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《分子生物学》复习资料 15849字 投稿：罗诫诬
分子生物学 “95%疾病产生的原因源自基因的无序表达。”分子生物学的意义，就是消除疾病。 第一章 绪论分子生物学研究：核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。1861年，孟德尔的豌豆杂交试验揭示遗传的物质性（性状表征）1909年，Wilhelm Ludvig Johannsen使用“基因”代表遗传学最基本单位。1910年，Morgan（美）通过果蝇实验证明：基因遗传性状分离，基因连锁交换现象。 1928年，Griffith（英）肺炎双球菌转化实验。10年后，Avery（美）证明DNA分子是遗传3235信息的有效载体。P标记核苷酸，S标记氨基酸。噬菌体侵染过程：1尾端吸附，2 DNA注入，3利用细菌生命过程合成自身物质，4合成新DNA和蛋白质，并组装为新子代噬菌体，5细菌裂解，噬菌体释放。1953年，Watson和Crick提出脱氧核糖核苷酸的双螺旋膜型。1958年，Crick提出中心法则。基因表达调控主要表现：信号转导、转录因子、RNA剪辑。基因组：人体全部基因总和。蛋白组：人体全部蛋白总和基因组计划：人体全部基因序列测序。蛋白组计划（后基因组计划）：鉴定基因产物和功能。 第二章 染色体与DNA真核细胞染色体蛋白质组成：组蛋白（染色体结构蛋白，组成核小体）、非组蛋白（RNA聚合酶、肌动蛋白、肌球蛋白、微管蛋白）组蛋白特点：1进化上的极端保守性。2无组织特异性。3肽链上氨基酸分布不对称。4具有修饰作用：甲基化、磷酸化5富含赖氨酸的组蛋白H5真核生物基因组DNA分类：1不重复序列：结构基因基本为单拷贝基因2中都重复序列：3高度重复序列：只在真核生物内出现，不转录。包含：卫星DNA、反相重叠序列（互补序列重复）、较复杂单位的重复（灵长类特有）DNA包装步骤：1核小体的组成：组蛋白+200bp DNA。·核小体组蛋白：H2A、H2B、H3、H4各两分子生成的八聚体，并伴有H1在核小体在外边，直径10nm。2将200bp的DNA分子（2nm）缠绕在核小体外，从68nm压缩到10nm中，压缩率1/7 3六个核小体形成一个螺线管，压缩率1/6，直径30nm4螺线管形成超螺线管，压缩率1/40，直径4000nm5超螺线管形成染色单体，压缩率1/5原核生物基因组特点：1结构简单2存在转录单元3有重叠基因DNA的一级结构：四种核苷酸的连接排列顺序。DNA的二级结构：两条多核苷酸链反相平行盘绕所成的双螺旋结构。DNA的高级结构：多数为双链DNA，少数为单链；形成超螺旋，构成质粒B-DNA构象特点：1 A-T丰富的DNA片段常呈B-DNA构型2脱氧核苷酸在外侧，碱基在内侧3链间形成的有螺旋状凹槽构成：大沟、小沟（沟用来接收Pr 的结合）4相邻碱基对平面间距0.34nm，结构重复周期3.4nm，双螺旋直径2.0nm5磷酸二脂键链接核苷酸6脱氧核糖环平面基本与纵轴大致平行A-DNA构象：DNA模板链与转录所得RNA链间形成的双链，双链RNA之间形成的构象也是A-DNA构象.Z-DNA构象特点：1 12个碱基一圈，比A构型紧2只有一个螺旋沟，难于蛋白质结合3重复的结构式二核苷酸4碱基不再中央，外圈的碱基难被化学物质结合识别意义：用于调控基因转录，Z构型变为B构型，可以使得近端区域活化转录；使得远端基因转录停止。DNA的复制：步骤：1解链：DNA链改变构象，从复制叉开始解链，此为DNA复制的起点2拓扑：防止超螺旋3单链结合蛋白（SSB）结合单链DNA：4引物结合：RNA引物提供3`-OH末端5 DNA聚合酶：去掉结合蛋白，切除RNA引物6滑动夹：推动DNA聚合酶前进7 DNA连接原料：1拓扑异构酶、2解旋酶、3单链结合蛋白（SSB）、4引物合成酶、5 DNA聚合酶3（复制链）、6 DNA聚合酶1（切引物）、7连接酶、8 dNTP、9 RNA引物（含3`-OH末端）DNA半保留复制：每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链来自新和成的。DNA半不连续复制：DNA复制时，双链解开，SSB和DNA聚合酶3共同作用合成前导链随复制叉前进（5`端→3`端）；另一条后随链的复制由RNA引物开始一个片段一个片段的复制（5`端→3`端），形成众多冈崎片段，之后切除引物，用DNA连接酶连接断开的单链。 原核生物DNA复制特点：1形成复制起始复合物，识别复制区前的保守序列2拓扑异构酶1作用下解链，SSB稳定解开的单链原核生物DNA聚合酶分类：DNA聚合酶1：具有5`→3`核酸外切酶的特点，切除RNA引物DNA聚合酶2：矫正作用DNA聚合酶3：使链延长的主要酶真核生物DNA复制特点：1以dNTP为底物2需要Mg2+的激活3同时需要模板链、具有3`-OH末端RNA引物链DNA损伤：自发性：碱基配对错误物理因素：紫外线、电离辐射化学因素：烷化剂、碱基类似物DNA修复：错配系统：保存母链，修正子链。