【图片】LFY打OG【dota2吧】_百度贴吧
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没有直播的吗
大优我擦…
现在老佛爷18比og4
这是我们熟悉的lfy？？
&#2&#2&#1&#3&#2&#32&#2&#3&#2&#2656&#3&#2&#6676&#32&#53&#51&#57&#49&#48&#52&#55&#51 ;
看来lfy对新版本理解不错
22比4，经济领先13000，22分钟
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今天想下LFY让受让，结果自己账号没用了。不过还是远离菠菜吧
已经破路了，og感觉好蹦啊，打字的时候23比4了
领先15000准备破第二句，og小y吓得直接放大，lfy撤了
已经进入虐菜时间了..
不愧冬虫夏草
25比4，25分钟，领先16000
我就说双雄才是中国最强的
你们下菜啊
唯一指定冠军？
这把LFY酱油真是灵性
弹幕说LFY能夺冠？？
哪里看比赛？斗鱼没有嘛
干爹双雄还是厉害
哪个是世界第一打野
25比5，领先18000，盾奶
og疯狂往外带线，被抓
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保存至快速回贴TI7决赛液体3:0NB一穿六夺冠 中国队奇数年魔咒未能打破 - A5创业网
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TI7决赛液体3:0NB一穿六夺冠 中国队奇数年魔咒未能打破
10:20&&来源：&
　　今天是TI7国际邀请赛的最后一天，迎来了的败者组决赛和总决赛，最终中国军团LFY和NB都未能打破中国队奇数年魔咒，最终液体队从败者组完成了一穿六夺得了本届TI7的冠军。今天液体的比赛发挥仿佛换了一队人，无论是先知的前期压制还是剧毒的团战都让中国队吃尽了苦头，下面一起来看看具体的战报吧。
　　败者组决赛LFY 1:2 Liquid
　　败者组决赛，LFY对阵液体第一局，前期LFY利用各种游走取得人头优势，也顺利推掉液体多座塔。25分钟，双方在LFY上路爆发团战，LFY矮人火枪手刚TP下来被埋伏的液体击杀，但是LFY也顺利击杀对方三人，包括2个大哥血魔和熊德。31分钟，剑来的帕克带着小狗在上路精准找到液体的熊德，击杀以后推入液体中路，液体中路高地爆发团战，液体血魔和小牛率先出手直接击杀帕克，LFY也果断出手，杀了液体一个团灭，己方死了火枪和巫妖，小狗盾也交了。
　　42分钟，LFY推入液体中路，击杀数人，但是液体的小熊也偷掉LFY的上路和下路塔，这波LFY并不是很赚，液体的双带线还是很无赖，目前局势还是很难说。48分钟，双方在肉山处爆发团战，液体团灭2个买活，LFY也数人阵亡买活，LFY推入液体高地，拆掉了中路和下路。51分钟，双方肉山团再次爆发团战，LFY击杀液体三人，顺利拿盾拿奶酪。57分钟，双方高地爆发团战，非常混乱，双方各种死各种买活，最后LFY还是利用买活击杀对方多名英雄，直接拆掉基地
　　败者组决赛，LFY对阵液体第二局，一开始液体给中路和下路很多压力，还好有阿福的海民帮忙，没有让中路和下路的对线太崩。GH的小牛还是厉害，带起各种节奏，让液体前期人头领先，经济也大大领先。17分钟，LFY开雾想在肉山处打一波，虽然击杀剧毒，自己却失去多名英雄。19分钟，LFY在液体下路再次想抓人，虽然击杀了几个英雄，但是自己也失去了关键的TB大哥和三号位帕克。
　　20分钟，LFY中路二塔再爆发团战，LFY的TB和海民阵亡，只击杀GH的小牛，中路二塔也告破。23分钟，又是GH的小牛完美大，LFY阵容完全被打乱，4名英雄阵亡，LFY已经大劣。30分钟，液体带盾推上LFY下路，LFY没什么抵抗力，多名英雄阵亡，下路告破以后无奈GG，GH的小牛真的可怕，之后决胜局。
　　败者组决赛，LFY对阵液体第三局，液体早早就杀人拿塔，LFY从对线期开始就很劣势。9分钟，液体推入LFY中路，LFY打出漂亮团战，击杀液体4名英雄，己方只死了蝙蝠，但是局势还是很劣，经济排名前三都被液体占领。
　　之后双方进入一波互刷局。25分钟，液体想推入LFY下路，LFY5人和液体3人在LFY野区爆发团战，液体的TB和先知推下路，结果LFY打出漂亮团战和反打，团灭液体还击杀了买活的英雄!!!之后LFY打肉山，液体的先知抢到肉山，但是多名英雄被击杀。LFY打回来了!!!Monet的水人肥了!!!
　　31分钟，液体在LFY野区抓到LFY，LFY失去4名英雄，失去上路高地塔。之后双方互有英雄阵亡，水人被抓击杀以后买活也让LFY不敢太冒进。41分钟!!液体想要推入LFY上路，LFY再次打出精彩团战，液体团灭，而自己自失去蝙蝠。46分钟，LFY开雾在自己野区开团，团战很乱，LFY水人被杀，先知偷掉两路!!!液体带盾带奶酪再次推上，LFY虽然努力了，还是没能挡住最后一波!液体获胜。
　　最终决赛Liquid 3:0 Newbee
　　总决赛NB对阵液体BO5第一局，液体败者组决赛上来以后气势还是很旺，前期利用压制取得人头领先。之后液体还是节奏不断，不断击杀NB英雄，在27分钟也推掉NB的下路和上路。NB感觉劣势太大，直接打出GG。
　　总决赛NB对阵液体BO5第二局，这局NB开局好很多，各种积极游走和GANK，先拿到10个人头，包括中路Sccc的女王单杀了Miracle的炼金和MATUMBAMAN的NEC。25分钟，液体打肉山，NB想要干扰，结果阵亡3人，击杀液体2个酱油。28分钟，液体带盾推入下路，NB军团大到有林肯的NEC，之后爆发团战，NB多名英雄阵亡，下路被推掉，之后液体再次推入中路，NB还是无法挡住无解肥的炼金，在敌法再次死亡以后打出GG，目前NB0比2落后。
　　总决赛NB对阵液体BO5第三局，28分钟，NB打肉山被液体抓住，一波死了四个英雄，肉山盾也被液体拿了，还是肉山团啊。33分钟，液体推入NB下路，NB打出精彩团战，击杀液体3名英雄!虽然NB还是劣势，但是起码打回来一些。42分钟，肉山附近，NB想要秒掉剑圣失败，NB被团灭，液体一人未死，NB这局已经没什么机会了。
　　恭喜液体第一天掉入败者组以后，还是一路杀回来，总决赛3比0战胜NB获得TI7冠军。TI几个魔咒还是没破，还是没有同一个战队可以获得TI冠军2次，没有同一个人可以获得TI冠军2次，奇数年中国战队还是没有夺冠。中国军团方面，NB获得TI7第二名，LFY获得TI7第三名，LGD获得TI7第四，IG获得TI7第五。
　　赛程图
　　最终本次TI7中国战队虽然没有取得冠军，但是包揽了2345名，还是取得了不错的成绩。虽然大家对这次比赛给予了更多的希望，但生活还是要继续，比赛还是要接着打。明年再接再厉，我们偶数年再见!
责任编辑：A5大昊
作者：子腾
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下一场LFY对VP好关键好关键！！！
LFY把VP打下去，中国队前三保证两个。关键VP掉下去是打李魁和帝国的胜者，那VP和李魁肯定死一只。另外一边OG如果要向前，先要过，再要过IG或者NB，之后是李魁和VP其中一个，所以说LFY重任再肩！！
vp要是掉下去，那外国队想要夺冠至少得连赢三支中国队
打出自己的水平就ok了
谁掉下去谁回家
掉下去是打LGD跟OG胜者吧，还是我记错了
不用担心，中国队状态好
别奶啊，兄弟
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vp下去不是打lgd和og的胜者吗？
lfy还是挺稳的，小组赛打的vp16投
如果lgd赢了og，帝国赢了液体，是不是前六只剩cn和毛子了
真的关键！但求各路大神们，就算输了也请别拿这个喷他们！
这届ti冠军应该是vp。
ti5知道吗23456
帝国看了想打楼主
一句话：中国冠军的决战局。LFY只要赢了VP冠军就是中国队的
我说句不中听的话，感觉vp小组赛有点演戏的感觉，没有昨天那么凶啊。不过这届看下来发现b组不是说实力比a组强多少，而是a组三支队eg、liquid、lgd的风格被b组战队血克啊。都是喜欢刷，英雄选的也飘，b组上来就是干，阵容也扎实。希望lfy抡翻vp，lgd能过og，然后ig和lgd能从败者组杀回来一支。
意思是ig掉下去了打的是og和lgd的胜者？那lgd要加油啊，不然给ig碰到了og，og还不状态爆棚要复仇。。。
先下一城l fy
还是稳 我估计除了nb没人能制裁他了
菠菜全下lfy
LFY和LGD中间差了一个VP啊这是
老肥羊打vp还是有心得的
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保存至快速回贴DOTA2：老对手德比，Newbee完成逆转击败LFY
完美大师赛正赛第二日，在第一轮就相遇的LFY和Newbee战满三局，最终Newbee让一追二实现逆转，晋级胜者组第二轮。
出门LFY五人冲向Newbee下路野区，抱了树的小小被五人围殴致死。1分钟沙王刺到下路的凤凰，配合队友将其留下。最终的分路情况是Sccc的小小在中路对上了包子的死亡先知，上路是Moogy的虚空和Faith的巫医对上了剑来的末日，下路是Monet的水人带着双辅助对上了KP的谜团和kaka的凤凰。
4分半，死亡先知和沙王在河道处撞倒了凤凰，末日也赶来杀人，kaka一个凤凰冲击飞走，一边的巫医就没那么好运了，Faith躺枪。5分钟Newbee双辅助来到中路，烈日炙烤，麻痹药剂，诅咒同时配合山崩一起往死亡先知脸上砸，包子不慌不忙开启吸魂巫术，扛过第一波伤害后反杀凤凰，中了诅咒的死亡先知从上路河道脱离战场，一打三反杀!于此同时下路的谜团被水人沙王击杀，Newbee出门0-5!
