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这个做的western blotting目的蛋白GAPDH. 蛋白定量的时候1) 5ug&&2)10ug 3)15ug&&希望因为浓度的不同，深度不同。
出来的结果如果，很奇怪的第一和第二条都很清晰的出现了，#3 一点都没有显示。如果是技术上的问题，1和2都应该比较模糊才对？会有什么原因呢？&&谢谢各位！
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叶孤城天外飞仙 发表于
你当时看了SDS-PAGE的条带没有~~
是指的用丽春红染色么？当时 1,3 有2 不很明显
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叶孤城天外飞仙 发表于
可能是转膜出问题了~~
我也是想的可能在转膜的时候出现问题的可能最大，只是因为1,2都还整齐清晰的情况下 3 出问题的可能 很奇怪呀
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叶孤城天外飞仙 发表于
这个你现在光这样想也没过大意义，你重做一次，看是什么结果，这次记得先看下SDS-PAGE的结果。
好的 谢谢解答。另外 western blot做的时候 结果应该是 1,2,3 应该越来越粗的条带？
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这是不是弥散了？
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实时荧光定量PCR出现很多乱峰，求大神们帮电泳单引物跑出来为什么是这个样子电泳单引美开发细菌制造生物燃料技术晒动图——活体细胞4D成像新手段，细胞筛选你还在搬砖吗
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逛了这许久，何不进去瞧瞧？WesternBlot问题解答 1.凝胶肿胀或卷曲：注意转膜之前，切割下来的凝胶一定要在转膜缓冲液中浸泡平衡5-10分钟，要含有20%的甲醇。 2.条带歪斜、或漂移
因为转膜仪使用时间太长，两块板之间的海绵由于长期使用变得很薄。当按照阴极-海棉-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵依次放好后两块板不能压紧，因而在胶和膜之间可能存在潜在的间隙，电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走，形成如图所示的形状。使用十几张普通的草纸垫在两块海棉之间，条带就可以变得非常的漂亮。 另外，转膜时转膜液一定要浸没凝胶和膜，否则也可能出现上述情况。 3.单个或多个白点：转膜时在膜与胶之间有气泡。做三明治时一定要逐层压紧，赶尽气泡。同时转膜液要提前配置好，加好甲醇，保证转膜前夜体内气泡排净。气泡存在的局部会抵抗蛋白转膜，降低转膜效率。 4、转膜缓冲液过热： 缓冲液离子强度太低，或电压及电流过高。按照上述方式配液，同时转膜过程中注意降温。我在冰水混合物中转膜，效果很好。 5背景过高！ 1）封闭不全，我用5%-10%的光明脱脂奶粉，效果还可以，现在做基本上没什么背景。如果你觉得不够可以加点BSA,1%吧。 2）一抗或者是封闭液与膜蛋白的交叉反应。这种情况通常可以通过加入TWEEN-20或多次洗膜加以解决。如果问题不能解决，那么降低一抗浓度，或更换封闭液种类可能解决 3）一抗二抗中某些不纯的物质也可以造成背景。 4）抗体浓度太高，或孵育时间太常都可能遇到这种情况。那么可以适当降低一抗二抗的浓度，或是用提高温度的方式来代替杂交时间的延长；另外，少量多次得洗膜效果要优于多量而长时间得洗膜效果。 