识别新合成链中的错配并校正DNA子链。切除修复：·碱基切除修复：切除AP位点(存在于DNA链上的去嘌呤或去嘧啶位点)两端的磷酸二酯键，换上相应的核苷酸。·核苷酸切除修复：切除无法形成氢键的核苷酸。重组修复（复制后修复）：对于在复制前未修复的区段，先进行新链合成（损伤区域核苷酸缺失），再将同源母链上的相应区段切下，移至子链上，再用新合成的序列修补母链。光修复（直接修复）：将损伤的碱基回复到初始状态的修复方式。（DNA光解酶）SOS机制：一种不得已的修复方式，在DNA大量损伤的情况，进行短时间高效的随机配对的一种低保真度修复方式。转座子：存在于染色体DNA上的可自主复制和移位的基本单位。分类：插入序列、复合型转座子。以及复制型和非复制型。玉米中的控制因子：Ac-Ds系统（激活-解离系统）：Ac能够自主转座，形成不稳定基因突变，使Ds因子活化、转座。Ds属于非自主因子，解离因子，当Ac存在时导致附近结构基因失活和表达水平的变化。端粒（Telomere）：在染色体末端的DNA和蛋白质的复合物。在染色体复制时，后随链上缩短产生染色体部分缺失的部分。端粒酶：防止染色体复制时，后随链缩短产生染色体部分缺失的酶。维持DNA螺旋的稳定力：碱基堆积力、H键、盐键（离子键）9-9人体总DNA链长度：3×10×0.34×10=1.02mC值：一种生物单倍体基因组DNA总量。C值谬误：C值往往与种系进化的复杂程度不同，某些低等生物往往具有很大的C值。 DNA指纹：DNA重复片段的重复次数。多基因家族：某些祖先基因多次重复（一种基因多种拷贝）和变异（多种基因共同编码蛋白）而产生的一组基因。 第三章 生物信息的传递（上）——从DNA到RNA基因表达：转录（拷贝出一条与DNA链序列完全相同的RNA单链）和翻译（将核苷酸三联遗传密码翻译成氨基酸、合成多肽的过程）。编码链：与mRNA序列相同的那条DNA单链。模板链：根据碱基互补配对原则，直接指导mRNA合成的DNA单链。模板链、编码链相对于一段基因而言；模板链和编码链区段在DNA链上相互交替 RNA转录的基本过程：模板识别、转录起始、通过启动子、转录的延伸、转录终止。1模板识别：RNA聚合酶与启动子DNA双链结合，转录起始复合物（PIC）的形成2转录起始（第一个RNA核苷酸键的产生，AUG）：启动子附近双链解旋、解链，形成转录泡，促进底物核糖核苷酸与DNA模板链配对3 RNA的延伸：新生RNA链达到6～9核苷酸，形成稳定的酶-DNA-RNA三元复合物，释放ζ因子，进入延伸期，核心酶沿DNA模板链移动产生RNA链，并不断延长4转录终止（UAA、UGA、UAG）：转录泡瓦解，新的磷酸二酯键不再形成，RNA聚合酶、RNA链从模板链上被释放RNA转录的特点：1无需RNA引物2须有ζ因子存在3解旋为单链原核生物的RNA聚合酶：RNA聚合酶α：决定被转录基因RNA聚合酶β：共同形成RNA合成的活性中心，结合底物，形成磷酸二酯键RNA聚合酶β`：结合模板，解链真核生物的RNA聚合酶：RNA聚合酶1：转录产物rRNARNA聚合酶2：转录产物hnRNA，经过剪切加工成为mRNARNA聚合酶3：转录产物tRNA启动子：基因转录起始所必需的一段DNA序列，确保转录精确起始，是基因表达调控的上游顺式作用元件之一。终止子：分为不依赖ρ因子和依赖于ρ因子两大类。RNA的功能：蛋白质翻译、遗传物质、RNA酶类、调控分子基因产物：mRNA（→蛋白质）、tRNA、rRNAhnRNA：核不均一RNA，DNA直接转录的产物原核生物mRNA特点：1半衰期短2可能以多顺反子形式存在3 mRNA的5`端无帽子结构，3`端没有或只有较短的polyA结构真核生物mRNA特点：1 mRNA的5`端存在“帽子”结构（甲基化鸟嘌呤）2绝大多数真核生物mRNA具有多聚A尾巴“帽子”结构作用：1有助于翻译的开始：与核糖体小亚基相结合2保护mRNA不被降解，半衰期长3成熟产物运输过程中的必需物质4促进转录多聚腺苷酸尾巴作用：1穿过核膜所必须的部分2提高mRNA的稳定性3与翻译有关hnRNA的剪切、编辑、修饰：1加帽2加尾3内含子剪切4外显子选择性剪切RNA的编辑：一种mRNA前体的加工方式——插入、删除、取代，导致DNA所编码的遗传信息的改变。核酶：一类具有催化功能的RNA分子，通过催化RNA链中磷酸二酯键的断裂，特异性剪切底物RNA分子，从而断裂基因的表达。分为：剪切型核酶、剪接型核酶。 第四章 生物信息的传递（下）——从mRNA到蛋白质密码子：mRNA上梅3个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸。遗传密码的特点：连续性、简并性（一个氨基酸有多个密码子）、通用性、密码子和反密码子相互作用同义密码子：一种以上密码子编码同一种氨基酸。摆动假说：密码子和反密码子配对中，三个碱基的前两个严格遵守配对原则，第三个碱基有一定的自由度。tRNA的L形状的三级结构tRNA的种类：1起始tRNA：原核生物起始tRNA携带甲酰甲硫氨酸（fMet），真核生物起始tRNA携带甲硫氨酸（Met）2同工tRNA3校正tRNA无义突变：蛋白质合成提前终止（合成UAG、UGA、UAA），合成无功能的多肽。错义突变：结构基因中某个核苷酸变化，使得一种氨基酸的密码变成另一种氨基酸的密码。核糖体RNA（rRNA）：5SrRNA：与tRNA相互识别，与50S核糖体大亚基有相互识别位点Met23SrRNA：能与tRNA相互识别的位点5.8SrRNA：真核生物核糖体特有的rRNA，与5SrRNA有相同作用人类rRNA组成：28SrRNA、18SrRNA、5SrRNA、5.8SrRNA（按照电泳速度慢→快） 核糖体上的位点：1）与5SrRNA结合位点2）与16 SrRNA结合位点3）肽基转移酶结合位点·三个RNA结合位点：4）A位点：新的氨酰-tRNA结合位点5）P位点：氨酰-tRNA结合位点6）E位点：释放tRNA位点原核生物翻译的起始：1 30SrRNA和50SrRNA相分离2 30S小亚基先与mRNA模板相结合（需要识别SD序列）Met3 30S小亚基再与fMet-tRNA（甲酰甲硫氨酸-氨酰tRNA）结合4 30S小亚基与50S大亚基结合真核生物翻译的起始：1 40SrRNA与60SrRNA相分离Met2 40S小亚基首先与fMet-tRNA结合3 40S小亚基mRNA模板相结合（无需识别SD序列）Met4 40S小亚基与60 S大亚基结合成80S·mRNA·Met-tRNA起始复合物蛋白质转运机制：翻译-转运同步机制运输：内质网膜核糖体（分泌蛋白：免疫球蛋白、水解酶、激素） 翻译后运转机制运输：游离核糖体（细胞器发育：叶绿体、线粒体、过氧化物酶） （膜的形成，二者均有） 第五章 分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术重组DNA技术：按照人的意愿，在体外对DNA进行重组，通过导入细胞的分子，并能大量扩增和繁殖。意义：生物间的物种距离可以跨越，实现新物种，产生大量产物。核心：使用限制性内切核酸酶——识别DNA上特定碱基序列并从此位点切开DNA分子。 EcoR1：G↓AATTC步骤：1获得目的基因和载体2切割、连接新的重组DNA分子3重组DNA分子导入受体细胞，并在细胞中复制遗传4对转化子筛选和鉴定5获得培养表达产物基因操作包括：DNA分子切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析、基因的人工合成、定点突变、PCR扩增。分子进入细胞的方式：微注射、病毒注入、CaCl2热激冷冻法影响凝胶电泳的外界因素：1电场强度：70～75，强度越大，带点数越多，泳动越慢2电溶液PH值3离子强度4电渗现象5稳定6支持物性质DNA构型对于电泳阻力的影响：开环双链DNA＜直线DNA（开链）＜共价闭环DNA（超螺旋） 细菌转化：一种细菌菌株由于捕获来自供体菌株的DNA而导致性状发生可遗传性改变的过程。CaCl2法是制备大肠杆菌感受态（或许DNA能力增强的状态）最常用的化学方法。 聚合酶链式反应技术（PCR）：原料：模板DNA、PCR引物、dNTP、Mg2+（保真）、DNA聚合酶方法： 1高温变性（解链）：94℃，5S2低温退火（引物与模板DNA结合）：50℃，3适温延续（DNA合成）：72℃，实时定量PCR：利用带荧光检测的PCR仪对整个PCR过程中扩增的DNA积累速率绘制动态变化图，消除在测定最终产物丰度时的较大偏差问题。染料： SYBR Green 1（非特异性，检测PCR反应中的全部双链DNA）TapMan探针（一端是短波长的荧光基因，一段目的DNA特异的碱基序列、另一端是长波长荧光基因。两荧光基因俱在时，荧光猝灭；而当短波长的荧光基因单独存在时，在激发光下产生绿色荧光）Ct值：产物荧光强度首次超过设定阈值，PCR反应所需的循环数。基因组DNA文库：把某种生物的基因组全部DNA序列切成适当大小，分别与运载体组合，导入微生物细胞，形成克隆，而克隆片段的总汇成为基因组DNA文库。RNA浓度测定：通过OD260和OD来测定280，值在1.8～2.0显示DNA纯度较好，如有蛋白质或酚污染则明显低于1.8。cDNA：依据mRNA在体外反转录合成的双链DNA，不含内含子。在cDNA合成中，应选用活性较高的反转录酶级甲基化dCTP。核酸杂交：用放射性特异DNA探针用于高密度的菌落杂交筛选。是基因文库筛选中最常用的一种方法。