凤凰和巫医开始四处找节奏，可Newbee的阵容在小小前期不肥的情况下确实没有输出，几次gank失利后只能让大哥虚空出山。12分钟虚空凤凰在上路先后击杀了末日沙王。看到剑来复活，这两兄弟想再杀他一次，Moogy开挂了，四下普攻出了三下被动，可LFY来的人实在太多了，虚空倒地后凤凰蛋也被打爆了。15分钟下路的小小谜团强杀沙王不成双双送命，Newbee一个团战阵容在对线期劣势的情况下非要追着LFY打，结果碰了一鼻子灰。
18分钟上路的谜团遇到末日沙王二人组，无路可逃的KP原地拉大想拼掉末日，输出根本不够，黑洞结束后沙王一发穿刺送他回家，于此同时下路的隐身符萨尔留下了Newbee发育最好的虚空假面。20分钟LFY在中路抓到虚空巫医后直接转向肉山巢穴，利用死亡先知的大招光速打掉肉山，Monet的水人带盾，Newbee还是没有抱团打一架的意思，继续分头刷，LFY的雪球越滚越大。
24分钟LFY破掉了上路二塔，Newbee六座外塔至此全部失守，谜团虚空凤凰的大招还在，LFY也没有急着上高，反正水人肥，先刷一刷再说!27分半，谜团和凤凰在上路找到了水人，KP二话不说直接拉到，没放凋零输出根本不够啊，末日赶来反杀谜团，LFY马上破掉中路高地，同时下路想要偷高的小小被赶回来的萨尔水人留下，Newbee兵败如山倒。
32分钟Newbee开雾找一个GG的理由，从自家中路远古高台冲下去时撞到了同样开雾的LFY大部队，沙王刺起小小巫医和凤凰，眼疾手快的末日直接给上凤凰大招，大招三巨头先少一人，虚空跳后排单罩一萨尔，DDC成了LFY这边唯一的牺牲者。谜团拉大根本没有输出接上，巫医谜团凤凰阵亡后Newbee打出GG。恭喜LFY 1-0领先。
出门勾兵的蝙蝠骑士送了FB，分路情况是包子的美杜莎对上了Sccc的死亡先知，下路是剑来的发条独自一人面对Faith的神谕者和Moogy的大圣，上路是Monet的混沌带着双辅助对上了KP的蝙蝠和kaka的小强。
2分钟下路的发条走位过于靠前，被大圣一棒加神谕的涤罪之焰击杀。4分钟小强来到下路，毫无察觉的发条居然还想去抢赏符，Newbee三人从三个方向过来再杀发条。6分钟下路的发条为了抢符再死一次，剑来三连送。7分钟Newbee下路冲塔强杀沙王，第一时间没能秒掉还是要追，美杜莎支援到位赶走Newbee众人，神谕者被发条留下。
8分钟混沌骑士在上路欺负小强，蝙蝠过来要救队友，发条一发铁钩将他拦下，大圣神谕者也赶来支援，开了大招的混沌输出爆炸，避开大圣强势的大招后Monet进入割草模式，Newbee上路四人有一个算一个全部被混沌留下!对线期结束，全场经济第一的是混沌骑士，美杜莎紧随其后。
15分钟蝙蝠跳刀第一波，Newbee开雾找节奏，LFY也同时开雾，两边在Newbee中路二塔前遭遇，发条钩到死亡先知，神谕者大招帮Sccc续命，沉默开大断了Newbee后手技能，两边输出都不够，第一波交锋无人阵亡，Newbee继续追击，沙王为了掩护队友献出了生命，混沌骑士赶来一刀砍死小强，随后大招转好的发条再钩中路的死亡先知，这一次Sccc没能活下来。
17分半，NB三人开雾抓人，冲到LFY上路野区先秒沉默，混沌回头直接秒杀小强，顶着大圣大招将带着虚诺之妄的大圣活活打爆，Newbee溃败，五人团灭。LFY打掉肉山，混沌带上不朽盾。
20分半，LFY下路推高，蝙蝠冲上来拉人直接被混沌秒掉，但随后LFY顶着大圣大招和Newbee开团实属不明智，美杜莎沙王倒下，混沌死血。LFY撤退，Newbee追下高地用双辅助换掉了混沌两条命外加一个发条，总算是打赢了一波团战。
23分半，蝙蝠中路先手混沌，沉默开大反击，混沌回头直接完成三杀，Newbee四人阵亡，只有神谕者捡了一条命，LFY顺势连拔中上两座二塔。28分钟两边再次在Newbee上路远古高台处遭遇，蝙蝠继续跳拉混沌，沉默开大掩护，Monet开启BKB和大招，LFY反打，直接秒掉小强，卡卡买活，神谕者大招救下死亡先知，同时给上大圣命运敕令抵消沙王的全部技能，混沌见情况不对马上跑路，Newbee击杀了身处猴阵中的沙王美杜莎。Faith经济垫底的神谕者两个技能救下两个大哥，太可怕了。
30分半，肉山刷新了，NB五人赶来蝙蝠跳拉先秒沙王，LFY则是击杀了神谕者和蝙蝠，混沌被大圣和死亡先知围殴致死，LFY溃败。32分半，NB在抓到发条后直接打肉山，LFY不放，又是ah fu，又是沙王，千里抢盾，奶酪落到了大圣手中。混沌和大圣对刚，大圣打到一半吃下奶酪，混沌为了追小强和队友脱节，白白送命。
37分钟Newbee推下路，刚刚被抓的发条买活，LFY秒掉了蝙蝠却无法扭转失败的命运，混沌的幻象大军又是被秒清，小强化身地保吃了大量伤害就是不死，混沌和美杜莎曾经是DOTA2传说中的无解后期英雄，但在小强死亡先知和大圣三大阵地战王者面前不得不俯首称臣，Newbee团灭LFY后破掉下路高地，完成翻盘。
分路情况是Sccc的电魂在中路对上了包子的火女，剑来的蝙蝠和ah fu的沙王在下路对上了Faith的萨尔和Moogy的小鱼人，Monet的水人和DDC的毒狗在上路对上了KP的全能，kaka的小牛是自由人。
1分钟蝙蝠和萨尔下路对拼，蝙蝠吃树熬过三下电击，沙王刺死萨尔拿到FB，2分半被叠了五层油的萨尔再度阵亡，3分半，萨尔送出了本场第三个人头。6分钟电魂来到下路河道控符，没想到沙王蝙蝠火女全都来了，绝境中电魂拼掉了沙王，1打3换了一个。7分半，毒狗水人上路击杀全能，同时下路的小鱼萨尔带走了沙王。9分半Newbee集合四人动手蝙蝠骑士，沙王用命救下了队友。
对线期结束，LFY又是和前两局一样占据了优势，水人火女蝙蝠三核经济骑脸，对于一个大核阵容来说，这已经是近乎完美的开局了。13分钟蝙蝠跳刀第一波，剑来拉到了中路的电魂，配合火女和毒狗直接将Sccc秒掉。LFY凶相毕露，开始冲塔杀人，14分半沙王蝙蝠从下路一塔追到下路二塔强行杀掉了小牛，但沙王毒狗和火女因为冲得太凶被Newbee留了下来。
17分半，LFY推掉中路一塔，蝙蝠前顶赶人，想走时却被萨尔拉了回来，毒狗禁锢蝙蝠依然没能救下，Newbee开始追击，电魂冲得太凶直接被秒，小鱼人切掉火女后还想再留水人，输出不够，Newbee只能放弃。
21分钟Newbee入侵LFY上路野区，秒掉火女后再留毒狗蝙蝠，水人被围攻无人能救，小鱼人为所欲为，Newbee在打了LFY一波实实在在的五人团灭，实现经济人头双重反超。
25分钟Newbee在下路先后击杀了沙王火女，继续追击再留蝙蝠毒狗，LFY输出实在有限，再加上全能的存在只能杀个无关紧要的小牛。27分钟Newbee打掉肉山，小鱼人带上了不朽盾。Newbee继续压制LFY，同时超神小鱼人的经济依然在疯狂增长，31分钟Newbee在击杀毒狗后破掉了中路二塔，LFY六座外塔全部失守，全员被关在了高地上。
34分钟小鱼人在LFY上路野区看到了毒狗，同时萨尔将火女拉了回来，蝙蝠想跳过来拉人却被小牛大招断掉，萨尔大招让火女蝙蝠无路可逃，另一边想要TP的毒狗同样难逃一死，Nwebee中路上高，蝙蝠买活来守。Newbee破掉中路高地塔后稳稳撤走。36分钟Newbee抓到蝙蝠骑士，随后破掉了中路高地。
肉山刷新，LFY不想放，沙王走到Newbee众人脸上毫无作为直接被秒，水人秒掉小牛，kaka买活，正面战场完全是一面倒的屠杀，在火女蝙蝠都阵亡后LFY打出GG，恭喜Newbee让一追二，晋级胜者组半决赛。
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成花调控基因LFY的选择性剪接及其功能研究
分类号：Q754____密级：_______________ 编号：_______________U D C：______ ________西南林学院 2009 届硕士研究生学位论文的选择性剪接及其功能研究 成花调控基因 LFY 的选择性剪接及其功能研究Studies on the Alternative Splicing and Function of Flowering Regulatory Gene LFY姚 有 林指 导 教 师： 申请学位级别： 学科专业名称： 论文提交日期： 论文答辩日期： 学位授予单位： 学位授予日期：鄢波 教授 硕士 野生动植物保护与利用 2009 年 6 月 2009 年 6 月 9 日 西南林学院西南林学院 2009 届硕士研究生学位论文成花调控基因 LFY 的选择性剪接及其功能研究Studies on the Alternative Splicing and Function of Flowering Regulatory Gene LFY姚 有 林指 导 教 师：鄢 波 教授 学位授予单位：西南林学院云南?昆明声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含他人已经发表 或撰写过的研究成果， 也不包含为获得西南林学院或其它教育机构的学位或证书而使 用过的材料， 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示了谢意。签名：日期：关于论文使用授权的说明本人同意：西南林学院有权保留论文的复印件，可以采用影印、缩印或其他复制 手段保存论文；提交论文一年后，允许论文被查阅和借阅，学校可以公布论文的全部 或部分内容。 （保密的论文在解密后应遵守此规定）签名：导师签名：日期：
摘要开花过程（即成花）在相当的程度上决定着繁育是否成功，是高等植物最关键的 生命时期之一，近年来已成为植物生殖发育研究的新热点，并且该领域的研究对农业 和园艺生产有着重要意义。其中，LFY 基因是目前研究得比较深入的成花相关基因之 一。LFY 基因作为花分生组织特性基因，被认为是很多植物由营养生长向生殖生长转 变的主要调控因子之一。 真核生物基因的选择性剪接极大地丰富了基因表达产物的多样性和基因表达的 复杂程度。选择性剪接改变蛋白质结构域、活性、定位，及影响蛋白质亚基或蛋白质 间的互作、转录后调控，甚至产生无功能的产物。其在调控植物生长、发育、遗传、 免疫及抗性等方面的作用已越来越为研究者们所关注。 而成花过程则恰恰是选择性剪 接等调控机制的有机组合和协调作用，因此，成花过程中涉及的选择性剪接成为一个 重要的研究部分。 本研究进行了成花调控基因 LFY 的表达分析，及其可能的选择性剪接研究，并 通过基因转移，对较少报道的 LFY 基因选择性剪接产物（1275bp 片段）进行一定的 功能验证。意在研究 LFY 基因发生的可变剪接事件及其对 LFY 基因功能的影响。研 究结果如下： 1. 用 RT-PCR 法克隆了 LFY 基因的两个转录本 cDNA， 1263bp 片段和 1275bp 即 片段。序列分析结果表明，1263bp 片段包含了完整的编码序列。1275bp 片段除包含 除完整的编码序列外， 在第一外显子和第二外显子间还保留了第一内含子 3’末端 12bp 序列。 2. 用 RT-PCR 法克隆了 LFY 基因发生可变剪接部位的三个片段：LFY1239， LFY1263 和 LFY1275，分别代表了存在的三种可变剪接转录本。在营养生长期拟南芥 莲座叶中包含了三种，而在开花期的花器官和莲座叶中只包含两种（LFY1263， LFY1275） 。序列比对结果显示，转录本 LFY1239 缺失了第一外显子靠近 3’端的 36bp 片段可能导致 LFY 蛋白质在 N 末端缺失 GTHHALDALSQE 这 12 个氨基酸残基而丧 失活性，成为一个无功能的表达产物；转录本 LFY1263 包含从起始密码到终止密码 的全部开放阅读框序列；转录本 LFY1275 在第一外显子和第二外显子间保留了第一内含子的 3’端 12bp 片段。 3. 通过高浓度（3.5％）的琼脂糖凝胶电泳分离，并利用 BioSpectrum Imaging System 自带的 VisionWorks LS 软件对电泳照片进行光密度分析。结果显示 LFY 基因 三种不同转录本在拟南芥不同生长发育阶段其相对含量有所差异。表现为，LFY1263 在三个分子中所占比例最大， 结合已报道的证据， 该转录本对开花诱导有着重要意义。 LFY1239 只在营养生长期的莲座叶被检测到，并且编码序列存在一定缺失，这是否提 示其对拟南芥成花诱导作用不大？LFY1275 和 LFY1263 在营养生长期和开花期均存 在，两转录本在不同时期莲座叶中的相对比例较稳定，在花器官中 LFY1275 相对于 LFY1263 的比例却有所增加。但是，转录本 LFY1275 和 LFY1263 在拟南芥的生长发 育和开花诱导过程中，是独立作用还是协同作用，还需要深入的研究。 4. 用 LFY1275 cDNA 构建了植物组成型表达载体 pBL1275，转入根癌农杆菌 GV3101 菌株，并浸染多头切花菊“绿宝石”品种无菌苗茎段材料，初步获得了 17 株 Kan 抗性苗，其中 PCR 检测阳性为 9 株，占抗性苗的 52.94％。利用 RT-PCR 检测了 移栽 2 个月后的 9 株 PCR 阳性苗，其中 7 株为 RT-PCR 阳性，表明 LFY1275 能够在 转化植株中表达。 5. 与未转化植株相比，移栽的转基因植株长势较弱。部分出现分枝的主茎、侧 芽的提早分化生长，一定程度上揭示了 LFY1275 可能与侧芽的提早分化有关；部分 植株出现异形叶；还有部分发生不明原因的萎蔫。 