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【求助】akt p-akt 能在一张膜上跑吗？
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这个帖子发布于10年零181天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我的实验需先培养心肌细胞做模后应用免疫印迹方法测akt p-akt 表达的变化。由于这两个蛋白的分子量很接近，我估计跑完后不能分开。。两个一抗怎样加啊？能不能在一张膜上同时显示两种蛋白，还是分别跑两张胶，分别转膜后再分别加一抗？有经验的战友请指教啊 ，急急 ！！
不知道邀请谁？试试他们
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我也准备作一种蛋白的磷酸化状态与总量的比值。我问过不少人，应该是在一张膜上先结合磷酸化的抗体，显色后洗膜，将磷酸化一抗二抗洗掉，然后再与总蛋白的一抗二抗孵育，再显色。关键就是这个洗膜的过程。祝实验顺利。
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有谁知道具体的步骤是怎样的哦 ？？急等待中！！
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首先要告诉你这是一个蛋白，不是两个蛋白，所以你打死它也分不开的。组织提取的蛋白作磷酸化的Akt应该还是很好做的，我没做过心肌细胞的，但是做过乳腺的。你根据文献配好lysis buffer，然后裂解，匀浆要充分；Western blot基本步骤，先做p-Akt, 然后strip buffer洗膜（这个配方你可以在dxy搜索一下就查得到），然后再在同一张膜上杂Akt的抗体。推荐使用Cell signal的抗体，santa的也做过，都还行吧，祝你顺利。
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关于丁香园已知我的蛋白质分子量很小，差不多在5KD以下，该怎样跑电泳啊？_百度知道
已知我的蛋白质分子量很小，差不多在5KD以下，该怎样跑电泳啊？
不用配非常高浓度的胶。你可以做Tricine-PAGE，对于分离小肽非常有效。
如果不用Tricine-SDS-PAGE这种方法，还有其他方法吗？
Tricine-PAGE是最适合的方法，你下游打算做什么实验？
主要是Tricine-PAGE比较麻烦，我从Thermo的网站上找到个关于小分子电泳的配方，比较简单，也做过几次，但是总是要出现溴酚蓝已经跑出去了，而样品才跑了一半。配方如下，分离胶：1.2ml乙二醇，3M tris-hcl PH8.45
1ml，40%丙烯酰胺1.8ml,40%AP4ul,Temed6ul.浓缩胶：3M tris-hcl PH8.45 0.5ml，40%丙烯酰胺250ul，RO水1.25，40%AP3ul，Temed8ul。还请帮忙分析一下。。。。
我想溴酚蓝跑出胶而你的样品还在胶里边儿影响不大，你无非是要目的带留下。你的意思是没有办法达到应有的分辨率吗？
因为样品中多数是20KD以下的蛋白，根本没怎么跑开，时间久了会跑弥散，还有我用的是200V恒压。
那你这个比较麻烦，选择小分子量的蛋白marker作为电泳参照确定电泳时间。另外样品可以做前处理，比如超滤一下，尽量减少其它蛋白对目的蛋白的干扰，这样结果会好一些。
点了marker的，5KD以下的也弥散了，也是只跑到了一半。
既然这种方法适用性不好为什么不考虑换用最稳妥的Tricine-PAGE呢？
因为我想搞懂这方法，看能不能进行优化。