SNP（单核苷酸多态性）：指基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。cSNP（基因编码区SNP）分为：同义cSNP、非同义cSNPSNP检测技术：基因芯片技术、Taqman技术、分子信标技术、焦磷酸测序法。SNP的应用：人类基因单体型图绘制、疾病易感基因的相关性分析、用药药物设计 RACE技术（DNA末端快速克隆技术）：在已知cDNA序列后，克隆5`端或3`端缺失序列的技术cDNA差示分析法：通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头的方法，特异性扩增目的基因片段。基因图位克隆法：分离未知性状目的基因的方法。 蛋白组学：一个细胞或单一组织所表达的全部蛋白质的集合。意义：1揭示生命现象和本质，2疾病治疗和诊断，3药物基因组研究，4药物靶点筛选 蛋白组多样性：1种类数量多样性，2生理和病理状况，3不同个体时期研究内容：1表达蛋白组学，2结构蛋白组学，3细胞图谱蛋白组学，4功能蛋白组学 双向电泳技术：结合了等电聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝胶双向电泳，根据等电点和相对分子量来分离蛋白质。蛋白质印迹法（Western blotting）：依据被测蛋白能与特异性抗体结合的特性，测量蛋白质的相对分子质量。蛋白质的质谱分子技术：超敏性检测蛋白质质量的技术。分类：基质辅助的激光解析电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF）、电喷雾质谱（ESI-MS） 第六章 分子生物学研究法（下）——基因功能研究技术基因表达系列分析技术（SAGE）：任何长度超过9～10个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物，经过特定酶切的9～10个碱基的核苷酸片段在克隆测序后，根据占总片段的比例，可对应分析出编码基因的表达频率。原位杂交（ISH）：用标记的特异性核酸探针，与被固定组织切片反应，从而对相应基因表达产物在细胞水平上作出定性定量分析。定点突变：通过改变基因特定位点核苷酸序列，而改变编码蛋白质的氨基酸序列，用于研究特定氨基酸残基对蛋白质结构、催化活性、配体结合能力的影响。重叠引物扩增发：模板DNA分别于正反向引物对退火，得到在一侧有部分序列互补的两种靶基因片段，之后将靶基因片段于互补区段退火，形成完整长度的DNA双链。基因敲除（基因打靶）：通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传的特点。分类：1完全基因敲除：通过同源重组法完全敲出细胞或动物个体中的靶基因。2条件型基因敲除：通过定位基因系统实现特定时间和空间基因敲除。高等动物基因敲除的技术路线：1构建重组基因载体2用电穿孔、显微注射方法将重组DNA分子导入胚胎干细胞纯系中酵母单杂交系统：用于研究DNA-蛋白质之间的相互作用。酵母双杂交系统：利用真核生物转录调控因子的组件式结构特征，进行DNA-蛋白质之间的相互作用的研究。组件式结构特征：DNA结构域——BD，转录活性结构域——AD酵母双杂交系统步骤：（BD部分）1用基因重组技术，将编码已知蛋白的DNA序列连接到酵母转录操控因子的BD编码区的表达载体上。2导入酵母细胞，表达含有DNA结合结构域的杂合蛋白质。3杂合蛋白质与“报告基因”上游的转录激活子结合位点结合。（AD部分）4 AD编码区与cDNA文库中不同插入片段相连接。5导入酵母细胞，表达相应蛋白质。6含BD与AD结构域的蛋白质相结合，激活“报告基因”表达。RNA干扰基因沉默技术：RNAi（RNA干涉）技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。步骤：1 外源dsRNA（双链RNA）导入稀薄2 Dicer酶切dsRNA形成siRNA（小分子干扰RNA）3 siRNA的反义链指导合成RISC（沉默复合体）4 RISC酶切目的mRNA中与siRNA反义链互补区段，实现干扰基因沉默基因芯片：是一种能够快速精确研究生物基因组信息的装置。制备步骤：1将序列DNA在玻片上固化2用DNA杂交技术将芯片与cDNA杂交3经过计算机扫面处理数据，用来分析基因表达调控情况基因芯片分类：1 Expression ships（表达谱）2 Gnomic chips（基因谱=表达谱+非表达谱）3 Sequencing chips（测序、功能）基因芯片发展：1 Southern Blot2 Dot Blot3 Macroarray4 Microarray噬菌体展示技术：使用基因表达产物与亲和选择相结合的技术，将编码“诱饵”蛋白的DNA片段插入噬菌体基因组，并与之合噬菌体壳蛋白编码基因结合。最终通过富集噬菌体外壳，得到大量靶基因的表达产物。