本研究对拟南芥 LFY 基因存在的 3 个选择性剪接转录本的差异表达及转录本 LFY1275 的功能研究结果表明，在拟南芥生长发育相关信号传递及成花诱导的过程 中，LFY 基因的选择性剪接存在发育时期特异性，并且可能通过丰富其表达产物而扩 大了与其它基因的相互协调作用而使调控更加广泛、灵敏和有效。关键词：成花调控，LFY 基因，可变剪接，差异表达，转基因AbstractFlowering is the most crucial stage in the higher plants life. Studies on genetics and development were hotspots in plant sciences. As a floral meristem identity gene, LFY was largely studied. It was concerned as one of the major factors which regulated the switch from vegetative to reproductive developmet in plants. Alternative splicing (AS) in eukaryotes contributes to the diversity of genes’ products and the complexity of gene expression. It is not only changed protein domain, activity and localization, but also effected on the interaction among proteins or its subunits, post-transcripted regulation and even risen to nonfunctional proteins by AS. AS was considered much more deeply that it performed an important function to growth, development, inheritance, immunity and resistance in plants. Of course, it is correlatively corresponded between flowering regulation and AS. Analysis of LFY gene expression and molecular cloning of the alternatively spliced fragments were performed in this study. A transcript cDNA with 1275bp length, for which functional evidence has been reported less, was cloned and used to transgene subsequently. The results were showed as follows: 1. Two transcipts cDNA of LFY gene were cloned by RT-PCR. One of those was 1263bp length which consisted of full coding sequence. The other one contained full ORF and additional 12bp derived from the first intron 3'-end. 2. Three alternatively spliced fragments of LFY gene were cloned by RT-PCR, as LFY1239, LFY1263, and LFY1275. Sequencing results showed that LFY1239 lacked 36bp fragment of the first exon 3'-end, all of the introns were accurately spliced and full ORF contained in fragment LFY1263, and additional 12bp derived from the first intron 3'-end retained and full ORF were contained in LFY1275. 3. AS fragments were divided by 3.5% agarose electrophoresis, and scanned by BioSpectrum Imaging System for optical density. LFY1239 was only detected in rosette during vegetative stage. LFY1263 and LFY1275 sustained steadily both in floral organs and rosette during two stages. Especially, LFY1263 was the most abundant transcript in this study, corresponding former reports, which contributed to flowering significantly. Theproportion of LFY1275 to LFY1263 was increased a little in floral organs. It’s indefinite whether LFY1275 and LFY1263 would operate independently or interdependently. 4. A cDNA with 1275bp length, which contained AS fragment LFY1275, was used to construct constitutive expression vector pBL1275. Subsequently, pBL1275 was transformed into agrobacterium GV3101, which was used to transgene then. Stem segments cut from the regenerated plants of chrysanthemum 'emerald' were taken to be infected by GV3101/pBL1275. Seventeen transgenic lines were screened out by media contained 30 mg/L kanamycin. PCR assay on transgenic lines was taken, nine out of seventeen lines were positive. Seven of those nine lines were positive in RT-PCR assay. It indicated that LFY1275 could be transcribed in transgenic lines. 5. Compared with wild plants, transgenic lines grew weakly. Some variant phenotypes were represented among the lines, as divaricate stems, branches in many buds which may suggested that LFY1275 was a contributor to early lateral buds growing, abnormal leaves and sudden death of some transgenic lines. The results of differential expression assay on three AS transcripts of LFY gene and studies on function of LFY1275 revealed that alternatively spliced transcripts of LFY gene were temporal, and which made a contribution to enhancing regulation extensively, sensitively and effectively.Keywords: flowering regulation, LFY gene, alternative splicing (AS), differential expression, transgene目录-1 前 言 ....................................................... - 1 1.1 研究的目的和意义 ............................................ - 1 1.2 研究进展 .................................................... - 2 1.2.1 LFY 基因及植物成花分子调控机制的研究进展 ............... - 2 1.2.1.1 LFY 基因的分离及表达研究 ......................... - 2 1.2.1.2 LFY 基因与成花诱导途径的研究 ..................... - 3 1.2.1.3 LFY 基因与光周期途径(Photoperiod Response Pathway)- 5 1.2.1.4 LFY 基因与春化途径(Vernalization Response Pathway)- 6 1.2.1.5 LFY 基因与自主途径(Autonomous Pathway) ........... - 7 1.2.1.6 LFY 基因与赤霉素途径(GA Pathway) ................. - 7 1.2.1.7 LFY 基因与成花诱导途径的整合――成花分子调控网络 . - 8 1.2.2 选择性剪接的研究进展 ................................. - 10 1.2.2.1 选择性剪接的研究概况 ............................ - 10 1.2.2.2 选择性剪接的位点及其基本形式 .................... - 11 1.2.2.3 选择性剪接的调控 ................................ - 12 1.2.2.4 植物选择性剪接的研究进展 ........................ - 14 1.2.2.5 选择性剪接与植物抗性 ............................ - 15 1.2.2.6 选择性剪接与植物生长发育 ........................ - 15 2 LFY 基因 cDNA 的克隆及序列分析 .................................... - 19 2.1 材料与方法 ................................................. - 19 2.1.1 材料与试剂 ........................................... - 19 2.1.1.1 植物材料 ........................................ - 19 2.1.1.2 菌株及质粒载体 .................................. - 19 2.1.1.3 试剂 ............................................ - 19 2.1.1.4 主要仪器 ........................................ - 19 2.1.1.5 软件 ............................................ - 20 2.1.2 方法 ................................................. - 20 2.1.2.1 拟南芥总 RNA 的提取 .............................. - 20 2.1.2.2 拟南芥 LFY 基因 cDNA 第一链合成 ................... - 21 2.1.2.3 PCR 扩增 ........................................ - 21 2.1.2.4 PCR 产物的纯化 ...................................... - 23 2.1.2.5 连接 ............................................ - 23 2.1.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl2 法） ............. - 23 2.1.2.7 连接产物的转化 .................................. - 24 2.1.2.8 菌落 PCR 检测 .................................... - 24 2.1.2.9 重组克隆的筛选鉴定与保存 ........................ - 25 2.1.2.10 测序和分析 ..................................... - 25 2.2 结果 ....................................................... - 26 2.2.1 拟南芥总 RNA 电泳检测 ................................. - 26 2.2.2 LFY cDNA PCR 产物电泳检测 ............................. - 26 2.2.3 菌落 PCR 电泳 ......................................... - 27I2.2.4 克隆子的测序 ......................................... 2.3 分析及讨论 ................................................. 3 LFY 基因选择性剪接转录本的差异表达研究 ........................... 3.1 材料与方法 ................................................. 3.1.1 材料与试剂 ........................................... 3.1.2 方法 ................................................. 3.1.2.1 拟南芥总 RNA 的提取 .............................. 3.1.2.2 LFY 可变剪接转录本片段 cDNA 第一链合成 ........... 3.1.2.3 PCR 扩增 ........................................ 3.1.2.4 PCR 产物的凝胶电泳分析 .......................... 3.1.2.5 PCR 产物的纯化 .................................. 3.1.2.6 连接 ............................................ 3.1.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl2 法） ............. 3.1.2.8 连接产物的转化 .................................. 3.1.2.9 菌落 PCR 检测 .................................... 3.1.2.10 重组克隆的筛选鉴定与保存 ....................... 3.1.2.11 测序和分析 ..................................... 3.2 结果 ....................................................... 3.2.1 拟南芥总 RNA 的提取及质量 ............................. 3.2.2 PCR 循环数的确定 ...................................... 3.2.3 RT-PCR 产物凝胶电泳结果 ............................... 3.2.4 克隆子测序结果 ....................................... 3.2.5 选择性剪接产物差异表达的相对定量分析 ................. 3.3 分析及讨论 ................................................. 3.3.1 选择性剪接转录本差异表达相对定量分析的可靠性 ......... 3.3.2 三个可变剪接转录本差异表达的分析 ..................... 3.3.3 三个可变剪接转录本的序列特征分析 ..................... 3.4 小结 ....................................................... 4 LFY 基因选择性剪接转录本的功能研究 ............................... 4.1 材料与方法 ................................................. 4.1.1 材料与试剂 ........................................... 4.1.1.1 植物材料 ........................................ 4.1.1.2 菌株及质粒载体 .................................. 4.1.1.3 试剂 ............................................ 4.1.1.4 主要仪器 ........................................ 4.1.1.5 软件 ............................................ 4.1.2 方法 ................................................. 4.1.2.1 含可变剪接转录本 LFY1275 植物表达载体的构建 ...... 4.1.2.2 根癌农杆菌电转感受态细胞的制备 .................. 4.1.2.3 农杆菌感受态的电转化 ............................ 4.1.2.4 农杆菌介导的 LFY 基因可变剪接转录本转化菊花的研究 4.1.2.5 转基因植株的 PCR 检测 ............................ 4.1.2.6 转基因植株的 RT-PCR 检测 ......................... -28 30 31 31 31 31 31 31 31 33 33 33 33 33 34 34 34 34 34 35 36 37 40 42 42 42 43 46 47 47 47 47 47 47 47 48 48 48 52 52 53 54 55-II4.2 结果 ....................................................... 4.2.1 含选择性剪接转录本 LFY1275 的植物表达载体的构建 ....... 4.2.2 农杆菌介导的 LFY 基因可变剪接转录本转化菊花的研究 ..... 4.2.2.1 转化受体材料的制备和转化条件的确定 .............. 4.2.2.2 Kan 抗性初筛苗的获得 ............................ 4.2.2.3 转基因植株的 PCR 检测 ............................ 4.2.2.4 转基因植株的 RT-PCR 检测 ......................... 4.2.2.5 转基因植株的移栽与表型观察 ...................... 4.3 分析及讨论 ................................................. 4.3.1 受体材料的选择 ....................................... 4.3.2 转化及培养条件 ....................................... 4.3.3 转基因植株的鉴定 ..................................... 4.3.4 转录本 LFY1275 在转化植株中的表达分析 ................. 4.3.5 转基因植株突变表型的分析 ............................. 4.4 小结 ....................................................... 参考文献 .......................................................... 致 谢 ......................................................... 附 录 ......................................................... 附录 A 本研究的植物材料 ........................................ 附录 B 相关培养基配方 .......................................... 附录 C 部分测序图谱 ............................................ 附录 D LFY cDNA 序列(1275bp) .................................... 附录 E 在读期间发表论文 ........................................ -56 56 56 56 57 59 61 62 66 66 66 66 67 67 69 71 81 82 82 84 86 88 89-III
前言前言1 研究的目的和意义真核生物基因前体 mRNA（precursor mRNA，pre-mRNA）的选择性剪接极大地 丰富了基因表达产物的多样性和基因表达的复杂程度[1]。 选择性剪接改变蛋白质结构 域、活性、定位，及影响蛋白质亚基或蛋白质间的互作、转录后调控，甚至产生无功 能的产物[2]。其在调控植物生长、发育、遗传、免疫及抗性等方面的作用已越来越为 研究者们所关注。对选择性剪接的深入研究有助于深入理解不同的细胞、组织和发育 的不同阶段基因表达的调节机制，有助于揭示遗传、发育和进化的联系。从选择性剪 接涉及的基因分布格局分析， 选择性剪接多发生在参与信号传导和表达调节等复杂过 程的基因上，如受体、信号传导通路(凋亡)、转录因子等[3]。 开花过程（即成花）在相当程度上决定着繁育是否成功，是高等植物最关键的生 命时期之一，近年来已成为植物生殖发育研究的新热点，并且该领域的研究对农业和 园艺生产有着重要意义。研究者们通过 30 多年对成花相关基因的克隆、功能及这些 基因间相互作用的研究，已经揭示了很多机制，并建立了一些由内源生理因素和外部 环境信号诱导的成花及其调控的分子网络模型。其中，LFY 是目前研究得比较深入的 成花相关基因之一。LFY 基因在花分生组织的启动，花分生组织特性的决定及花器官 形成中都起重要作用，并被认为是很多植物生长发育向生殖发育转变的中心调节剂。 成花过程是很多调控机制的有机组合和协调作用。其中，成花过程中涉及的选择 性剪接已成为一个重要的研究部分。而这方面的研究进展并不多，人们仍然不能完全 地、系统地阐明成花过程中复杂的分子调控机制。因此研究者仍需对成花在分子水平 进行全面、 深入的研究。 另外， 对成花诱导、 调控相关基因的应用性研究也有所开展。 近来对植物基因的选择性剪接有了重要的认识,但对于植物开花途径中可能存在 的选择性剪接，仍需大量的研究工作，以确定更多植物成花及其它生理进程的选择性-1-成花调控基因 LFY 的选择性剪接及其功能研究剪接事件。本研究拟进行成花调控基因 LFY 的表达分析，及对其可能的选择性剪接 进行研究；相对比已有诸多报道的 1263bp 片段，本研究将通过基因转移，对较少报 道的 LFY 基因另一选择性剪接产物（1275bp 片段）进行一定的功能验证。2 研究进展2.1 LFY 基因及植物成花分子调控机制的研究进展成花是高等植物最关键的生命时期之一，某种意义上它决定着物种的繁衍[4]。在 过去的十多年里，研究者们对成花诱导，成花模型及花器官特性的分子遗传机制的研 究成果主要是通过对金鱼草(Antirrhinum majus)，拟南芥(Arabidopsis thaliana)，矮牵 牛(Petunia hybrida)及水稻(Oryza sativa)等模式植物的研究所获得[5]。