从事生命科学研究没有什么比时间更宝贵的了。有成熟而又简单的方法你还是应该用，不然事后你一定会后悔的。
谢谢。。。
不用客气。
可以加您Q吗？以后可以多像您请教。
略知皮毛而已，何谈请教。倒是你自始至终都采用匿名的方式……
采纳率：44%
胶浓度配的高些，比如5% ==
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【专题讨论】成功过的战友讨论下，你曾经ＷＥＳＴＥＲＮ做不出来是那部分出问题了．
成功过的战友讨论下，你曾经ＷＥＳＴＥＲＮ做不出来是那部分出问题了．看看各部分出问题的几率，为还没有成功，仍然苦苦寻找结果的战友提供点参考（由于本人经验有限，不足之处还请斑竹和各位大侠改正）：1、蛋白提取问题，蛋白降解，或者上样量少导致检测失败。2、蛋白电泳失败。3、转膜问题：转膜不充分，过转，温度过高导致蛋白结构改变等。4、抗体问题。5、显影问题。6、其它。请战友提供各部分问题的主要说明和对策，谢谢！祝蛋白版越来越旺！大家来讨论，加分从优！抗体问题排在第一，抗体的特异性，一抗二抗的比例，这些都需要摸索条件。蛋白电泳第二，胶的配置，由于APS的失效，tris-Hcl PH不准，丙烯酰胺的氧化（以上问题一般都是配置时间较久以后）导致电泳失败或泳道奇形怪状。我认为western bloting 中蛋白提取是关键，最好用试剂盒提取，尤其目的蛋白是在亚细胞器表达的蛋白；其次是一抗二抗，一抗最好单克隆抗体，二抗国产好厂家的也行 ；ECL发光试剂一定要灵敏；制胶，电泳和转膜个实验室都做得比较常规了；显影定影按说明书作做活实验是经验就行。jiangyuqing123 wrote:大家来讨论，加分从优！偶不懂,特来支持,我做了很久的WB，最大的一个难点感觉在于样品制备上！蛋白的降解有些时候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全没事~~如果单独做WB的话，感觉以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loading buffer100度充分变性，再分装保存。有些时候比蛋白酶抑制剂更有效。另一个感觉就是样品中目的蛋白的量，限于WB的检测下限问题，一般目的蛋白量最好别低于1ng（虽然ECL法下限是0.1ng，即100pg），最好在10ng以上为好。这就要求在做WB之前必须充分考虑目的蛋白的可能丰度，最好充分的准备工作然后再设计细胞量或者组织量，千万别把样品搞稀了，否则就不好办了。最后，还是多看文献，在做某个蛋白之前最好看看别人是如何做的，有什么特殊要求，内参如何选等等。当然也包括多来学习~~：〉谢谢ryochan ＼renbo662008 ＼vagabondbond
＼gunzi 战友参与！大家继续！我也要做，但是不知道如何下手，那位能给一个详细的方法介绍我以前做的时候问题主要出现在样品的制备上，也就是如果免疫时用到的蛋白和wb时的蛋白有出入，这样就会导致wb失败，所以后来我就一次性制备足够的蛋白，可以不是很纯，但是一定要和免疫动物时候用的蛋白是同一批的。看到好几位战友都对蛋白制备有深刻的印象，也提醒我们正在WESTERN和准备WESTERN的战友，一定要注意过第一关，提出高质量的蛋白对实验成功至关重要！希望更多的战友参与！楼上几位战友提出的蛋白制备确实非常重要，但如果在裂解液中加入cocktail的话应该不容易降解，-80度保存几个月都没有问题。 我认为western blotting 中最关键的一步是转膜。我的经验是小分子量的蛋白半干转效果比较好，大分子量（100KD）以上建议湿转。具体转膜条件需要多摸一下。30-80KD半干转恒流1mA/cm2，1-1.5h 都可以，大分子湿转100V，2.5h以上应该可以，转完膜丽春红染出的条带比较清楚的话，一般都能有结果。