5)曝光时间的控制。通常我们线曝光一分钟试试，条带清晰背景也强，可以缩短曝光时间，或者过一段时间等荧光减弱以后再发光，一般也可以发出比较好的条带。如果背景强于条带，那么肯定是前面默默个原因的一种，这是可以将膜在TBST中漂洗以下再发光，有时会有比较好的效果（仅限于国外较好的试剂盒，国产的不行，洗一下啥也没了！）这个时候可以洗膜，洗膜后重新发光。 6、没有信号： 1)用单抗时比较容易出现这种情况。因为单抗主要是针对天然蛋白，这个时候.TWEEN-20的作用就显现出来了，它可以增加抗原抗体复合物与膜的结合。 2)确信你的蛋白表达 3)确信蛋白高效的转移到你的膜上 4)一抗二抗的效价问题。无论哪个无效都不能发光，因此预实验一定要从最低的稀释度开始，以排除抗体的因素 5)ECL试剂盒质量的问题，不可小觑。偶亲身经历。碰到一批次品。两个月白搭！ 7、微量进样器堵了怎么办？ 首先从预防入手，每次用后的进样器及时用蒸馏水清洗！ 如果堵了，不要紧，有办法：可以用如下办法解决： 1）首先反复推拉上样针，看是否可将堵塞物吹出来； 2）方法1不灵，若是25或50ul的针，把针从后侧拔出，然后重新插入，使其内部产生气压，可能压出堵塞物质； 3）如上述方法不灵可以在拔出后注入些清水，然后重新插入，用水压排出， 4）最后的方法，最灵的方法：开始步骤同第3种方法中，在加入水后，将上样器的前端针部放在酒精灯上煅烧至红色（估计在什么位置堵的），注意 烧红部分不要距离玻璃过近，然后，趁热突然推 针，将水强行推出，通道打开后，再通过稀酸或稀碱冲洗即可！ 5）或者放在超声清洗仪里，超声试试
注意，切记在推拉过程中小心不要把针弄弯 8、关于SDS蛋白电泳的一点心得
最近在做蛋白电泳时候遇到了些麻烦，在这里发了帖子，并且得到了很多同人的恢复。本人在看过回帖后，结合自己的试验，重新设计了方案，得到了满意的结果，同时感觉有必要拿来和大家分享： 1）蛋白电泳中出现的纵向条带：原因主要是由于电泳样品或是电极缓冲液中有没有溶解的样品颗粒所致，上样前充分将样品离心，或重新使用新配电极缓冲液即可解决。 2）电泳条带前沿在染色脱色后呈尖形。原因是由于上样量大且工作电压过大引起，我实验中采用90/120，后来改用了80并且不换电压；同时减少上样量到原来的一半，得到了满意的结果（我的样品分子量18000 Da，15%的分离胶）； 3）电泳结束后，染色脱色结果整个胶面呈现蓝色，背景很重 怎么也脱不去，改用新配的电极缓冲液。问题解决。是电极缓冲液污染的结果（平时本人有个坏毛病：喜欢在缓冲液中涮上样针，导致缓冲液污染 ）。
9.分别用多大电流转膜? 1）一般跟你的分离胶的浓度有关。 2）与你的转印系统型号有关！ 3）与目的蛋白的分子量有关1 一般50KD左右的蛋白，50mA，1.5h； 10.好几个蛋白，我做免疫荧光都做得很好，抗体说明也是可以用于western的，可是就做不出来！显影后只有很弱的非特异带。而另一个蛋白，perk却做得很好，操作都是一样的，抗体稀释也是按厂家说明的。
1)你用的是单克隆抗体吗？如果是的话，请注意western 是在蛋白质变性的条件下进行的，活性状态下可以反映的抗体在变形状态下却不一定特异性很强，可能其他的蛋白质变性之后产生了能与之反映的抗原决定簇！ 另外，要做好对照！抗体是什么公司的？有的公司会将康体稀释后再卖（奸商），所以抗体的滴度，根据公司的要求也不一定准！ 2)如果是单抗，western blotting电泳后蛋白变性，构象表位可能消失，仅存在线性表位，单抗可能不识别。所以WESTERN BLOTTING 做不出来了。 11.我的WESTERN为什么出现了多条带，每个加样槽中 都出现了多条带，而且好象都很有规律，为什么？是封闭时间不够吗？请指教我做WESTERN 是想知道处理后细胞分泌细胞因子数量的变化，这样必须要内参吗？