广义的讲，成花 在时间上可以分为四个连续的阶段。第一阶段，由一些开花时间基因所控制，植物对 来自环境和内源的信号做出反应，从营养生长向生殖生长转变；第二阶段，从多个开 花调控途径而来的信号被整合后，激活了一组花分生组织特性基因；第三阶段，花分 生组织特性基因分别激活各个区域的花器官特性基因；第四阶段，花器官特性基因激 活下游的决定多种细胞型和组织的“器官建成”基因形成四种花器官[5-8]。 其中，自 Weigel 实验室首次鉴定了 LFY 基因在成花中起关键调节作用以来[7]， 国内外学者对该基因在花发育网络调控中的作用已有深入的研究并取得了一些有价 值的成果。1.2.1.1 LFY 基因的分离及表达研究 Coen 等（1990）从金鱼草中分离得到 LFY 同源基因 FLO，并发现其在花分生组 织形成时起着重要作用[6]。 Weigel 等（1992）从野生型拟南芥 Col.生态亚型中克隆了全长 LFY 基因，通过-2-前言对其表达方式及转基因的研究发现， LFY 基因不仅控制着花序分生组织向花分生组织 的转变，且控制着开花时间[7-11]。此后，科学家们相继从多种植物中分离克隆了 LFY 的同源基因。Maizel 等通过对 LFY 及其同源基因产物（为转录因子）进行分析，比 较了相对保守的 N 端和 C 端区域。发现在生化水平上，这两个部分在不同物种间的 活性存在一定差异。并且在 LFY 编码产物中，这两个部分比其它进化快的区域更能 影响 LFY 蛋白的活性[12]。 LFY 是花分生组织特性基因， 亦是决定从营养生长向生殖生长阶段转变的重要元 件[13]，但其并非专一表达于花组织或成花相关组织[14]。在长日照条件下，拟南芥在 生长早期便开花[13]，LFY 基因在拟南芥成花转变前的叶原基和整个营养性发育阶段 均有表达[15]。在短日照条件下，拟南芥开花虽比长日条件下晚几周，但是 LFY 基因 的表达量在开花前渐渐增加[13]。又如，在番茄发育的早期，检测到 LFY 同源基因在 茎尖分生组织表达增强[16]。 LFY 基因表达强度有其时空性特点。柑橘的 LFY 同源基因在营养芽中的表达强 度明显低于花芽[17]。开花诱导后，LFY mRNA 起初积累于顶端花序分生组织的周边， 继而强表达于花原基， 而后在花发育过程中持续表达[7]。 水稻的 LFY 同源基因表达于 正在发育的圆锥花序却不表达于以后出现的小花[18]。LFY 基因的表达水平是动态变 化的，LFY 的过量表达只会使拟南芥提早成花。但在激活花分生组织中，只有当 LFY 基因的表达量达到一定量（阈值）才能发挥其生物学功能[13, 14]。 1.2.1.2 LFY 基因与成花诱导途径的研究 在植物个体发育中，花的分化（成花起始阶段）是生殖生长的开始，包括: 花决 定，营养性分生组织向花序分生组织转变，再由花序分生组织转变为花分生组织，花 分生组织特性基因活化下游花器官属性基因，花器官分化启动，花分生组织属性的保 持和花分生组织属性逆转的防止等。 在花发育的每一个过程中都伴随着基因的差异表 达。 LFY 基因，首先，协同其他诱导成花基因抑止分生组织的营养性发育。在成花转 变前 LFY 表达于叶原基，待其活性升高到一定水平则抑止叶原基的启动，而有助于 更多的分生组织细胞用于花原基形成[19, 20]。LFY 基因和 AP1 基因共同抑止花序分生 组织特性基因 EMF 的活性，从而促进花序分生组织向花分生组织的转变[21]。在一定-3-成花调控基因 LFY 的选择性剪接及其功能研究条件下 LFY 和 AP1 基因也会对 TFL1(分生组织中表达的基因，促进花序分生组织的 形成，抑止花分生组织特性基因的表达)的表达起负调控作用，如长日条件下的 35S::LFY 转基因植株未能检出 TFL1 表达， 而在 lfy 突变植株的基部节中可以检出 TFL1 的 RNA[22]。 LFY 基因目前被认为更为关键的作用是其作为花分生组织特性基因参与从花分 生组织形成，正常功能的维持到防止花分生组织逆转的整个过程。LFY 促进花分生组 织的形成和花分生组织属性的控制[7, 23]。LFY 参与维持花分生组织的正常功能[24]、 成花启动[25]、防止花分生组织的逆转[26]。LFY 基因作用于同样是花分生组织特性基 因的 AP1 之前[25]，且 AP1 基因是 LFY 的直接靶基因，LFY 的表达早于任何可见的花 器官启动[27]。这些事实表明 LFY 基因在诸多花分生组织特性基因中处于较为关键的 地位。 除此之外， LFY 基因还活化花器官特性基因。 Parcy 等研究发现 LFY 和 UNUSUAL FLORAL ORGANS(UFO)基因共同作用，激活花器官特性基因中 B 组基因 AP3[28]。且 LFY 正调同样属于 B 组基因的 PISTILLATA(PI)。 LFY 基因同样激活花器官特性基因中 C 组基因 AG[28]。LFY 和 WUSCHEL(WUS)基因协同作用，在第 3，4 轮花结构中激活 AG 基因[29]。 LFY 基因表达于花瓣、 花丝雌蕊， 还强表达于心皮分生组织， 印证了 LFY 在整个花发育过程中均表达[7]。LFY 基因即参与花分生组织特性的决定，又参与花分 生组织的进一步发育。可见，LFY 基因在成花过程中的作用并不局限于开花时间的调 控及成花转变，而是在花序和花发育的大部分阶段中都起着作用。 Weigel 和 Nilsson 曾提出 LFY 基因编码成花感受态因子(floral competence factor)， 但是很难推断 LFY 基因编码了某种专一的因子而能产生多效性[30]。 为了揭示启动植物开花和营养生长到生殖生长转变的机制， 近年来研究者们利用 拟南芥做了大量研究。植物开花调控受许多因素影响，其中光照(光质、光强、日照 长短)和温度是主要的外部因素，自主途径因子和赤霉素(Gibberellins, GAs)是主要的 内部因素。此外，植物的生理状况(如年龄、植株大小)、胁迫条件(如干旱、营养匮乏、 拥挤、病害、极点温度)、植物激素、水杨酸、碳水化合物、维生素 C、谷胱甘肽、 过氧化氢、Ca2+浓度、microRNA 等也对开花调控产生一定的影响。目前通过对开花 诱导分子遗传水平的研究，人们发现许多基因参与其中，并筛选了许多突变体及开展 了相关突变基因的克隆和功能研究。科学家们已确定了 4 条最主要的成花调控途径：-4-前言光周期途径(photoperiod response pathway)、春化途径(vernalization response pathway)、 自主途径(autonomous pathway)和赤霉素途径(GA pathway)[31, 32]。其中前两条途径主 要受环境因素的影响，后两条途径受植物体自身发育状况的调控[34, 39]。1.2.1.3 LFY 基因与光周期途径(Photoperiod Response Pathway)日照长度(即光周期)是影响开花时间的主要因素之一。植物对昼夜相对长度的反 应称为光周期现象(photoperidism)。光周期期诱导途径，即长日照途径，可将光照时 间信号与植物开花的启动联系在一起。目前发现，在光周期途径中的主要调控基因有 CONSTANS(CO)、CRYPTOCHROME2(CRY2)、GIGANTEA(GI)、PHYTOCHROME A(PHYA)、EARLY BLOTING IN SHORT DAYS(EBS)、FLOWERING LOCUS T(FT)和 FLOWERING LOCUS WA(FWA)等[31,39]。 植物感受光周期的两个组成部分为：光受体(Photoreceptor)和昼夜节律钟 (Circadian Clock)。光受体分为三类：光敏素(phytochrome, 吸收红光/红外光)、隐光 素(隐花色素)(cryptochrome, 对蓝光/紫外光敏感)和趋光素(phototropin)[33]。在拟南芥 中至少存在 5 种光敏素：PHYA，PHYB，PHYC，PHYD 和 PHYE; 2 种隐光素: CRY1 和 CRY2。其中 PHYA, CRY1 和 CRY2 促进开花, PHYB, PHYD 和 PHYE 抑制开花[35-37]。昼夜节律钟是植物内在的计时器，调节植物的生理状态与外界节律同步[38]。目前从拟南芥中克隆了 4 个昼夜节律相关基因 TIMING OF CAB EXPRESSION1(TOC1)，EARLY FLOWERING4(ELF4)，LATE ELONGATED HYPOCOTYL(LHY)和 CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED1(CCA1)，以上 4 个基因直接 参与节律系统构成的反馈环，是反馈环中的重要成分[31,32]。 光对开花时间的调节一般是通过这样一个过程实现的： 不同波长的光被其受体接 受，由光信号传导分子传递到昼夜节律钟。而后，通过信号输出途径，将信号传输给 处在光周期途径下游的关键基因 CO(将光信号转变为开花信号，起纽带作用)。CO 最 终直接激活 FT、SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1(SOC1)的转录，启动 开花。Laurent Corbesier 等最近研究表明植物叶片在白昼长度变化的影响下可使 CO 基因得到表达，进而开启 FT 基因，产生 FT 蛋白，FT 蛋白通过植物脉管系统到达茎-5-成花调控基因 LFY 的选择性剪接及其功能研究顶端组织，激活其他基因并引起植物开花的全过程[40]。同时 Shojiro Tamaki 等在对水 稻中该基因的同源体研究中发现相似机制[41]。 一些研究者推断 FT 蛋白是一种在植物 中能够迁移的开花激活因素，即“开花素（florigen）”。 在光周期途径中 LFY 基因的表达需要 FWA 基因， 而当 LFY 的活性缺失时， FWA、 FT 基因则活化 AP1 基因诱导开花[42]。CO 基因则在长日下被诱导表达从而通过作用 于 SOC1 基因启动 LFY 基因表达[43]。CO 基因对 LFY 基因的正调关系表明了开花时 间基因和花分生组织的联系。研究证实，拟南芥光敏素基因 PHYA 突变表现开花时间 推迟， PHYTOCHROME B(PHYB)基因突变表现开花时间提前， 这表明 PHYB 抑制开 花。进一步研究发现，PHYB 基因突变株中伴随着 LFY 基因表达量增加和活化 LFY 启动子的活性，而隐花色素基因 CRY2 突变则抑止 LFY 启动子的活性。LFY 接受上游 光周期途径的信号后启动下游成花相关基因从而诱导成花[44]。1.2.1.4 LFY 基因与春化途径(Vernalization Response Pathway)对于大多数冬性两年生 （或一年生） 植物来说， 经一定低温处理(一般为 0℃～10℃, 1～8 周)，能够促进其提前开花，即所谓春化作用。春化作用可通过有丝分裂稳定遗 传，但在减数分裂后消失，为表观遗传表现。对拟南芥研究表明：春化作用主要是引 起染色质结构改变，负调控开花抑制基因 FLOWERING LOCUSC(FLC)，解除其对开 花的抑制。FLC 为 MADS-Box 家族转录因子。FRIGIDA(FRI)协助 FLC 高水平表达， 从而延迟开花。低温抑制 FRI，使 FLC 低水平表达，VERNALIZATION- INSENSITIVE 3(VIN3), VERNALIZATION 1(VRN1), VERNALIZATION 2(VRN2), VERNALIZATION 3(VRN3), VERNALIZATION 4(VRN4)和 VERNALIZATION 5(VRN5)基因持续抑制[45,46]， 从而释放被 FLC 抑制的 SOC1、 等基因的活性， FT 诱导 LFY 基因表达， 促进开花[47]。 另有研究发现 flc 功能缺失突变体也能对春化作出反应，推测可能还存在不依赖于上 述机制的春化途径[44, 48]。-6-前言1.2.1.5 LFY 基因与自主途径(Autonomous Pathway)自主途径是指在长日照或短日照条件下总是促进植物开花， 而不依赖于环境因素 的开花转换的遗传途径。自主途径突变体比野生型延迟开花，短日条件下更为明显[31]。 目前已确定的一些自主途径基因： FCA、 、 、 FPA FY FLOWERINGLOCUS D(FLD)、LUMINIDEPENDENS(LD)、FVE、FLOWERING LOCUS K(FLK)[48-50]。但是这些基因 间并不是简单的线性关系，而是彼此独立且相互平行的途径控制 FLC 的表达的[51]。 其中 FCA、FPA、FY 和 FLK 都编码 RNA 结合蛋白(RNA binding protein, RBP)[49, 50]， 转录后调控 FLC。LD 编码一个核蛋白，通过调控 LFY 的表达实现对开花的调节，且 LD 参与促进 LFY 和 AP1 间的相互作用。 FLD 和 FVE 编码调节 FLC 的表观遗传因 而 子，对 FLC 染色质进行后期修饰，使其组蛋白去乙酰化[53]，造成 FLC 失活，同时 FLD 促进 LFY 表达，启动开花。