此法应用于抗体、疫苗的制备。 第七章 基因的表达与调控（上）——原核基因表达调控模式基因表达：DNA分子能有序地将自身所承载的遗传信息，转变为蛋白质或功能RNA分子，执行各种生理生化功能，完成生命全过程。基因表达时间特异性：按功能需要，基因表达严格按照时间顺序进行。基因表达空间特异性：在个体生长的全过程中，基因产物在个体不同组织空间顺序出现。 基因表达调控：对基因表达的调控。（分为组成性表达、适应性表达）组成性表达：不大受环境变化而变化的一类基因，在一个机体全部细胞中持续表达，属于管家基因。适应性表达：在环境条件的变化下，易受波动的一类基因表达。分类：转录水平调控、转录后水平调控（mRNA加工成熟水平的调控、翻译水平上的调控）原核基因调控分类：负转录调控、正转录调控·负转录调控（负控）：没有调节蛋白（阻遏蛋白）存在时基因是开启的, 加入调节蛋白（阻遏蛋白）之后，基因活性被关闭·正转录调控（正控）：没有调节蛋白（激活蛋白）存在时基因是关闭的，加入调节蛋白（激活蛋白）之后，基因活性被开启四种转录调控体系：1负控诱导：有活性的阻遏蛋白与诱导因子结合形成无活性（复合物）阻遏蛋白，在不结合操纵子后，基因表达被开启。2正控诱导：非活性的激活蛋白与诱导因子结合形成有活性（复合物）激活蛋白，在结合操纵子后，基因表达被开启。3负控阻遏：基因本身自表达，非活性阻遏蛋白在共阻遏蛋白结合后，形成的（复合物）阻遏蛋白结合操纵子后，基因转录被阻遏。4正控阻遏：基因本身自表达，有活性激活蛋白被共阻遏蛋白结合后，形成的（复合物）激活蛋白结合操纵子后，基因转录被阻遏。ζ32因子：热休克蛋白基因表达调控。原核基因调控的主要特点：可诱导调节：指一些基因在特殊的代谢物的或化合物的作用下，由原来关闭状态转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。可阻遏调节：由于特殊代谢产物化合物结合的作用，使得生产蛋白质或酶的基因被关闭。 （可阻遏基因：某一代谢途径最终产物合成酶的基因可以被这个代谢本身所关闭。） 细菌应急反应：实施应急反应的信号是——鸟苷四磷酸（ppGpp）、鸟苷五磷酸（pppGpp） 操纵子：基因表达、操纵的基本单位，包含：调节基因、操纵基因、结构基因。（操纵基因收到调节基因产物的控制）乳糖操（lac）纵子：乳糖操纵子真正的诱导物——异构乳糖（别乳糖）。乳糖操正控机制：1葡萄糖存在时，cAMPase具有活性，形成cAMP-CRP复合物，转录因子有活性，基因开启。2无葡萄糖时，葡萄糖代谢产物抑制cAMPase活性，基因开启受到抑制。本底水平表达：非诱导状态下，有少量的lacmRNA酶（乳糖mRNA酶）的合成。代谢物阻遏效应：葡萄糖的某些代谢产物抑制了lacmRNA的合成，使得细菌无法分解半乳糖。大肠杆菌乳糖操纵子受控过程：1葡萄糖、半乳糖同时存在，细菌的生长呈现出2次曲线，cAMP的表达为1次曲线 2只有葡萄糖时，葡萄糖代谢产物抑制cAMP酶的活性，cAMP不表达，没有cAMP-CRP的结合，lacmRNA无法合成，基因不表达。3只有半乳糖是，cANP酶表达，cAMP量增加，cAMP-CRP复合物与启动子结合，lacmRNA合成，基因表达。4二者皆无，基因不表达。色氨酸（trp）操纵子（弱化子模型）：在低色氨酸含量情况下，核糖体缓慢经过两个AUG，导致mRNA前导区3、4区互补配对（形成发夹结构），形成抗终止子构型，有利于色氨酸生产基因的转录；在高色氨酸含量情况下，核糖体快速通过两个AUG，mRNA前导区2、3区互补配对（形成发夹结构）终止转录，色氨酸生产相关基因被关闭。原因：阻遏物从有活性向无活性转变速度较慢，而弱化子模型能更为快速地做出反应。而阻遏物系统依旧存在作用是，在有大量外源色氨酸存在时阻止非必须的先导mRNA的合成，是的合成更为经济。弱化子：可导致DNA转录过早终止的一段DNA序列。半乳糖（gal）操纵子：半乳糖操纵子存在两个转录起始位点，因为半乳糖除作为唯一碳源供细胞生长，且是大肠杆菌胞壁合成前尿苷二磷酸的重要关联物，但由于胞壁合成过程中对半乳糖需求量少，本底水平足矣。于是存在了一个依赖于cAMP-CRP的启动子用于高水平调节，和一个不依赖于cAMP-CRP的启动子用于本底水平调节。阻遏蛋白LexA的降解与细菌中的SOS应答：由于参与SOS机制修复DNA的基因分在染色体的各个部位，不过被阻遏蛋白LexA阻遏，于是SOS体系的诱导表达过程本质为，将LexA阻遏蛋白从这些基因上游的调控区域移开。recA表达RecA蛋白单体结合DNA受损单链，形成具有蛋白酶活性的复合物，进而将阻遏蛋白LexA失活，开启SOS修复系统。大部分信号系统使用二组分调控系统和信号转导：外部信号通过传感器（胞膜上的传感蛋白，组分一）后，再由磷酸化的应答调节蛋白（激活蛋白、阻遏蛋白，组分二）来对操纵子作用，调控下游基因。 