可能性 1)一抗、或二抗抗体浓度太高 2)多克隆抗体本身的非特异性反应 3)抗体的特异性不强 4)蛋白异构体或降解！ 5)你的目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。这样才有说服力，表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化。所以严格意义上说，内参事必须做的。 12.转膜的时候，最下端的蛋白条带很清楚，可是上边啥都没有看见，社么原因？ 1)可能是时间不够，因为一般是分子量小的先转上去的，大的后转，看你的目的蛋白了，如小的话，最后 不要太长时间
2)转膜的时间要根据你的目标蛋白大小和胶浓度而定。蛋白越大、胶浓度越高，时间就要越长。经验是：12％－18％的胶、4－18kD的蛋白用100v衡压/350mA衡流75－90min的条件都可以成功转膜 3)主要是转膜时间不够，若想证明这个问题，可把原来的SDS-PAGE，做一下染色，看看大分子量的蛋白是否仍在胶上。另外，做western时，转膜并不是最复杂的，但无疑是很重要的，如果胶上残存的目的蛋白过多，会使与抗体结合的蛋白负荷不足，而影响实验结果，因而要反复摸索转膜时的时间、电压/电泳，直到获得满意转膜效果。
WB的关键点我觉得有一下几个：一是样品的处理；二是电泳和转膜条件的摸索；三是保证试剂、抗体的质量。 13.western blot 怎样做内参照阿？ 1）可以转膜后先用目的蛋白的抗体做杂交，将抗体洗掉，再用内参蛋白的抗体重新杂交，结果显示信号亮度一致，认为上样量一致；。 2）同样条件做两块胶，等量上样，同时转膜；一块做内参蛋白，一块做目的蛋白。 3）只做一块胶，用蛋白marker做标记，转膜后用丽春红染色，可见到42kd（β-actin）左右处有浓染的条带，在42kd略上方将膜剪开分别作杂交即可。要求目的蛋白和内参蛋白大小有一定的差异。 转大分子量的蛋白可以在转膜液中加入SDS至0.05%，并且可以适当减少甲醇用量，如15%的甲醇 电泳中SDS是十二烷基硫酸钠。十二烷基磺酸钠简称为SAS，两者的区别是其中S的化合价不同，各是多少没去考证。由于最初翻译者将SDS翻译为十二烷基磺酸钠，被很多书籍引用，故十二烷基磺酸钠为误称。真正的十二烷基磺酸钠不能用于WESTERN。 14.胶为什么总是漏？ 1）
每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其它附件，下次用之前，用75％酒精擦拭玻璃和胶条，能有效防漏，且利于剥胶。 2）
避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损很重要，尤其是下面和胶条接触的地方 3）
关键是找一块很平的桌面，使两块玻璃底面非常齐就行了 4）
胶条一定要干，跑完电泳后，胶条就放在实验台上晾着。 5）
下面的胶条注意不要老化，如果有裂纹的话用保鲜膜垫在上面，也可以有效防止漏胶，或者反过来用 6）
玻璃在使用过程中容易造成小的缺口，从而导致封条无法完全密封，装好架子后，在玻璃底边上抹上一层薄薄的凡士林就好了，两边多点（容易从两边漏）这样就不会漏了，就算是用了很久的很多小缺口的玻璃都没有问题，然后转移到电泳槽的时候，去掉封条，把底上的凡士林擦干就OK了（注意，一定要擦干净，尤其是少量进入了两隔玻璃之间空腔的，赢伟凡士林不导电，会影响第2相的效果的 7）
你可以在海绵垫下再垫一些纸，使得它与玻璃贴的更紧密。或者在玻璃底部用琼脂糖封上。 8）
因为两块玻板没有放的完全对齐，底部不在同一个平面，所以封条封不严，重新对齐后就不漏了。以后每次只要在水平的桌面上仔细对齐两块玻板，再夹紧。用手感觉一下确定在同一平面上后，放到灌胶架并压在封条上，卡紧。注意两边均匀用力，一般不会再漏。 9）