1.2.1.6 LFY 基因与赤霉素途径(GA Pathway)赤霉素(Gibberellins, GAs)调控着植物一系列的生长发育过程，如茎(尖)的伸长， 发芽及成花时间和花发育等。 GA 对开花时间的调控是其生物学功能的一个重要方 而 面。研究表明，在 GA 合成突变体 ga1-3 中，拟南芥植株无法合成 GA，且在短日照 条件下开花极度延迟（甚至不开花） ，而在长日照下这种突变就显得不是那么明显[54-56]。 突变体ga1-3 在短日照下开花极度延迟的原因是其不能激活花分生组织特性基因 LFY 的表达[57]。 目前已克隆了一些 GA 生物合成相关基因， GA1， 如 GA4 和 GA5。 当植株接受外源或内源的诱导信号时，GA 生物合成被启动，产生活性 GA，后被受 体识别激活 GA 信号传导途径，向下游传递信号，促进基因 SOC1、FLOWERING PROMOTING FACTOR1(FPF1)及 GAMYB-like 的表达，这些基因进而正调 LFY 基因， 启动开花[14, 31, 57]。最近研究证实 GA4 是调控 LFY 基因转录及拟南芥成花诱导的活 性 GA[58]。可见，GA 途径启动的开花分子机制是激活花分生组织特性基因 LFY 的启 动子，促进 LFY 基因表达。-7-成花调控基因 LFY 的选择性剪接及其功能研究1.2.1.7 LFY 基因与成花诱导途径的整合――成花分子调控网络这些接受不同外源环境信号和内源生理信号的开花诱导(遗传)途径，是彼此相对 独立的，但是这些途径又相互交叉，且汇合集中诱导一部分下游基因的表达――成花 诱导途径整合子。这就形成了一个复杂的成花调控网络。 在拟南芥中，已经发现三个成花诱导途径整合子(基因): SOC1、FT 和 LFY[44, 59]。 它们是上述几条成花诱导途径的共同靶基因。 LFY 作为花分生组织特性基因，其处于花发育调控网络的关键位置，扮演着重要 角色。LFY 基因在花分生组织的启动，花分生组织特性的决定及花器官形成中都起重 要作用。因此，LFY 基因被认为是生长发育向生殖发育转变的中心调节剂之一[60]。 光周期途径中的 CO 基因通过对 SOC1 的作用间接地调节 LFY 基因的表达， AGL24 且 参与了 SOC1 对 LFY 的表达调控[61]。自主途径中的 LD 基因部分正调 LFY 基因，促 进 LFY 与 AP1 的相互作用[62, 63]， 也揭示了 LFY 基因接受来自自主途径的信号而整合。 最近研究证实的 GA4 调控 LFY 基因转录及拟南芥成花诱导的活性[58]，同样证实 GA 途径与 LFY 的密切联系。可见，上述三条途径(长日照，自主，GA 途径)均与 LFY 基 因关联， 且都正调 LFY 基因表达。 同时 LFY 基因与同样为花分生组织特性基因的 AP1、 AP2、CAL 等相互促进，与成花抑制基因 TFL、EMF 等相互拮抗，调控成花。并且 LFY 正调 ABC 模型中的 A 组基因(LUG)、B 组基因(AP3、PI)、C 组基因(AG)等花器 官基因的表达，而诱导花器官的建成。以上这些事实表明：相当一部分成花相关基因 都与 LFY 基因联系，且大部分为正调关系，LFY 基因的表达促进并诱导成花。多个 基因对 LFY 的正调，也揭示了促进 LFY 基因的表达(或者说整合于 LFY 基因)的途径 是多样的。 根据笔者所了解的 LFY 基因参与的成花分子调控网络，整理成图 1 (Figure 1):-8-前言Figure 1图 1 花发育的分子调控网络 Molecular regulatory network in floral development-9-成花调控基因 LFY 的选择性剪接及其功能研究1.2.2 选择性剪接的研究进展真核生物的基因大都为断裂基因（interrupted genes） ，通过内含子的切除并把外 显子按一定顺序拼接起来形成成熟的 mRNA，再经过翻译产生蛋白质是一种最普遍 的基因表达方式。真核生物编码基因必须通过去除内含子，连接外显子才能形成成熟 的 mRNA，这一加工过程称为前体 mRNA 的剪接或拼接，它包括组成性剪接 (constitutive splicing, CS)和选择性剪接或称可变剪接(alternative splicing, AS)。其中选 择性剪接是指选择性地对前体 mRNA 不同的剪接位点的组合剪接加工，形成不同的 成熟 mRNA，进而产生结构和功能不同的基因产物的过程。可变剪接是真核生物的 一种基本而重要的调节机制，由于它不牵涉到遗传信息的永久性改变，所以又是一种 比较灵活的调控方式。 可增加蛋白质种类和数量的方式有 DNA 重组、 RNA 编辑和选 择性剪接等，而选择性剪接是产生如此众多蛋白质的主要机制[64, 65] 。它精细协调基 因的功能， 高效调节基因的适地、 适时、 适量表达以及创造基因产物的多样化(diversity) 和复杂程度，影响主要发育方向的决定，对细胞的生长、分化、发育、生理功能和病 理状态，对生物个体的免疫，抗性等都有重要意义。越来越多的证据表明选择性剪接 有助于解释基因数目与生物复杂程度两者的不一致性。因此，前体 mRNA 选择性剪 接的生物学意义成为一个值得探讨的热点问题1.2.2.1 选择性剪接的研究概况对动物和人的研究表明，选择性剪接是一种重要的转录后调控机制，提高基因产 物的多样性，打破了“一个基因，一个蛋白”的假说。理论上果蝇的 DSCAM 基因通过 选择性剪接可以产生 38016 个转录本。这个数字是预测的果蝇中所有基因总数的 2～ 3 倍。而且越是高等的生物，发生选择性剪接的基因越多。Microarray 结果显示 70～ 80%的人类基因发生了选择性剪接[66]。 尤其重要的是， 当基因内由突变产生新的剪接 位点时，旧的剪接依然存在，使生物机体不因突变而失去原有的蛋白质。新旧蛋白质 并存使机体能在长时间内对它们进行选择，只有对生物机体有益的突变才被固定下- 10 -前言来，这被认为是十分有效的进化方式。由于选择性剪接是生物机体内创造基因产物多 样性最强有力的工具，因此，在后基因组学时代吸引了无数研究者的注意力。1.2.2.2 选择性剪接的位点及其基本形式RNA 剪接研究中的重大发现之一就是选择性剪接，即在同一个基因中，其剪接 位点和拼接方式可以改变，从而导致一个基因能产生多个相关蛋白质同原体 （isoform） 。内含子 5’剪接点称为供体点(donor site)，3’剪接点称为受体点(acceptor site)。研究表明选择性剪接的识别位点中，内含子 5’和 3’末端的两对碱基最为保守， 大多数情况为 GU-AG(约占 99.24%)，少数为 GC-AG(约占 0.7%)，极少数为 AT-AC （0.05%)。除了这两对保守碱基外，他们附近的碱基在不同物种间存在差异，但在物 种内有保守性。如如脊椎动物 5’剪接信号 AG|GUAAGU。分枝点（branch site）通常 位于 3’剪接点上游 50bp，处于一段富含嘧啶的区域，分枝点腺嘌呤(A)附近区域为 YNYURAY[67]。 一般来说，选择性剪接方式多样，主要有以下几种[68]：- 11 -成花调控基因 LFY 的选择性剪接及其功能研究图 2 选择性剪接的基本方式 Figure 2 Elementary alternative splicing在人类基因上又发现一种新颖的可变剪接方式――反式选择性剪接[69]，这种反 式可变剪接与顺式可变剪接不同，顺式 AS 是利用同一前体 mRNA 上的外显子发生 剪接，而反式 AS 是利用不同的前体 mRNA 上的外显子剪接成为不同成熟的 mRNA 的过程。因此，反式 AS 在人类基因上的发现使 AS 产生的机制变得更加复杂。1.2.2.3 选择性剪接的调控 现在已经知道，前体 mRNA 的剪接是基于对剪接位点识别基础上，由被称为剪 接体的核酸蛋白复合物完成的。剪接体包含了 5 种 snRNPs (small nuclear- 12 -前言ribonucleoprotein particles，核内小核糖核蛋白颗粒） ，即 U1、U2 和 U4/5/6 和超过 200 种的蛋白质因子，这些蛋白质包括富含精氨酸-丝氨酸的 SR 蛋白（SR 蛋白家族）和 非 SR 蛋白包括 hnRNPs（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein particles，不均一核 糖核蛋白颗粒）蛋白家族、RNA 螺旋酶、 激酶等[70]。 (1) 剪接体的组装 剪接体早期组装过程即识别内含子的两端序列是剪接调节的关键步骤。 1 ○ 剪接体的组装 ,首先是不同的剪接因子通过其 N 末端的 RNA 连结域特异性地识别不同的外显子剪接增强子(exon splicing enhancers, ESEs)或内含子剪接增强子 (intron splicing enhancers, ISEs)和沉默子(exon splicing silencers or intron splicing silencers, ESSs or ISSs)从而通过外显子限定(exon definition)或内含子桥连(intron 这些剪接因子的 C 末端的富含 Arg/ Ser 结构域通过蛋 bridge)来确定需要剪接的部位。 白和蛋白之间的相互作用与 U1270KsnRNP 和 U2AF35 (U2snRNP auxiliary factor)相似 的富含 Arg/ Ser 结构域结合， 因此促进 U1-70KsnRNP 和 U2AF35 分别连结到 5’端和 3’端的剪接位点， 同时 SF1 ( splice factor 1)结合到分枝点(branch point sequence, BPS)， U2AF65 结合到多聚嘧啶区(polypyrimidine tract, PPT)，进一步在 ATP 作用下 U2 ， U4/U6， U5snRNPs 及一系列的非 snRNP 剪接因子和另一些剪接因子增加到剪接体中， 从而完成剪接体的组装过程[71]。 2 ○ 再经过两个连续的转酯反应完成了内含子的切除和外显子的连接完成成熟mRNA 的加工[72]。(2) 剪接因子调控选择性剪接 剪接体的组装是 AS 主要的调节靶点，它涉及大量的剪接因子。剪接因子作为一 种反式作用因子， 能识别和结合一些在内含子或外显子上的正(剪接增强子)和负(剪接 沉默子)调控的顺式作用元件， 从而调控剪接产生不同的剪接方式。 其中 SR 蛋白质家 族和 hnRNPs 蛋白质家族之间的拮抗作用代表了选择性剪接调控的基本机制。 实际上 组织细胞特异性剪接是由多种因子和调节子通过极其复杂的相互作用而实现的。 这里 仅讨论 SR 蛋白质家族和 hnRNPs 蛋白质家族。- 13 -成花调控基因 LFY 的选择性剪接及其功能研究1 ○SR 蛋白家族SR 蛋白家族是一组富含丝氨酸/精氨酸的蛋白家族，包括 SR 蛋白和 SR 相关蛋 白(SRrps)。目前已发现 SRp20、9G8、SF2/ASF(SRp30a)、SC35(SRp30b)、SRp30c、 SRp40、SRp46、P54、SRp55、SRp75。在多细胞生物中高度保守，其基本结构特征 为 N 末端含有 1 个或 2 个 RNA 识别基序(RNA recognition motif, RRM)，C 末端富含 长度可变的丝氨酸/精氨酸二肽结构域(arginine/serine-rich domain, RS domain)。SR 蛋 白的 RRM 能特异性地识别和连结前体 mRNA 上的外显子剪接增强子(ESE)或内含子 剪接增强子(ISE)，而其 C 末端 RS 结构域则介导蛋白和蛋白的相互作用。另外 RS 结 构域磷酸化是其发挥作用的重要方式[73-76]。2 ○hnRNPs 蛋白质家族hnRNPs 蛋白质家族是一组由多种 RNA 结合蛋白组成的具有多种功能的多肽家 族。 其成员带有多种不同形式的 RNA 结合基序(RRM 或 KH 结构域)和富含甘氨酸结 构域。富含甘氨酸结构域可能参与蛋白-蛋白相互作用。其中 hnRNPA/B、hnRNPI、 hnRNPK 是 AS 非常重要的剪接调控因子。 SR 蛋白和 hnRNP 蛋白之间存在的拮抗作用表现为二者的相对浓度影响选择性 剪接方式。在生物体内，SR 蛋白和 hnRNPA/B 蛋白的相对含量对于组织特异性和发 育调节的选择性剪接模式起调控作用。 通过转基因改变相互拮抗的剪接因子在细胞水 平上也能够影响体内选择性剪接的方式[77-79]。1.2.2.4 植物选择性剪接的研究进展 对植物前体 mRNA 选择性剪接研究滞后于动物和人类，但近些年已有一些进展 性的报道[80, 81] 。植物前体 mRNA 的选择性剪接模式与动物相似，但其内含子被选 择保留在 mRNA 中是很常见的一种模式， 内含子被选择性地保留在成熟 mRNA 中而 不被切除，主要是由于对内含子剪接位点识别能力的减弱造成的[82]。Brown 和 Simpson (1998)研究表明分散于植物内含子中的富含 UA 序列是精确选择 5' 和 3' 剪 接位点(splicing site, ss)并进行有效剪接的必要条件，且富含 UA 序列对植物内含子剪- 14 -前言接比对动物内含子剪接更为重要。 