转录水平上的其他调控方式：ζ因子调节作用：用于识别不同的启动，可以收到温度的影响。 组蛋白类似蛋白调节作用：维稳基因，维持DNA的高级结构。 转录调控因子作用：即阻遏蛋白、激活蛋白与启动子结合。抗终止子调节作用：ζ因子与抗终止子（NusA）先后结合RNA聚合酶，使得转录能通过开始的识别位点和之后的终止位点。 RBS：核糖体结合位点 SD序列：位于密码子AUG上游的一段AGGAGG序列，被核糖体16S小亚基识别、结合的序列。 转录后调控：在转录mRNA之后，对翻译、翻译后水平的调节方式。1 mRNA自身结构：SD序列与AUG间距影响翻译的起始mRNA的结合难易程度 2 mRNA稳定性：核糖体酶降解mRNA的难易程度 3调节蛋白：调节蛋白与核糖体竞争结合RNA4反义RNA：反义RNA结合相应mRNA，阻止mRNA翻译5稀有密码子：稀有密码子的大量使用，减弱mRNA的翻译效率 6重叠基因：表达产物在数量上的统一 7翻译的阻遏：复制酶阻止核糖体的结合 8魔斑核苷酸第八章 基因的表达与调控（下）——真核基因表达调控一般规律原核生物主要采用转录调控，环境因子往往是调控的诱导物。真核生物主要采用瞬时调控（可逆性调控）和发育调控（不可逆性调控）。基因调控在同一事件中发生的先后顺序：转录水平调控、转录后水平调控。转录后水平调控分为：RNA加工成熟过程调控、翻译水平调控、蛋白质加工水平调控。 真核生物基因结构与转录活性：1一条成熟的mRNA只能翻译一条多肽链（亚基、蛋白质），没有多基因操纵子。 2真核细胞DNA与组蛋白和非组蛋白结合，只有小部分DNA是裸露的。3高等真核细胞DNA中有许多部分不转录，某些DNA序列重复出现上百次，真核细胞基因中还有内含子。4真核生物能够进行有序地根据生长发育需要对DNA片段进行重排，还能够在需要情况下，增加某些基因的拷贝数。5基因转录的调控区很大，距离核心启动子有几百几千碱基对，不直接影响启动子对于RNA聚合酶的亲和程度，而通过改变整个控制基因5`上游区的DNA构型来影响它与RNA聚合酶的结合能力。6真核生物的RNA在细胞中合成，经过转运穿膜，在胞质中翻译 7有复杂的成熟和剪接过程。基因家族：真核细胞中许多相关基因常按功能成套组合。基因簇：同一家族中的成员有时紧密地排列在一起成为基因簇。假基因：基因组中因突变而失活的基因，无蛋白质产物，由于启动子出现问题。 真核基因的断裂结构：1外显子和内含子2外显子内含子链接区的特征：内含子两端不存在同源性，序列不能互补；序列区短，但高度保守 3外显子内含子可变调控：组成型剪接：将全部外显子进行连接，精确剪接基因形成成熟的mRNA。 选择性剪接：同一基因选择不同启动子，或在转录产物上选择不同polyA尾巴具有不同的二级结构影响剪接过程，最终产生不同mRNA。 真核生物DNA水平上的基因表达调控：1基因活化：1处于活跃状态的基因（染色浅染）比非活性状态的DNA更容易被DNA酶1降解 2右旋型变为左旋型（Z-DNA），导致结构基因暴露 3组蛋白的变化（乙酰化修饰） 4甲基化程度2基因扩增：在蛋白质形成过程中发生多次DNA复制，增加基因拷贝数3基因丢失：部分组成细胞会出现基因丢失，只有生殖细胞生成细胞会保有的基因。 4基因重排：将一个基因从远离启动子的地方移动到距离它很近的位点从而启动转录。 5甲基化：关闭某些基因的活性，去甲基化诱导基因重新活化和表达。甲基化导致DNA 的构型变化，使得DNA结构发生B→Z型的变化，转录起始的相关因子与启动区DNA元件不易结合。（对于弱启动房子来说，少量密度的甲基化，即可抑制转录活性；若结合上强启动子，即使不去甲基化也可提高转录活性；但对于高密度甲基化而言，即便结合启动子，也仍无转录活性。）甲基化的主要了：5-甲基胞嘧啶（5-mC）Xist基因只在失活的染色体上表达，导致甲基化，导致X染色体失活。基因的分子生物学定义：产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。 真核基因转录的主要组成：顺式作用元件：影响基因自身表达活性的非编码序列（启动子、增强子、沉默子），组成基因的调控序列，常与特定功能基因连锁在一起。启动子：由核心启动子和上游启动子所组成。上游启动子：CAAT区、GC区（二者均在-70bp附近） 核心启动子：TATA区（-30～-25bp）、转录起始位点增强子：能使与它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。沉默子：某些基因含有的负性元件，与特定蛋白相结合时会阻遏转录的起始。 反式作用因子：能直接或间接识别结合顺式作用元件的核心序列上的蛋白质，参与基因的转录调控。结构上有DNA结合域和转录活化结合域。