先把两块玻片放在夹子上，不要加紧，放到架子上，使两块玻片的底部对齐，夹紧两块玻片，然后取下再在其下面垫上垫片，这样一般就不会漏胶了。但是如果你放了垫片再对齐玻片底部，或者在桌子上对其玻片底部然后放到架子上的话，经常会漏胶 15.条带跑得比正常的窄？ 1）可能因为胶凝的不均匀，聚合的不是很好，灌胶的时候尽量混匀 2）是不是有窄有宽？可能与你拔梳子的时候有关，拔梳应该迅速，冲洗加样孔的时候要小心，以免把上样带扭曲；胶配好了用枪吹几下再灌胶，还有就是要等指示剂跑到两层胶交界成一线时，再调高电压。 3）可能是你样品的问题，如果盐浓度较高，便会挤压其它条带，致使条带宽窄不一，由于同样的原因，样品在凝胶中的速度会很慢，造成条带走的较慢，好像与你的预想不一致 4）常见的原因是：每孔上样量不均匀，应确保每孔中上样量一致 5）可能是系统的ph出了问题，有可能是你的电极缓冲液，也有可能是凝胶缓冲液，更新缓冲液看看，看是否能成功 16.为什么会有“微笑”和“倒微笑”这样的效果呢？ 1）\微笑\是因为你灌胶的时候冷却不均匀，中间部分冷却不好，导致凝胶中的分子有不同的迁移率所致。这种情况在较厚的凝胶以及垂直电泳时常常发生。“倒微笑“也称“皱眉“现象常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的三明治底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象 2）书上说出现“微笑”是因为整个胶冷凝的不均匀，中间部分和两端受热不一样而致成了“倒微笑”可能是因为两端的胶凝的不好，加APS和TEMED后应该混合均匀。 3）样品中盐浓度过高？点样量太多或每孔点样量不均匀？电泳电压不稳定或过高？ 17.Western-blot 制胶时好多泡泡怎么办？ 1）首先，玻璃板一定要洗干净，用洗洁净洗，冲干净后再用双蒸水冲一，晾干。配胶的时候沿管壁缓缓加入各个成分，混匀的时候用手轻轻摇匀，如果用枪吹打时要缓慢且不要打到头。 2）配胶时混匀要轻，尽量不产生气泡，上胶时要快，枪也不打到底。加完分离胶后用双蒸水封，待其凝固。即使在上胶时液面上有气泡，加水后也会浮上来。分离胶凝好后，倒掉里面的水，用吸水纸吸干，再加浓缩胶，迅速插梳子。 3）倒胶的时候，用1ml的枪沿一侧缓缓加入，不要打到头，以免带入气泡！ 4）将胶在小烧杯里配好后，将电泳槽略微倾斜，将烧杯的嘴靠在玻璃边缘，直接倒进去，速度快 ，而且不容易产生气泡，不妨试试 5）用双蒸水封时建议用200ul的枪加水，这样压力小，以免把胶冲起来！ 6）国产的只能是缓慢加样，别把气泡加进去。如果加进去了，小心把整个板在桌上敲敲可以让气泡浮上来。 7）分离胶中的气泡与插梳子有关，垂直插容易产生气泡，且不容意排除。将梳子倾斜5-10度插入，即使产生气泡也可以也可以通过轻轻晃动梳子使气泡从一侧逸出。 8)pinghw 还有一个制胶起泡泡的原因，就是配胶的液体全部在四度存放，室温制胶时由于温差及凝胶聚合反应放热的关系，液体中微小的气泡在凝固的凝胶中也会放大成可见的较大的泡泡，这种情况在夏天室温较高时更容易出现。避免的方法是将制胶成分中除催化剂外的部分配置后放室温下静置一会儿，减小温差后再加入催化剂制胶。 18.一些琐碎的细节，但却是实验中可能经常遇到的令人头痛的问题： 1 ）安装好的制胶装置，最好先用配置电泳缓冲液的水加满检验一下是否漏水，检验确认不漏水的装置再用于制备凝胶。 确认不漏水后，倒出水，然后使其尽量流出，其实残留的一点水并不影响结果，而且还会使电泳好的凝胶容易剥落下来。 漏水的装置制作的凝胶尽管可以使用，但它会造成电泳时候电流的分流，不但影响电流的效率，而且还会使部分加样孔的条带歪曲。 2） 制胶时最好最后加入AP，这样可以避免偶然情况下不能马上灌胶而导致胶的聚合，确认所有的东西准备齐全了，再最后加入AP，混合均匀后马上灌胶。