拟南芥基因组中绝大多数发生选择性剪接的基因编码的蛋白都与调控功能有关。 植物前体 mRNA 选择性剪接，最早是 Werneke 等（1989）研究发现 RCA 基因在菠菜 和拟南芥的叶片中均可发生选择性剪接，在菠菜中形成 41 和 45kd 两个同源体，在拟 南芥中形成 44 和 47kd 两个同源体，两个同源体的序列仅在 C 末端存在差别。在拟 南芥中，两个同源体都具有催化 Rubisco 的活性，研究还表明 RCA 基因在拟南芥和 菠菜中的剪接模式和剪接位点相同，但两个同源体相对含量不同[83, 84] 。 相对于较复杂的选择性剪接形式及机制阐明的研究来说，对植物前体 mRNA 选 择性剪接体的识别研究报道较多。 很多研究者也把目光放在了旧基因发现新剪接体及 新剪接体基因的发现和功能阐明上。 生物信息学研究表明, 4%的大麦基因[85]、 11.6%的拟南芥基因[86]和 10%的水稻基 因发生了选择性剪接[87]，并且在水稻中检测到大量基因在第一外显子发生选择性剪 接[88]。除了核基因组的基因外, 线粒体和叶绿体的基因也会发生选择性剪接[89-91]。1.2.2.5 选择性剪接与植物抗性 近年来，越来越多的研究证实，与植物抗性相关的基因往往容易发生选择性剪接[92]。Zhang等（2007）对拟南芥抗病基因 RPS4 的研究中显示该基因在细菌感染后作出的抗性反应时，表达两种可变剪接体（完全转录本和被删减了一段序列的转录本） ， 并且不只局限于该基因， 而表现出 AS 存在于广泛的植物抗性应答机制中[93] 。 研究 显示植物可能通过与逆境胁迫相关基因的选择性剪接来调控抗逆基因的表达以适应 逆境。许多与抗逆相关的激酶蛋白，如剪接因子 SR 蛋白自身也受选择性剪接的调控[79, 94]。1.2.2.6 选择性剪接与植物生长发育 除上述免疫和抗性外， 在植物中, 选择性剪接还通过作用于信号传导、 转录因子、 蛋白质转运及定位，基因产物的稳定性等方面, 调控植物的生长发育。- 15 -成花调控基因 LFY 的选择性剪接及其功能研究(1) 植物对各种与生长发育相关的内源信息分子和外源信号因子的反应中，相应 基因表达的转录调控是其一个关键部分。 其中与转录相关的因子在此过程中调节基因 的表达具有重要的作用。在人类和其他动物中的研究表明，为了更加有效地调节生长 发育，转录因子及其它调控因子常常受到选择性剪接的调控。植物中这部分因子的选 择性剪接可能具有多种作用， 可以通过选择性剪接产生多个参与不同生理功能的剪接 异构体，也可以通过选择性剪接产生的错误剪接形式的 mRNA 对基因进行负调控[95,81]。(2) 植物成花过程涉及到极为复杂的信号识别、接收、传导或级联效应等过程。 如图 3[96]所示，目前成花途径相关基因的可变剪接研究已有涉及，但深入研究的报道 并不多。- 16 -前言- 17 -成花调控基因 LFY 的选择性剪接及其功能研究其中 FCA 是植物开花启动基因之一， 含有 20 个内含子。 FCA 启动开花是通过对 光周期-自主开花途径中的关键调节基因 FLOWERING LOCUS C(FLC)的抑制实现的。 FCA 通过第 3 和第 13 内含子的可变剪接能够产生 4 种转录本：α, β, γ, δ。含量占 35 ％的转录本 γ 为正确的内含子剪接体且包括所有蛋白质编码序列，其编码两个 RNA 结合基序和一个 WW 结构域，在植物自主开花途径信号传递中蛋白质间的互作扮演 一定角色。含量最多的转录本 β(占 55％)，包含被切除了多聚腺苷酸的第 3 内含子而 形成一个剪短了的转录本， 只包括了 N 末端的很少一部分且缺少 RNA 结合结构域和 WW 结构域。 含量约 10％的转录本 δ 的第 13 内含子发生可变剪接而提前出现终止密 码，导致其产物为一个只含有 RNA 结合结构域而缺乏 WW 结构域及其下游 63 个氨 基酸的残肽。转录本 α(含量不到 1％)，保留了第 3 内含子并提前出现终止密码。在 不同生长条件下，不同组织和细胞中上述四种分子的相对比例并无变化。可变剪接使 得 WW 结构域的存在与否决定了 FCA 转录本中的 RNA 结合结构域的活性和特异性 及该转录本是否能够参与蛋白质间的互作而在自主开花诱导途径中发挥应有的功能， 从而诱导植物成花[97, 98]。 而 LFY 基因作为植物成花途径中最关键调控因子之一（见图 2，3） ，曾有研究显 示在第一外显子、第一内含子和第二外显子间的部分序列存在可变剪接现象[7]，但后 来就未见对此可变剪接的进一步研究报道。 综上所述，选择性剪接是机体满足各种发育阶段、各种生理环境需要的重要调节 机制。其在增加基因产物多样性，使基因产生时空表达差异以行使不同功能中发挥重 要作用。另外，实验结合一定生物信息学手段对选择性剪接的研究有助于阐明细胞、 组织和发育的不同阶段基因表达的调节和生命本质。 随着大量选择性剪接基因的鉴定 和功能明确，有望解释选择性剪接的信号传导机制，调控机制，确定由选择性剪接产 生的不同产物的功能。- 18 -2 LFY 基因 cDNA 的克隆及序列分析2 LFY 基因 cDNA 的克隆及序列分析2.1 材料与方法2.1.1 材料与试剂 2.1.1.1 植物材料 拟南芥 Arabidopsis thaliana (L.) Heynh，Columbia 生态亚型，由昆明植物研究所 李婉莎老师惠赠。2.1.1.2 菌株及质粒载体 大肠杆菌 DH5α 由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所分子室惠赠。2.1.1.3 试剂 TRNzol 植物总 RNA 提取试剂、 50bp DNA ladder、 DNA Marker I 购自 TIANGEN 公司；逆转录酶 M-MLV(RNase H? )RTase、oligo(dT)、dNTPs、Taq DNA polymerase、 DL2000 marker、克隆载体 pMD18－T Vector 等购自 TaKaRa（大连）公司；PCR 产物 回收纯化试剂盒、B 型质粒小样快速提取试剂盒等购自 BioDev-Tech 公司；常规化学 试剂均购自北京鼎国生物公司。2.1.1.4 主要仪器 Centrifuge 5417R 型离心机 PTC-200 PCR 仪- 19 -Eppendorf BioRad成花调控基因 LFY 的选择性剪接及其功能研究电泳仪 DYY7B 超净工作台 Series 100 BioSpectrum Imaging System 凝胶成像系统 引物合成和基因测序北京六一仪器厂 北京半导体设备一厂 UVP, Inc TIANGEN2.1.1.5 软件 BioXM 2.6 Chroms: 1.62 DNAssist 1.0 DANMAN 6.0.3.4 VisionWorks LS2.1.2 方法 2.1.2.1 拟南芥总 RNA 的提取 采用 TIANGEN 公司的 TRNzol 植物总 RNA 提取试剂，具体方法如下（每步操 作、试剂、容器等均为 RNase-free） ： (1) 取已进入开花期拟南芥整株于研钵中，加入液氮，迅速充分研碎材料至细粉 末状； (2) 迅速将上述粉末转入 1.5 ml eppendorf 离心管（下称 1.5 ml ep 管）中，并加 入 1.0 ml 冰冷的提取液，颠倒混匀，室温放置 8～10 minutes； (3) 于 4℃，12000rpm，离心 15 minutes； (4) 小心取出管中液相部分于新离心管中（弃去沉淀） ，加入 1/3 倍体积预冷的氯 仿，轻柔颠倒混匀，冰上放置 10 minutes； (5) 4℃，12000rpm，离心 10 minutes； (6) 小心取出管中上部水相部分于新 1.5 ml ep 管中，加入等体积预冷的异丙醇， 颠倒混匀，冰上放置 10 minutes；- 20 -2 LFY 基因 cDNA 的克隆及序列分析(7) 4℃，12000rpm，离心 10 minutes； (8) 小心弃去上清，加入 700?l 75％乙醇溶液，温柔颠倒充分悬浮、洗涤沉淀； (9) 4℃，5000rpm，离心 3 minutes，小心弃去上清； (10) 重复步骤 8、9 一次，于超净台上干燥 RNA 沉淀； (11) 于管中加入适量体积的 RNase-free ddH2O 溶解 RNA，保存于－20℃待用或 于－70℃中长期保存。 1.2％琼脂糖凝胶电泳检测提取总 RNA 质量。2.1.2.2 拟南芥 LFY 基因 cDNA 第一链合成 逆转录反应体系如下：总 RNA oligo (dT)(2?g/?l) 5 × Buffer dNTPs (2.5mM) RNase Inhibitor (30u/?l) M-MLV RTase (30u/?l) Total Vol. 于 PCR 仪中 42℃反应 60min，置于－20℃备用。13.5?l 0.5?l 4?l 1?l 0.5?l 0.5?l 20?l2.1.2.3 PCR 扩增 根据拟南芥 LFY 基因 cDNA 及基因组序列（GenBank NM_125579，M91208） ， 包含完整的开放阅读框序列设计一对特异引物，引物序列如下： LFY Primer Forward: 5’-ATGGATCCTGAAGGTTTCACGAG-3’ LFY Primer Reverse: 5’-CTAGAAACGCAAGTCGTCGCCG-3’ 引物与 cDNA 序列的关系如下图：- 21 -成花调控基因 LFY 的选择性剪接及其功能研究图 4 LFY 引物位置 Figure 4 Position of LFY primers以上述合成的 LFY cDNA 第一链为模板， LFY Primers 进行 PCR 扩增目的片段， 用 反应体系为：10×Taq DNA polymerase buffer Mg2＋ (25 mM) dNTPs (2.5 mM) LFY PF (12.5pm/?l) LFY PR (12.5pm/?l) cDNA 第一链反应液 Taq DNA polymerase (5u/?l) ddH2O Total Vol. 于 PCR 仪中，反应程序如下：2.5?l 1.5?l 2.0?l 0.75?l 0.75?l 2.0?l 0.15?l 15.35?l 25?l94 ℃ 94 ℃ 66 ℃ 72 ℃ 72 ℃4 min 30s 30s 90s 7min 30～36 CyclesPCR 产物经 1％琼脂糖凝胶电泳检测- 22 -2 LFY 基因 cDNA 的克隆及序列分析2.1.2.4 PCR 产物的纯化 经检测的 PCR 产物在紫外照射下切取含有需测序分析的目的片段胶条，放入一 个 1.5 ml ep 管中， BioDev-Tech 公司小片段 DNA 回收纯化试剂盒说明操作， 按 如下： (1) 按 100?l 胶块加 700?l 溶胶液的比例，55℃水浴溶胶，其间偶尔摇动； (2) 待胶块完全熔化后转入离心柱，9000rpm，离心 1 min 去掉废液； (3) 向离心柱中加入 500?l 漂洗液（wash buffer）漂洗，12000rpm 离心 1min，重 复漂洗一次，倒掉废液以后，再于 12000rpm，离心 2min； (4) 在离心柱中加入适当体积的洗脱缓冲液（Elution buffer）置于新离心管中， 12000rpm 离心 2min 洗脱。 回收产物于-20℃保存待用。2.1.2.5 连接 经回收的目的片段经电泳估计浓度后，在 PCR 管中进行以下连接反应： （全部于 冰上操作）回收纯化片段 pMD18-T Vector（50ng/?l） Ligation Mix Total Vol. 水浴，16℃过夜连接。4?l 1?l 5?l 10?l2.1.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl2 法） (1) 从 E. coli DH5α 平板上挑取一个单菌落接种于 20 ml LB 液体培养基中， 220 r/min，37℃摇床振荡培养 12 小时；- 23 -成花调控基因 LFY 的选择性剪接及其功能研究(2) 取 200?l 菌液转接到一个含有 20 ml LB 液体培养基的锥形瓶中， 220r/min， 37℃摇床上培养 2～3 小时； (3) 将菌液分装到 20 个冰预冷的 1.5 ml ep 管中，冰上放置 10 min，4℃， 3500rpm，离心 10min； (4) 小心去上清，加入 1 ml 冰冷的 0.1M CaCl2 重悬沉淀，后置于冰上 30min； (5) 4℃，3500rpm 离心 5min，小心去上清，每管加入 100?l 冰冷的 0.1M CaCl2 （含 15%甘油）重悬沉淀，标记，放入－70℃冰箱中保存备用； (6) 同时做两个对照：各取 30?l 感受态细胞菌液分别涂于两个 LB 平板上（其 中一个含相应抗生素） (7) 结果观察：LB 平板上有大量菌落产生，加入抗生素的平板无任何菌落产 生为宜。