包括：TFIID：识别TATA区；CTF：识别CAAT区；SP1：识别GC区的；HSF：识别热激蛋白启动区 1 DNA识别、结合域：螺旋-转折-螺旋结构、锌指结构、碱性-亮氨酸拉练、碱性-螺旋-环-螺旋结构、同源域蛋白 2转录活化结构域：带负电荷的螺旋结构、带富含谷氨酰胺的结构SP1、富含脯氨酸的结构转录因子活性调节的主要方式（蛋白质活化的方式）：1蛋白质合成调节 2磷酸化，去磷酸化3配体结合 4去共阻遏因子 5加上激活因子6蛋白质的相互作用真核生物基因转录调控模式：1蛋白质磷酸化、信号转导与基因表达的影响 2蛋白质乙酰化的影响 3激素的影响 4热激蛋白的影响 信号转导的影响：细胞表面受体与配体分子活化功能的途径：1受体本身或受体结合蛋白具有内源酪氨酸激酶活性2配体与细胞表面受体结合，通过G蛋白介导的效应系统，活化丝氨酸/苏氨酸或酪氨酸激酶真核细胞主要跨膜信号转导途径：跨膜蛋白激酶受体、与G蛋白偶联受体、离子通道（受配体结合调控）蛋白激酶的类型：丝氨酸/苏氨酸型、酪氨酸型、组氨酸型第二信使：cAMP、IP3（肌醇1,4,5-三磷酸）、DAG（二酰基甘油） 蛋白质磷酸化对细胞分裂调控的影响：p53蛋白、p21蛋白、细胞周期蛋白的磷酸化，调控CDK的活性。 乙酰化的影响：乙酰基转移酶对核心组蛋白朝向外部的N端“尾巴”上赖氨酸残基的乙酰化，中和了组蛋白尾巴的正点，降低了核小体和DNA的亲和程度，提高转录活性。 激素的影响机制：靶细胞内上具有专一胞质的受体，可与激素形成复合物，经修饰的受体与激素复合物通过核膜进入细胞核内，并与染色体特定区域结合，导致基因转录的起始或关闭。本质也是激活调控蛋白，从而影响基因表达调控。 相关学说：1受体流动假说：激素-受体复合物在膜内随机碰撞，与腺苷酸环化随机酶结合，引发后续反应 2中介物假说：3邻位互调假说：腺苷酸环化酶的活化系统存在3个活性部位，激素-受体结合部位、Mg2+-ATP作用中心、核酸调节部位热休克蛋白：应答元件：与某个专一蛋白因子结合，从而控制基因特异表达的DNA上游序列。其他水平上的表达调控：RNA加工成熟：1 rRNA加工成熟：原核生物rRNA主要采用碱基甲基化，真核生物rRNA采用核糖甲基化。2 hnRNA加工成熟为mRNA3真核生物基因转录后加工的多样性：简单转录单位和复杂转录单位简单转录单位：只编码产生一个多肽，原始转录产物有时需要加工。包含：PolyA修饰，剪切RNA链 复杂转录单位：一些编码组织和发育特异性蛋白质的基因的原始转录产物，通过不同加工方式加工成两个两个以上的mRNA包含：利用多个5`端转录起始位点；利用多个加PolyA位点或不同剪切方式产生不同蛋白；有多个启动子或加PolyA位点蛋白质生物合成所需的4种物质：核糖体、合成模板mRNA、可溶性蛋白因子、tRNA 翻译水平调控：1真核生物mRNA的“扫描模式”与蛋白质合成的起始 2 mRNA5`端帽子结构的识别与蛋白质的合成 3 mRNA的稳定性与基因表达调控4可溶性蛋白因子的修饰与翻译起始调控 翻译后水平调控：1新生肽链的水解，形成稳定肽链2肽链中氨基酸的共价修饰：磷酸化、甲基化 3通过信号肽分离、运输、定位第九章 疾病与人类健康癌基因：分为病毒癌基因和细胞转化基因。反转录病毒上基因对应蛋白：gag基因：表面糖蛋白；pol反转录酶；env跨膜蛋白原癌基因：细胞内部与细胞增殖相关的基因，是维持机体正常生命活动的必需基因，且是进化上的保守序列。正常细胞不表达，细胞发生癌变才表达的基因。 原癌基因产物的位置：与膜结合蛋白；可溶性蛋白；核蛋白产物蛋白分类：蛋白激酶类、生长因子类、生长因子受体类、GTP结合蛋白类、核蛋白类、功能未知类。基因领域：基因与基因之间距离。基因领域效应：基因间隔小于一定长度时，两个基因中的一个或全部都不能被转录或转录活性降低的效应。 癌基因表达调控：1基因领域增大，原癌基因被开启 2原癌基因终产物对基因表达的影响 3抑癌基因产物对原癌基因的调控：抑癌基因与原癌基因在生物学生的区别：1功能上，抑癌基因对细胞生长起负调控2遗传方式上，致癌基因是显性，抑癌基因是隐性的3发生突变细胞类型上，原癌基因突变只发生在体细胞上，抑癌基因突变可在体细胞，也可在生殖细胞上，且可遗传 基因治疗：通过改变人体内基因表达，以达到治疗疾病的目的。（通过增强、减弱基因表达的方式）主要途径：ex vivo和in vivoex vivo：将体细胞在体外支付目的外源基因，再增殖后输回体内。易操作，不易形成不良反应，但难达到大规模。in vivo：直接将外源基因装配于真核细胞表达载体上，导入体内。技术要求高，难度大，可以大规模工业化生产。 技术路线：1基因置换：用正常基因直接替换致病基因，使DNA完全正常，是难以实现的理想技术。2基因修复：使治病基因中的异常部分得以纠正，保留正常的部分。3基因增补：将正常的目的基因导入靶细胞，与致病基因共同表达，但正常基因的表达产物效应强于致病基因产物。4基因干预：特异性封闭致病基因，抑制基因的表达。5免疫调节：将抗原、抗体导入患者体内，改变免疫状态，达到预防、治疗疾病的目的。 