抗体一般在其他问题排除后再考虑是否有质量问题。请教一下各位高手，我做WB时，总是内参能出来（有时条带不太完整），目的蛋白老是出不来可能是什么地方出问题？（蛋白应该没问题，同样的蛋白已经做出来几个指标了。）还有我转膜时一次转好几张，有的出来，有的出不来可能是什么原因？谢谢了！softwang wrote:请教一下各位高手，我做WB时，总是内参能出来（有时条带不太完整），目的蛋白老是出不来可能是什么地方出问题？（蛋白应该没问题，同样的蛋白已经做出来几个指标了。）还有我转膜时一次转好几张，有的出来，有的出不来可能是什么原因？谢谢了！softwang战友，内参一般比较好做，能出来说明整个WB的流程应该没有问题，提的蛋白也可以，但是目的蛋白由于分子量大小不一样可能电泳和转膜条件也不一样，还有蛋白丰度问题导致蛋白量低出检测范围、抗体等环节都应该考虑。具体的问题可以把你详细的条件另辟新贴求助，祝出结果！谢谢！细节地方一定要多注意，比如SDS－PAGE时的缓冲液pH值啊，temed、ap的新鲜程度啊，样品上样前的处理啊，还有转膜时的电压/电流、膜的处理，还有ECL时的抗体孵育时的时间与温度，显影/定影啊等等。其实一般出问题很多时候都是由于在细节地方的疏忽造成的。希望高手继续补充细节内容：）我就跑胶和转膜谈一点儿自己的体会1、跑胶 电泳Buffer重复利用的时候要注意，不能混浊，有时候能用个3－4次，有时候第二次都不行了，事先前预电泳一下，看看气泡的均匀度；Buffer一定要淹过梳子孔，否则就会发现今天的蛋白不会跑；跑的时候先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度，慢慢跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白；2、转膜 我用的是湿转，Buffer一定要预冷，最好提前一天配好放4度；滤纸不要大过PVDF膜，防止短路；胶在负极，膜靠近正极，放入Tank前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首；膜要标记好正反面；转膜过程中，经常过去看看，防止意外，如电泳仪接触不好。就这些了，请各位指正guohh1999 wrote:我就跑胶和转膜谈一点儿自己的体会1、跑胶 电泳Buffer重复利用的时候要注意，不能混浊，有时候能用个3－4次，有时候第二次都不行了，事先前预电泳一下，看看气泡的均匀度；Buffer一定要淹过梳子孔，否则就会发现今天的蛋白不会跑；跑的时候先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度，慢慢跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白；2、转膜 我用的是湿转，Buffer一定要预冷，最好提前一天配好放4度；滤纸不要大过PVDF膜，防止短路；胶在负极，膜靠近正极，放入Tank前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首；膜要标记好正反面；转膜过程中，经常过去看看，防止意外，如电泳仪接触不好。就这些了，请各位指正谢谢战友！我的感觉是电泳跑胶时buffer的利用，如果蛋白跑出胶外，那下次一定就要更换，如果没有的话还能用一两次．感谢haiyan8323