一定要使配胶的几种溶液混合均匀，这是制得性质均一的凝胶的前提。 3 ）进口的AP可以很快使胶凝聚。所以，AP的用量最好比书上推荐的用量少点，这样可以使胶的溶液慢慢聚合，这更有利于形成均匀一致的凝 胶。也不会使操作变得手忙脚乱。 4） 有时候，梳子拉出以后，明明看不到加样孔中有凝胶，但是就是加不进去样品，这主要是由于梳子与较大的那块玻璃之间的缝隙中存留的制胶溶液凝聚后形成的很薄的一层凝胶造成的。由于很薄，当梳子拉出后，它就会和玻璃分离，刚好将加样孔的口封住了，如果用20ul的加样器加样的话，这层凝胶很容易将样品堵在外面，只要将这层凝胶除去，就可以顺利加样了。如果用专门的微量进样器，不会存在这样的问题。 5）薄膜原因可能是由于梳子和 slide的厚度不是十分一致，而这可能是无法避免的。除此之外，也有由于拔出梳子时候造成的堵塞现象，个人认为，这样的堵塞现象可以通过插入梳子时先用水（配置电泳缓冲液的水）湿润梳子的方法避免，这样还有利于形成整齐的加样孔。不管怎么做，一定要等胶完全聚合好了再拉出梳子。 如果孔的形状变化了，扭曲了，肯定会导致条带不一致，结果不好。 6）wangjun2002274 主任的：加样的时候也是用专门的微量进样器，是宁波出的，50ul容量，每次都是用20ul的上样量。以前等胶干后拔出梳子，马上用水冲洗进样孔，就是用的那种塑料瓶挤压冲洗，薄膜就没有了，注意不要用力过猛，如果胶还没有完全凝，很可能导致进样孔不整齐，那么跑出来的条带就有窄有宽了 将变性的和不变性蛋白同时加样，相同浓度的抗体反应后，不变性的条带也可见，但明显较弱。其原因，查资料后认为蛋白的某些抗原性被其天然的结构所掩盖，通过蛋白变性可使其抗原表位暴露。而且，现在的抗体都是用细菌表达的某段融合蛋白并且变性后来诱导产生的血清，与体内真正的蛋白有区别的，因此需要通过煮沸来变性体内蛋白，暴露需要的抗原部位。SDS主要为统一不同蛋白的电荷，去除其对电泳迁移率的影响。 一抗孵育：分别与相应的抗体（初次做建议按照试剂要求的最高浓度开始，别舍不得，否则没结果更难受），及内参照抗体（β-actin抗体1:10 000，这蛋白抗体效价特别高，所以预实验做一下一般会有阳性结果，一旦没条带可以排除你的实验操作中的因素）于室温温育90min，4℃过夜，再次室温温育60min。抗体稀释液为TBST（内含1%的BSA）（其实直接室温2h就够了，背景老是太高放4度过夜有时候对降低背景效果不错）。 19.漂洗：室温下以TBST液在平缓摇动条件下漂洗3次以上，每次各5min。勤换液比延长漂洗时间更有效。 显影定影完毕，要用自来水冲干净胶片，不划伤，晾干以后再收藏，很重要！否则粘糊糊的，很容易把你本来漂亮的条带给破坏了，这里出岔子就功亏一篑了！ 配胶准备：将玻璃板、梳子有清洁剂或稀酸泡洗，电泳装置用水冲洗并晾干，亦可用酒精棉球擦洗灌胶面晾干Western blot 的目的条带较为弥散是怎么回事_百度知道
Western blot 的目的条带较为弥散是怎么回事
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2。4. 蛋白质样品水解。注意除去蛋白质样品的内源性的水解酶，不要反复冻融、SDS都要新鲜配制。5. 电泳时间过长或过短。溴酚蓝达到分离胶的底部即应该关闭电泳电源. 避免加样过多。6. 低于10Kd的小分子蛋白质要用Tricine胶。3. 靠近前沿的电泳带分辨率不佳。7。根据分子量与凝胶孔径的关系。小体积样品可给出窄带，加样体积根据样品浓度和凝胶厚度灵活掌握。一般上样体积为10-15uL目的蛋白质条带模糊1，选择适当浓度的凝胶，提高分辨率. 缓冲溶液. 电泳凝胶浓度选择不当
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标题: western blot条带为何时有时无