基因治疗优势：1基因水平上的治疗，从疾病的根本入手 2具有长效性和经济性3可以克服目前无法解决的疾病 基因治疗存在的问题：1急需建立靶向性基因导入系统 2外源基因表达的可控性 3可治疗的基因过少 基因治疗中的非病毒载体：1裸露DNA2脂质体/DNA复合物：脂质体为双层膜结构的封闭粒子，能促进大分子穿透细胞膜3多聚物/DNA复合体： 4 DNA微球体：5反义核酸技术：RNA干扰技术调节肿瘤基因表达人类免疫缺陷病毒——HIVHIV基因组由两条单链正链RNA组成，在RNA5`端由帽子结构，3`端由polyA尾HIV的复制：HIV病毒主要侵染人体T细胞和巨噬细胞，通过膜蛋白gp120与CD4分子特异性结合，之后核心蛋白和2条RNA链进入细胞，在反转录酶作用下，以RNA为模板合成DNA单链，在宿主细胞DNA聚合酶下形成DNA 双链，环化后整合进入染色体上，随细胞分裂不断传递，可长期潜伏。 艾滋病治疗：采用核苷酸型反转录酶抑制剂和非核苷酸型反转录酶抑制剂，混合则为鸡尾酒疗法。 乙型肝炎病毒——HBV结构为有部分单链区的环状双链DNA分子，两条单链长短不一。长链L为负链，短链S为正链。 采用反转录方式，进入细胞后，被DNA聚合酶修复正链缺失部分，形成共价闭合环状双链DNA 分子，作为转录模板。HBV基因组（环状DNA）在宿主RNA聚合酶作用下转录，产生前基因组RNA。经过反转录形成基因组DNA，最后被包装成为病毒颗粒。 第十一章 基因组与比较基因组学高通量DNA序列分析技术：DNA 测序基本原理：双脱氧末端终止法：由于核苷酸之间通过3`－5`磷酸二脂键连接，而双脱氧五碳糖的3`端无法继续脱氧形成磷酸二脂键，于是发生特异性连增长的终止，停留在加入的特异性某种双脱氧核糖核苷酸的位点上。 （注意：实际电泳测得的任何一条条带都与目标链互补） 基因组DNA大片段文库的构建：酵母人工然染色体法（YAC）：包含有：着丝粒、端粒、复制起点、目标基因（平均200～1000bp），提高合成染色体在受体细胞中有丝分裂中的稳定性。 鸟枪法测序技术及其改良：全基因组鸟枪法测序：随机挑选带有基因组DNA 的质粒做测序反应，然后用计算机进行序列拼接。优点：1建立了高度随机且插入片段大小为1～2bp的基因组文库；2高效大规模进行序列测量缺点：1随被测基因总量增大，各个片段从跌形成连续体的可能性成指数形式增加；2高等真核生物基因组中有大量重复序列，会导致判断失误大规模DNA 序列分拼接：每次测得的序列是DNA序列中的一小段，亟待解决的就是将这些片段进行首尾串接，采用的方法类似数学中最短超串问题，有汉米尔顿通路法和尤路因通路法。人类基因组计划：9人类基因，有23对染色体，单倍体细胞中近3×10个bp，约有3～4万个（2～3万个）基因。人类基因组计划的科学意义：1确定人类基因组所携带的全部基因的位置。 2了解转录、剪切调控元件的结构与位置。 3了解不同序列对于染色体结构、DNA复制、基因转录和表达调控中的影响和作用。 4染色体空间构型对于基因的调节作用。 5 DNA复制、重组有关的序列。 6疾病发生的分子机制。7了解转座子、反转座子、病毒残余序列的性质、影响。 8染色体和个体之间的多态性。 遗传图（连锁图）：用基因（DNA）标志在染色体上的相对位置与遗传距离进行作图的基因组图，采用的连锁分析方法是经典遗传学的重要内容。第一代遗传标记（第一种遗传多样性）：RFLP（限制性片段长度多态性），指DNA序列上的微小变化（甚至是一个碱基的变化），导致限切酶切点的丢失或产生，导致酶切片段长度变化。第二代遗传标记：利用存在于人类基因组中大量重复序列，包含小卫星DNA（15～65bp）微卫星DNA（2～6bp，简短串联重复）。第三代遗传标记：利用分散于基因组中的单个碱基的差异，包括单个碱基的插入、缺失，以及SNP（单核苷酸多态性）。可能是最好的遗传标记。SNP：一种嘧啶碱基被另一种嘧啶碱基替换，或是嘌呤替换嘌呤，在CG序列上出现最为频繁——C常被甲基化，自发脱氨变成T。多态性：人的DNA序列平均每数百bp就有变异，且按照孟德尔的遗传定律传递给子代，从而在个体上表现不同。物理图：以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标” (STS,序列标记位点)，以碱基对作为基本的测量单位的基因组图。 转录图（cDNA片段图）：即EST（表达序列标签图），依据转录顺序的位置和遗传距离所绘制的图谱，是对于人类基因中表达了的一类基因的基因组图。STS＞EST序列图：对于人类全基因组进行测序后的基因组图，是分子水平上最高层次、最详尽的物理图。百度搜索“就爱阅读”,专业资料,生活学习,尽在就爱阅读网92to.com,您的在线图书馆!
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