师姐、guohh1999 战友、shadowfly 战友的讨论！我想知道是不是第一次做都要失败呢？我是第一次作，作了3次，目前还没有成功。我发现跑胶的时候，有时候Marker会歪歪扭扭，转完膜（90V,4hr)后还有胶孔附近有残留，是不是没有转完全？另外，DAB染色和ECL那个好一点？如何操作？盼各位大侠给个意见。首先确定你的胶的浓度和离子强度没问题，如果胶不均匀Marker容易跑歪。转膜后看和你的蛋白分子量近似的预染Marker有没有转过去，如果marker没问题，那基本可以认为你的蛋白转过去了。显色的话应该ECL好些吧，灵敏度更高呢，HRP标记的二抗孵育完后用TBST充分清洗，然后加ECL试剂，包好后压片，一般如果你能够看到荧光的话，压片5min以内就可以看一下，如果看不见的话，直接压半小时吧。暗室仲压片，压片完后显影、定影、水洗，就可以了。做了几个月western了，总结下本人在western中遇见的一些问题：听过一个讲座，说是在抗体中加叠氮钠，可以在4度保存，避免抗体的反复冻融。结果我就犯错误了，二抗也加叠氮钠了，导致发光显不出条带，找原因找了一周，才知道叠氮钠能抑制HRP的活性。我所纯化的蛋白为未知蛋白，目前仅知其具有甘露糖结合的活性和分子量，想用WB的方法鉴定纯化出的蛋白是否具有结合甘露糖的能力。在实验的过程中一直得不到理想的结果，有两个问题请各位高手指教：1、不知在SDS-PAGE和WB的条件下，蛋白的糖结合活性是否可得以保存2、因为蛋白是未知的，所以没有抗体可用，我们用一种带有甘露糖基的BSA来代替抗体，并用10nm胶体金与之耦联作为显色之用。10nm胶体金之前一直用于电镜观察，不知可否用于WB的显色。请各位各个意见。我作WB，第一次：SDS-PAGE电泳都没跑出来，怀疑是蛋白降解了，但是后来同样的样品和别人一起又跑一次，就跑出来了，发现是配胶的问题。分离胶要用12％的。第二次：样品制备OK，浓度也测好了，电泳也跑得不错，PVDF膜不小心被手指划了一下，结果最后显影时候，显出来一个划痕。第三次：我的B-actin做出来了，但是我的目的条带怎么也不出来，同样的条件，同样的过程，试剂也一样，我师姐的就做出来了，可见不是试剂的问题，显影同样用的DAB，这次考虑是抗体的问题了。第四次：找公司换了抗体，果然ok了！谢谢饿，我以后要经常过来看看这些经验，真的感谢各位加油！本底过高：
（1）封闭不好。
（2） 一抗、二抗作用强度过高。
（3） 洗涤不充分。
对策包括：
a. 延长封闭时间；
b. 可调节一抗，二抗的稀释度，找到一个最佳浓度，使之能得到有效强度的信号，而非特异性的染色较低。
c. 充分洗涤，将未结合上的非特异性的抗体洗掉，可在缓冲液中加0.02-0.2%Tween20。 假阳性： 多数由抗体和有部分同源性的抗原间的交叉反应引起。主要解决办法是在保证阳性结果可见的前提下，尽可能高地提高抗体稀释度，使假阳性消失本底过高：
（1）封闭不好。
（2） 一抗、二抗作用强度过高。
（3） 洗涤不充分。
对策包括：
a. 延长封闭时间；
b. 可调节一抗，二抗的稀释度，找到一个最佳浓度，使之能得到有效强度的信号，而非特异性的染色较低。
c. 充分洗涤，将未结合上的非特异性的抗体洗掉，可在缓冲液中加0.02-0.2%Tween20。 假阳性： 多数由抗体和有部分同源性的抗原间的交叉反应引起。主要解决办法是在保证阳性结果可见的前提下，尽可能高地提高抗体稀释度，使假阳性消失我进实验室最先接触的就是WESTERN，我觉得首先要提出高质量的蛋白，然后一鼓作气往下做，不要放太久，即使－80度超过三个月结果也不太理想。新鲜的样品跑出来的条带很靓的。实验室的温度对制胶很重要，气温过低会使凝胶不均匀，一、二抗也孵不上去，夏天的时候，不到8个小时就可以做完一个WESTERN，现在就不行了。封闭液要保证有效。一、二抗比例要适当，不然即使高浓度也没用。转膜是个技术活，要耐心，但不是磨蹭。化学发光试剂要好。显影时间的控制和调整。另外注意一些细小问题，比如缓冲液不要加错，上样要尽快，电泳时电压不要太高，洗膜要充分等，有时候往往会犯一些及其可笑的错误。如果胶中有小的裂隙，对转膜有影响吗？我最近一直在做，可是碰见一下问题向高手们请教，希望提点改正意见：1