摘要: [western blot条带为何时有时无] 求助最近开始做western 发现结果不是很稳定，我的跑的SDS电泳是6%的分离胶，4%的浓缩胶，样本蛋白总量在50ug，彩色marker标记，目的蛋白130kd电泳用150v，大概整个跑下来40分钟到1小时的样子，胶跑好后的转膜过程是：1
膜剪好后先在甲醇中浸泡10分钟左右， 2 铺“三明治”，转膜液用的是20%甲醛的，湿转 3 电泳和转膜用的都是biorad的机子，4 铺好后开始转膜，100 关键词:[转膜 电泳 条带 目的条带 目的蛋白 分离胶 甲醇]……
求助最近开始做western 发现结果不是很稳定，我的跑的SDS电泳是6%的分离胶，4%的浓缩胶，样本蛋白总量在50ug，彩色marker标记，目的蛋白130kd电泳用150v，大概整个跑下来40分钟到1小时的样子，胶跑好后的转膜过程是：1..膜剪好后先在甲醇中浸泡10分钟左右， 2.铺“三明治”，转膜液用的是20%甲醛的，湿转 3.电泳和转膜用的都是biorad的机子，4.铺好后开始转膜，100v 1小时，然后剪膜封闭，用的是碧云天的试剂，封闭2小时，一抗浓度1：300，SANTA CRUZ的多抗，二抗1：3000，现在苦恼的是开始做出过两次目的条带，但都比较淡细，参照做得很漂亮，后面一次什么都没有，一次参照actin很好，但是目的条带没有。考虑是不是转膜时间不够长，还是蛋白抗原量不够，增加蛋白量会不会好点。还有个问题是，我经常一块板做9个样本，但往往有些道会丢失掉，不知道是什么原因。小妹刚做不久，各位前辈多多指教
转移效率怎么样？转膜后可以用丽春红S染液染膜，看看目的蛋白位置有没有条带。大分子量蛋白的转膜缓冲液可以少加些甲醇甚至不加，加些SDS（0.375－1％），有利于大分子转膜（高含量甲醇利于小分子转膜）。可以试试低电压过夜转（50v或者60v，），转移效率可能好些。试试加大一抗浓度（可能会导致非特异条带增加）。或者做个斑点印迹（不用电泳和转膜，直接把蛋白样品点在膜上），找出比较合适的一抗和二抗浓度，也能试出比较合适的上样量。
做WB重要的是摸条件 条件摸好了 结果就容易出来了结果出不来的时候 别着急 一步一步找原因首先你跑完电泳了 可以用考马染个胶看看 以证明你提的蛋白没有问题然后转完摸后 用立春红染色 以证明蛋白是否从胶上成功转到摸上了如果这些没有问题 那以后电泳 转摸的条件就不要变了 摸摸一抗 二抗的浓度 首先还是从抗体的做小稀释比做 即从大浓度开始做尽管会出现非特异性条带 最起码条带出来了 然后再已不同的抗体稀释比做背景深了 可以加大封闭液的浓度和时间总之 试验是慢慢总结出来的 祝楼主试验顺利！！！
蛋白提取是好的，同样的蛋白做95kd的目的条带可以做出来，丽春红也染的，但是大条待的地方普遍比较淡，考马斯试剂没有，所以还没染过胶，浓度梯度做过，1：200的太浓，1：500，没染出来，才调到300
请问斑点印迹具体应该怎么做呢谢谢！
有没有人遇到过一次两块板一起做，一块结果还可以，另一块什么都没有呢？我的意思是同样电泳槽，同样的转膜，我常有这样的现象出现
是的，我的也是，经常同时跑两块胶，一起转膜，完了用丽春红染色，其中一张膜的条带就比较漂亮，一张就较差，应该是溶液在电离过程中浓度不均一的问题吧
是的，我的也是，经常同时跑两块胶，一起转膜，完了用丽春红染色，其中一张膜的条带就比较漂亮，一张就较差，应该是溶液在电离过程中浓度不均一的问题吧
有没有人遇到过一次两块板一起做，一块结果还可以，另一块什么都没有呢？我的意思是同样电泳槽，同样的转膜，我常有这样的现象出现有可能,因为BIO-RAD的转膜仪，转膜的两个胶的位置是不同的，为了达到相同的效果，我们在转膜中途将两块胶换一次位置。我们转膜一般是200mA*120min，转膜液不加SDS.
