物，如果用引物M能扩增出片段，则说明检测位点存在甲基化；若用引物U扩增出片段，则说明被检测的位点不存在甲基化（图3）。该方法优点是：
1、检测灵敏度高，样品消耗少，仅需1μg的基因组DNA，可用于石蜡包埋样本；
2、快速、简单，省时；
3、如果结合Real-time定量PCR技术（Taqman 探针）则能对样品中检测位点的甲基化水平进行定量检测(Methylight)。
MSP技术实验流程
A．DNA抽提
用DNA抽提试剂盒（Promega, cat. no. A1125）抽提组织，细胞培养物，石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。
B. 重亚硫酸盐处理
C．DNA纯化
用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重亚硫酸盐处理后的DNA样品。
D．DNA脱磺基反应
E．甲基化特异性的PCR反应
针对改变后的DNA序列设计两对引物（M，U），进行PCR反应。为了避免非特异性扩增用TaKaRa的hotstart酶。随后对PCR产物的凝胶电泳图进行分析。
检测肝癌细胞株Bel7405，Bel7404中SFRP1基因启动子甲基化。重亚硫酸盐处理后，针对改变的DAN序列设计两对引物
M: (forward: AGTTAGTGTCGCGCGTTC; reversal: CCGATACCCATACCGACTC) 299 bp
U：(forward:GGAGTTGGGGTGTATTTAGTTTG; reversal: CCAATACCCATACCAACTCTACA) 247 bp PCR扩增结果图
三、高分辨率熔解曲线（HRM）法
高分辨率熔解曲线分析技术（High Resolution Melting ），简称HRM，是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型而及甲基化检测的新方法。基本原理是基于核酸分子由于片段长短、GC含量、GC分布及单个碱基差异等物理性质不同而造成DNA分子在加热变性时都会有不同的熔解曲线的形状和位置，并配合运用高浓度的饱和荧光染料，可以迅速的检测出核酸片段中GC含量和单碱基的突变。近年来，公司引进了RocheLightCycler? 480 II 和ABI VIIA7 全自动荧光定量PCR系统，为客户提供专业化、个性化的甲基化HRM检测服务。
操作流程：
~待测基因序列片段或位点甲基化引物设计（300bp以内）。
~利用甲基化转移酶修饰的DNA和非甲基化修饰的DNA制备标准品（0％，1％，5％，10％，20％，50％，100％梯度HRM标准曲线）
~亚硫酸氢盐处理样品DNA
~数据处理，形成报告（包括实验过程、试剂耗材、荧光PCR仪原始文件、测序文件等）。
实验实例：
对2个病例的某基因20个CG位点进行检测，分析出不同的甲基化程度。
四、焦磷酸测序法
焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术是由4种酶（DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase)、荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)）催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。每一轮测序反应体系中只加入一种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)。如果该dNTP与模板配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3'末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。掺入的dNTP和释放的PPi是等量的。CpG甲基化焦磷酸测序检测法基于引物延伸的Pyrosequencing技术，通过将链合成过程中释放出的焦磷酸(PPi)转化成光信号来监测链的合成过程。通过检测CpG对应位点上C/T渗入的比例对目标位点的甲基化程度进行定量分析方法。
操作流程：
~DNA亚硫酸盐处理
~用焦磷酸测序专门引物设计软件设计甲基化引物 ~进行PCR扩增预实验及正式实验
~PCR产物上焦磷酸测序仪检测
实验实例：
各种方案比较
检测方法 检测基因位定量情况 位点信息
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求教一下bisulfite sequencing如何分析一个基因启动子的甲基化
最近老板让我做这个，之前完全没接触过如何去分析特定基因启动子甲基化岛的问题，求教懂的大神，不胜感激。
对的，就是用这个。。。但是我完全不懂，你懂吗
找了的，但是还是不懂。。我实在是太弱了
可以向你多请教吗
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重新安装浏览器，或使用别的浏览器癌症诊断的新突破——ctDNA甲基化测序