2.1.2.7 连接产物的转化 按下列程序进行： (1) 于－70℃冰箱中取出已做好(100?l)感受态细胞（E. coli DH5α） ，取上述连接 产物 6?l 加入其中，混匀，冰浴 30min； (2) 迅速转入 42℃水浴，保持 90s； (3) 迅速取出置于冰中 1～2min； (4) 加入 800?l LB 液体培养基，混匀，于 37℃，220r/min 振荡恢复培养 1h； (5) 3000rpm 离心后弃去大部分培养液，取 100～200?l 培养物涂布于事先涂有 X-gal(3ml/L)和 IPTG(75ul/L)的含有 100?g/ml Amp 的 LB 平板上，待菌液被培养基吸 干后，倒置平板于温箱中 37℃暗培养 12h，观察是否有白色单菌落生长。2.1.2.8 菌落 PCR 检测 (1) 按 2.3.1 中 PCR 体系配制 PCR 反应液，模板体积用水代替； (2) 用枪尖从上述平板上挑取单菌落（注：切勿将菌落全部挑起）于上面配好的- 24 -2 LFY 基因 cDNA 的克隆及序列分析PCR 反应液中轻微混合； (3) 按 2.3.1 中 PCR 程序进行扩增； (4) PCR 扩增结束后进行凝胶电泳检测是否有目的片段插入载体中。2.1.2.9 重组克隆的筛选鉴定与保存 (1) 从转化平板上挑取经菌落 PCR 检测阳性的菌落分别接种到 5ml 含有 100?g/ml Amp 的 LB 液体培养基中，于 37℃，220r/min 振荡培养 12h。 (2) 质粒提取：按照 Bio-tech 公司 B 型小样快速提取试剂盒说明操作，如下： ① 收集 1.5～3ml 菌液沉淀于 1.5 ml ep 管中，加入 100?l 溶液 1，振荡至彻底悬 浮； ② 加入 150?l 溶液 2，立即轻柔颠倒，充分裂解菌体，菌液变清亮，随后将离 心管置于冰上 1min； ③ 加入 150?l 溶液 3，立即轻柔颠倒，冰上放置 5min 后，4℃，12000rpm，离 心 10min； ④ 将 420?l 结合缓冲液加入离心吸附柱，然后将上述离心后上清液加入离心吸 附柱中，混匀，4℃，12000rpm，离心 1min，倒掉废液； ⑤ 加入 750?l 漂洗液于离心吸附柱中， 静置 1-2min， 4℃， 12000rpm， 离心 30s， 倒掉废液；重复上述操作一次，再次于 4℃，12000rpm，离心 2min，倒掉废液； ⑥ 将离心吸附柱转入一新的 1.5 ml ep 管中，加入适量洗脱缓冲液或 ddH2O，室 温放置 5min，12000rpm 离心 2min，收集质粒。 于-20℃保存待用。2.1.2.10 测序和分析 测序由 TIANGEN 公司 3730 测序仪完成。 测序结果采用 Chroms 1.62， DANMAN 6.0.3.40，DNAssist 1.0 等软件进行分析。- 25 -成花调控基因 LFY 的选择性剪接及其功能研究2.2 结果2.2.1 拟南芥总 RNA 电泳检测 总 RNA 经 1.2％的琼脂糖凝胶电泳分离，28S、18S rRNA 明显可见，条带整齐 清晰，质量满足 RT-PCR 试验要求（如图 5）。图 5 拟南芥总 RNA 电泳图 Figure 5 Electrophoresis pattern of total RNA2.2.2 LFY cDNA PCR 产物电泳检测 利用前述合成的 LFY 基因 cDNA 第一链为模板，用 LFY Primers 进行 PCR 扩增 目的片段，RT-PCR 反应产物电泳见图 6。- 26 -2 LFY 基因 cDNA 的克隆及序列分析图 6 LFY cDNA 特异引物 PCR 扩增产物电泳检测 Figure 6 Electrophoresis pattern of PCR for LFY2.2.3 菌落 PCR 电泳 利用 LFY primers 对获得的部分克隆子进行了 PCR 鉴定，结果如图 7，挑选含有 预期大小目的条带的克隆子（图 7 中 1，2，4，5，6，7，10）送 TIANGEN 公司测 序。- 27 -成花调控基因 LFY 的选择性剪接及其功能研究Figure 7图 7 克隆子菌落 PCR 产物电泳 Electrophoresis pattern of PCR products for clones2.2.4 克隆子的测序 对上述克隆子测序结果显示，克隆子中存在下列两种分子：一个为 1263bp，一 个为 1275bp。与已报道的 LFY cDNA（GenBank NM_125579）比对发现，1263bp 片 段包含了完整的编码序列； 1275bp 片段则比上述片段多出了 12bp （如图 8） 除此外， 。 与已报道的 LFY cDNA 序列具有 100％同源性，也说明我们成功地克隆了完整的 LFY cDNA 编码区。- 28 -2 LFY 基因 cDNA 的克隆及序列分析图 8 克隆的 LFY cDNA 序列比对 Figure 8 Sequence alignment of LFY cDNA- 29 -成花调控基因 LFY 的选择性剪接及其功能研究2.3 分析及讨论对上述克隆子测序结果显示存在两种分子说明该 PCR 扩增产物为一混合群体， 1 ％的琼脂糖凝胶无法有效分开该大小差别的片段， 因此在片段回收纯化时同时获得了 两个片段。 通过 RT-PCR 反应，我们获得了两种 LFY 基因转录本的 cDNA，测序及序列比对 结果显示两片段在只是在内部存在连续的 12 个碱基的增减，其余部分完全匹配，并 没有出现移码突变等现象。结合已有资料和报道，我们推断 LFY 基因可能是由于前 体 mRNA 的选择性剪接产生了这一差异。为了进一步研究该问题，我们开展了下面 的研究工作。- 30 -3 LFY 基因选择性剪接转录本的差异表达研究3 LFY 基因选择性剪接转录本的差异表达研究3.1 材料与方法 3.1.1 材料与试剂 所用材料，试剂，仪器及软件等同前。3.1.2 方法 3.1.2.1 拟南芥总 RNA 的提取 材料分别采用未开花拟南芥莲座叶叶片、已进入开花期拟南芥花器官及茎生叶、 已进入开花期拟南芥莲座叶叶片。其它所采用试剂和方法同前。3.1.2.2 LFY 可变剪接转录本片段 cDNA 第一链合成 反应体系及方法同前。3.1.2.3 PCR 扩增 根据拟南芥 LFY 基因 cDNA 及基因组序列（GenBank NM_125579，M91208） ， 针对发生可变剪接的第一外显子、 第一内含子及第二外显子的部分序列设计一对特异 引物，所扩增序列大小为 180bp 左右，引物序列如下： LAS Primer Forward: 5'- GAAGAGGAATCTTCTAGACGCCG - 3' LAS Primer Reverse: 5'- CCAGTAACCACTTCCTCCTCCG - 3' 引物与 cDNA 序列的关系如下图：- 31 -成花调控基因 LFY 的选择性剪接及其功能研究图 9 LAS 引物位置 Figure 9 Position of LAS primersPCR 循环数的确定 首先进行预试验以确定待检测基因 PCR 扩增达到平台期前扩增效率接近最大的 循环数。 以上述合成的 LFY cDNA 第一链为模板，进行 PCR 扩增，分别在 12，16，20， 24，28，30，32，34，36，38，40，42 个循环时进行扩增，反应体系为：10 × Taq DNA polymerase buffer Mg2＋ (25 mM) dNTPs (2.5 mM) LAS PF (12.5pm/?l) LAS PR (12.5pm/?l) cDNA 第一链反应液 Taq DNA polymerase (5u/?l) ddH2O Total Vol. 于 PCR 仪中，反应程序如下：2.5?l 1.5?l 2.0?l 0.75?l 0.75?l 2.0?l 0.15?l 15.35?l 25?l94 ℃ 94 ℃ 64 ℃ 72 ℃4 min 30s 30s 45s 预设循环数- 32 -3 LFY 基因选择性剪接转录本的差异表达研究72 ℃7 min反应结束后电泳检测，并进行光密度分析以确定适合的循环数。 以上述确定适合的循环数再进行 PCR 扩增，用于后续分析。3.1.2.4 PCR 产物的凝胶电泳分析 (1) 高浓度琼脂糖凝胶的制备 由于所扩增片段较小，因此考虑用高浓度（2.5％～3.5％）琼脂糖凝胶电泳进行 分离。 (2) 电泳结果的分析 电泳完毕后，于 BioSpectrum Imaging System 凝胶成像仪中观察，并用 BioSpectrum Imaging System 自带的 VisionWorks LS 软件对电泳照片进行光密度分析。3.1.2.5 PCR 产物的纯化 方法同前。3.1.2.6 连接 方法同前。3.1.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl2 法） 方法同前。3.1.2.8 连接产物的转化 方法同前。- 33 -成花调控基因 LFY 的选择性剪接及其功能研究3.1.2.9 菌落 PCR 检测 方法同前。3.1.2.10 重组克隆的筛选鉴定与保存 方法同前。3.1.2.11 测序和分析 测序由 TIANGEN 公司 3730 测序仪完成。 测序结果采用 BioXM 2.6， Chroms 1.62， DANMAN 6.0.3.40，DNAssist 1.0 等软件进行分析。 前述 VisionWorks LS 软件对电泳照片进行光密度分析结合此处的测序分析来反 映 PCR 扩增电泳条带间可能存在的差异。并通过上述得出的数据进行 LFY 基因差异 表达及可变剪接的分析。3.2 结果3.2.1 拟南芥总 RNA 的提取及质量 如图10所示，分别提取的拟南芥开花期花器官、莲座叶及营养生长期莲座叶总 RNA经1.2％的琼脂糖凝胶电泳分离，28S、18S rRNA明显可见，条带整齐清晰，紫 外分光光度仪测定，OD260/280 分别为2.4，2.0582。RNA质量满足后续 RT-PCR试验要求。- 34 -3 LFY 基因选择性剪接转录本的差异表达研究开花期营养生长期花器官莲座叶莲座叶28S rRNA 18S rRNA图 10 拟南芥总 RNA 电泳图 Figure 10 Electrophoresis pattern of total RNA3.2.2 PCR 循环数的确定 本研究分别在 12，16，20，24，28，30，32，34，36，38，40，42 个循环时对 可能发生可变剪接的片段进行扩增，3.5％琼脂糖凝胶电泳检测（图 11） 。电泳结果经 凝胶成像系统扫描分析，以各电泳条带的光密度值作为纵坐标，循环次数为横坐标作 图（图 12） 。图中可见预期大小的目的片段 A，B 在 38 个循环前处于线性扩增期， 而 38 个循环后两片段扩增接近平台期。因此，在进行后续分析时，采用扩增效率最 大且保持线性期的循环数，即 36 个循环进行 PCR 扩增。- 35 -成花调控基因 LFY 的选择性剪接及其功能研究A B图 11 不同循环数下 PCR 产物电泳结果 Figure 11 Electrophorsis pattern of PCR products at different cycles图 12 不同循环数 PCR 产物光密度值 Figure 12 Optical density value of PCR products at different cycles3.2.3 RT-PCR 产物凝胶电泳结果分别以上述三个材料样品总 RNA 逆转录合成的 cDNA 第一链为模板，以 LAS primer F 和 LAS primer R 为上下游特异引物，64℃退火，36 个循环，进行 PCR 反应， 经 3.5％的琼脂糖凝胶电泳分离，结果如图 13，14 所示。其中，营养生长期莲座叶中 LFY 基因可能的剪接片段为 3 个； 开花期无论是花器官还是莲座叶则均只有 2 个可能 的剪接片段，且表达量有明显差异。- 36 -3 LFY 基因选择性剪接转录本的差异表达研究600bp 500bp 400bp 300bp 200bpMM500bp400bp 350bp300bp 250bp 200bp 150bp 100bp100bp50bp图 13 营养生长期莲座叶 LFY 基因 可变剪接片段 RT-PCR 产物电泳图 Figure 13 Electrophoresis pattern of RT-PCR for alternatively spliced fragments in rosette during vegetative stage图 14 开花期花器官及莲座叶 LFY 基 因可变剪接片段 RT-PCR 产物电泳图 Figure 14 Electrophoresis pattern of RT-PCR for alternatively spliced fragments in floral organ & rosette during reproduced stage3.2.4 克隆子测序结果对上述所涉及的差异片段进行了克隆测序并进行了序列比对。 结果显示存在三种 可变剪接转录本，在营养生长期包括了三种，而在开花期均包含两种。根据序列的不 同，将这