请教各位高手，染胶的考马斯亮蓝是什么比例配的，这种方法是不是可以确定胶上是否有目的条带？
请教各位高手，染胶的考马斯亮蓝是什么比例配的，这种方法是不是可以确定胶上是否有目的条带？
请教各位高手，染胶的考马斯亮蓝是什么比例配的，这种方法是不是可以确定胶上是否有目的条带？考马斯亮蓝R250 配方：R250：0.5g；甲醇：250ml；冰乙酸：100ml；定容500ml
又摸索了一周甲醛改为10% 反而只有白片增加转膜时间分别 为1.5小时和 2小时 actin 效果很好 但是目的条带还是没出来搞笑的是经常会有很浓的黑点 有时候还在marker附近 背景很干净 不知道出来的什么 用同一张膜做了另一个分子量为150的抗体可以做出来 那说明大分子条带还是能转过去的 考马斯亮蓝染胶也说明转膜没多大问题问：二抗推荐是驴抗羊 我用的是鼠抗羊 这个有没有问题？ 目的蛋白是icam家族的 提取蛋白时是否有什么特别要注意的地方 可以提高提取浓度？ 做出过一次 虽然背景比较高 但是条带还是能认清的 能都说明一抗没问题 郁闷了 下一步不知道怎么改进 呜呜大家有什么好办法 帮忙集思广益下 谢谢
感觉是你sample有问题。怀疑你提取过程中蛋白降解也许比较厉害。目的蛋白130KD应该算是比较大的蛋白了，电泳和转膜的电压不要太高，你用150v电泳太高了，建议用100v-120v左右，时间长些，1-2h。你那个150kd能做出来并不能代表这个130也一定可以，两种蛋白的表达量和稳定性你确定一样吗？
我想问一下β-actin42KD的转膜条件，不想过夜的那种，我以前用的是100MA，90min,但是DAB显色没有条带显出来，请指导一下
我想问一下β-actin42KD的转膜条件，不想过夜的那种，我以前用的是100MA，90min,但是DAB显色没有条带显出来，请指导一下我用半干转，按膜的面积算电流，一般一块胶一张膜26ma，1h就可以了
做了很多Western的实验，不出条带的原因主要从转膜、二抗和一抗考虑（按照重要性排序）。对于130kD的蛋白，转膜时间 100v 1小时是不够的，我们一般是110V，90分钟。LZ可以试试。其二，电泳时150 V ，电压太高。电压越低，蛋白条带分离效果越好。建议采用100V，多跑些时间，这样条带会更清晰。 建议LZ分析下二抗是否坏了。如果是好的，那么就是你 的一抗的问题。分为两个方向：1.浓度不对 2.一抗失效。而且你竟然把甲醛的浓度改为10％，这不是不能随便改的呀。转膜液20％浓度的甲醛是无数前辈验证过的，是最佳浓度。
我做的目标蛋白是45kd的用100v50分钟就转过去了，条带清晰，可以适当调整上样量，转膜液的配制不变
谢谢各位指导150的能转过去应该能说明我的转膜时间是充足的，因为sample用sds煮过，是不是说明蛋白的带电量和分子形状都统一化，差异比较小了，当然如果原本丰度不足的话是另讲 改变甲醛浓度主要是考虑分子比较大的缘故，当然这个尝试失败了，没有再试 用的二抗实验室的没人用过
考虑到我的蛋白是跨膜一次的膜蛋白，想是不是蛋白提取时溶解的比较少，重新换强裂解液再提，转膜1.5小时，其余条件不变，结果压片的时候发现整张膜都发亮，以前没出现这样的情况，不知道怎么解释电泳电压变小条带分的好不好能不能从marker判断啊？如果可以的话，我的marker芬德还是很漂亮的
我以前湿转都是30V过夜的。觉得很耽误时间，最近也想用高电压的湿转，大家能不能给点建议。我的分子量是220KD的。什么条件才能很好的转过去。
电泳先用60V跑20分钟过积层胶，然后90V跑到底；对于130kd的条带，100V转一小时肯定不够，可适当在转膜液中加SDS（1g/L），110V转两个半小时，电泳槽周围不加冰块，使转膜液温度在50°C左右最好。封闭用5%脱脂奶粉1小时就足够了；biorad的电泳槽靠近负极的那一张膜转的比较好，你可以先把靠近负极的那个三明治拿出来，靠近正极的再转20分钟效果最好。
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