& & && & & & &&癌症的发生伴有大量的基因组或染色体的突变，但由于其本身存在演化过程的异质性，因此对于诊断和靶向治疗存在相当大的困难，挖掘真实有效的肿瘤标志物一直是癌症研究的方向。随着表观遗传学领域的发展，肿瘤表观遗传的变化，尤其是DNA甲基化的调控，逐渐被认为是环境因素影响癌症风险的重要机制。1ctDNA可作为更早的肿瘤诊断标志物现今，循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）是一类被认为具有广泛应用前景的肿瘤标志物，可用于肿瘤发展及预后状态的无创测定。通常来说，对于极晚期癌症患者，ctDNA的主要来源是其肿瘤组织，可以通过基因测序技术检测到肿瘤的体细胞突变位点，用于癌症的诊断，但是一些前期的肿瘤本身由于ctDNA在血液中含量较低，并不容易检测突变频率较低的位点，需要极深的测序深度才可能预测肿瘤发展。ctDNA甲基化对比ctDNA肿瘤体细胞突变，可以作为更早的肿瘤标志物被检测到，因此ctDNA甲基化在肿瘤诊断、疗效监测，预后评估和生存率评价等方面将具有更广泛的价值。2ctDNA肿瘤特异基因的甲基化ctDNA的甲基化已经被报道多年了，其主要集中于大肠癌，肺癌，乳腺癌，胰腺癌以及其他类型的恶性肿瘤。SEPT9的异常高甲基化较高地关系到大肠癌的发展，并且RASSF1A和E-cadherin同样作为新的血浆标志物用于大肠癌[1]。APC, RASSFIA 和 DAP-kinase 也被发现存在于94%的乳腺癌患者中[2-3]。研究发现在肺癌中有超过80个基因发生异常高甲基化[4]。3ctDNA可追踪特定组织细胞的来源DNA甲基化具有时空特异性，组织和不同类型的细胞间存在特殊的差异甲基化模式，通过对比已知的甲基化图谱，可以辨别ctDNA的组成成分，提供血浆的全景图，从而指出ctDNA的来源。通过全基因组范围的重亚硫酸盐测序，发现妊娠期孕妇外周血中12.1%到41%的基因是来自于胎盘；另外在29例肝癌患者中检测到血浆中较高比例的癌组织DNA，肝脏对血浆DNA的贡献率为24%，而在对照组中只有10.7%[5]。4ctDNA甲基化的检测方法传统的检测方法，围绕少量目标候选基因的检测，主要是基于PCR扩增的甲基化敏感限制性酶切，亚硫酸氢盐测序等方法。但随着高通量测序技术的发展，微量的ctDNA中进行全基因组重亚硫酸盐测序也逐渐成为可能[5]，最近国内科学家研发了新的ctDNA高通量甲基化测序技术（methylated CpG tandems amplification and sequencing，MCTA-Seq），该方法对富含CGCGCGG的位点进行扩增，因此可以检测出cfDNA中成千上万超甲基化的CpG岛，但只需7.5 pg的基因组DNA[6]。5安诺产品安诺基因已深入开展ctDNA全基因组甲基化测序项目，目的在于协助科研工作者挖掘更多有效的甲基化生物标志物，未来ctDNA甲基化在转化医学领域将会有非常广阔的应用空间，并快速推动临床检测的发展。6参考文献1. &Pack SC, Kim HR, Lim SW, Kim HY, KoJY, Lee KS, Hwang D, Park SI, Kang H, Park SW et al: Usefulness of plasmaepigenetic changes of five major genes involved in the pathogenesis of colorectalcancer. International journal ofcolorectal disease ):139-147.2. &Dulaimi E, Hillinck J, Ibanez deCaceres I, Al-Saleem T, Cairns P: Tumorsuppressor gene promoter hypermethylation in serum of breast cancer patients.Clinical cancer research : an officialjournal of the American Association for Cancer Research
Pt 1):.3. &Harrison K, Hoad G, Scott P,Simpson L, Horgan GW, Smyth E, Heys SD, Haggarty P: Breast cancer risk and imprinting methylation in blood. Clinical epigenetics ):92.4. &Vinayanuwattikun C, Sriuranpong V,Tanasanvimon S, Chantranuwat P, Mutirangura A: Epithelial-specific methylation marker: a potential plasma biomarker inadvanced non-small cell lung cancer. Journalof thoracic oncology : official publication of the International Associationfor the Study of Lung Cancer ):.5. &Sun K, Jiang P, Chan KC, Wong J,Cheng YK, Liang RH, Chan WK, Ma ES, Chan SL, Cheng SH et al: Plasma DNA tissuemapping by genome-wide methylation sequencing for noninvasive prenatal, cancer,and transplantation assessments. Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America ):E.6. & Wen L, Li J, Guo H, Liu X, Zheng S,Zhang D, Zhu W, Qu J, Guo L, Du D et al:Genome-scale detection ofhypermethylated CpG islands in circulating cell-free DNA of hepatocellularcarcinoma patients. Cell research ):1376.
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