转膜时，多次出现小分子量的转膜效果不如中分子和大分子量的（用的彩虹MARKER，但14KD的亮黄色的条带仍然在胶上，转膜后的胶染色后小分子量区域的蛋白残留较多。在整张和将不同区域的分别转膜时均出现这种情况。）2
在暗室里肉眼可以看见发光，可是胶片上一无所有。3
ECL没有表达，可是用DAB时膜上却出现条带。4
手工显影时，胶片的显影时间和温度有很大关系吗？显影的时间掌握如何比较恰当？我最近做WB，为了更进一步证实我的目的蛋白，我加了标准品，但也许是我的目的蛋白表达量太少，所以曝光总是很弱，甚至没有，但每回都能将标准蛋白曝光到片子上。另我感到奇怪 的是，每次我曝光后再将膜用丽春红染色，标准蛋白在膜上几乎看不见，但对应的位置却可以看见明显的条带。所以我想问一下各位高手，是否我看到与标准蛋白对应位置的明显条带其实是很多种蛋白的混合物，也许没有我所要的目的蛋白，或者即使有，也是非常少，少得不足以可以曝光在片子上。还有一个问题，如果目的蛋白表达很好的话，加大抗体浓度有用吗?实验很着急，希望尽快回复。多谢了！！！新话题：考染胶有目的条带、丽春红染膜有条带和压片有条带这三者之间有什么必然的联系吗？请根据大家的经验谈谈。haiyan8323 wrote:新话题：考染胶有目的条带、丽春红染膜有条带和压片有条带这三者之间有什么必然的联系吗？请根据大家的经验谈谈。考染胶有目的条带：说明你的样品中有你要检测的蛋白。丽春红染膜有条带：说明你的目的蛋白已经成功转移到膜上（有没有完全就不一定，可能也没有必要知道，一定要检查，或者丽春红没有条带，可以将电转后的胶再考染）。压片有条带：目的蛋白与抗体有特异性反应。由于检测限是western&考染&丽春红，所以丽春红有条带则考染，压片也应该有，反之则不一定。再说说我的一些体会。电转开始，有许多战友会提到短路问题，我觉得从理论到实践都说不通。首先，整块胶都被导电的buffer包围，何来通路、短路？其次，我，包括我们实验室其他人，从来没有按胶的尺寸来剪膜和滤纸。我的做法是剪一块比胶略大的膜（不便宜，省着点用），滤纸则可以同夹板一样大小，干的、湿的从来没有出现过问题。气泡是最主要的问题，最好将夹胶、膜的操作在buffer液面下进行。电转buffer最好不要太小气，用3-4次就该换了，反正也不贵，配也简单。丽春红没有必要每次用，一般电转没有问题。一抗要是血清的话，可以四℃过夜。二抗按说明书来基本没有问题。ECL显色后，尽量将显色液除尽，可以将膜封入一次性手套（封三边，留一边），用吸水纸使劲擦，再封好压片。要是对曝光时间没有把握，可以一次叠两张胶片，相当于做个梯度。不当之处望各位指正。楼上说的太好了，谢谢！！求教各位高手，最近我的Western blot经常是出来干干净净，什么都没有，成功率低。经过SDS－PAGE胶考马斯亮蓝染色，证明电泳没有问题，蛋白也没有降解。用正对照蛋白做点杂交也证明一抗，二抗以及发色系统没有问题。疑点就集中在转膜过程上，因为之前试验正对照蛋白（30KD）的时候用的转膜用的厚吸水纸用完了（“三明治”两侧各一张），换成了薄的滤纸（两侧各三张），自从换了这个以后就一直有问题了，即使正对照也很难做出来。我用的是湿转法，转膜buffer同《分子克隆》上：48mM Tris，39mM 甘氨酸，20％甲醇，0.0375%SDS，转膜条件：4度，200mA稳流一小时，我的蛋白比较大，73KD，这个条件是否合适？转膜结束之后将胶用考马斯亮蓝染色，干干净净，说明已经转走了，将PVDF膜用丽春红染色，也什么也看不到，感觉不太可能转过头，因为之前30KD的蛋白用这个条件也可以的。最近我又将转膜buffer的甲醇比例下调到15％，其他条件相同。结果也是一样失望，各位有什么建议么？
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