使用eclipse打包app以及AndroidStudio和Eclipse中app签名修改等问题（SH1和MD5）
一,使用eclipse打包app内容新建keystore:
1、先在eclipse中创建一个新的keystore看详细图
2、接下来设置一些打包必要参数：
3.设置好内容后点击下一步：
4、点击finish后就完成了哦！
（一）在Eclipse中开发项目添加KeyStore：
解决方式：将app的签名证书设置为eclipse 的默认签名，避免调试和发布时遇到签名问题
1.：打包出一个带有签名的apk（需保存好打包的资料）,复制打包出的key,修改后缀名为.keystore，即xxx 改为 xxx.keystore
2：修改keystore的密码为：
xxx.keystore所在文件夹下打开命令行，
输入命令：keytool -storepasswd -keystore
xxx.keystore
该步骤中三次输入的密码：
1.先输入打包xxx证书的密码
2.输入新密码：修改为android( jdk默认签名密码为android )
3.再次输入新密码
3：修改keystore的alias:
输入命令：keytool -changealias -keystore xxx.keystore
-alias 证书的alias名字
-destalias androiddebugkey
该步骤中输入的密码：
1.输入第二步骤的输入的新密码：android
2.输入打包时alias的密码：
4：修改alias的密码：
输入命令：
keytool-keypasswd -keystore xxx.keystore -alias androiddebugkey
1.先输入第二步骤的输入的新密码：android
2.然后输入打包时alias的密码：
3.最后输入alias中的新密码 android
4.再次输入：android
5.：将自定义好的keystore添加到Eclipse 中：
eclipse中的操作:
在eclipse中的window--&preferences--&android--&build里面的custom debug keystore设置为修改好的***.keystore。 即可看见证书MD5和SHA1的指纹了
1. androiddebugkey.keystore
（androiddebugkey为自定义的名字）
2. keytool -storepasswd -keystore androiddebugkey.keystore
3. keytool -changealias -keystore androiddebugkey.keystore -alias yijiaqi -destalias
androiddebugkey（yijiaqi是app打包时的alias名字）
keytool -keypasswd -keystore androiddebugkey.keystore -alias androiddebugkey
(二)：将Eclipse项目迁移到Android Studio中（原本项目已经打包keystore）
android studio中的操作：导入eclipse上迁移后的项目下，进行以下步骤：为debug,release运行添加keystore
file--&project structure--&对应项目--&singing--&创建一个cong--&在build types中的releae和 debug中singing config 分别添加刚才添加cong，点击ok
（三）在AndroidStudio中开发项目添加KeyStore：
1.打包apk,创建keystore 文件（as中是以jks结尾）
Build&&Generate Sing Apk&&选中需打包的项目&&选择keystore路径&&create new key store&&输入相关信息（密码，alias名，alias 密码，年限等）&&ok&&输入创建keystore的密码，alias等&&next&&选择正式版release-&finish
2.为项目添加debug,release的keystore:
2.1:file&&project structure&&对应项目(个人这是app项目)&&singing&&创建一个cong
(四)查看不同IDE中keystore中sha1值和md5值：
Eclipse上查看：
在eclipse中的window--&preferences--&android--&build中看自定义keystore
AndroidStudio上查看:
terminal视图中：
输入命令行：
格式：keytool -exportcert -list -v -alias
个人这边的alias：mjqmClient
路径：G:\mjqmkeystore\mjqmClient.jks
故输入：keytool -exportcert -list -v -alias mjqmClient -keystore G:\mjqmkeystore\mjqmClient.jks
结果如下：
E:\MJQMProject&keytool -exportcert -list -v -alias mjqmClient -keystore G:\mjqmkeystore\mjqmClient.jks 输入密钥库口令: 别名: mjqmClient 创建日期: 2016-8-16 条目类型: PrivateKeyEntry 证书链长度: 1 证书[1]: 所有者: CN=mjqmClient 发布者: CN=mjqmClient 序列号: 7d9060b7 有效期开始日期: Tue Aug 16 16:08:47 CST 2016, 截止日期: Fri Aug 05 16:08:47 CST 2061 证书指纹: MD5: CD:FF:97:45:9A:EF:56:72:3D:7D:E7:56:76:8A:xx:xx SHA1: 73:C3:66:11:9A:49:92:A6:D5:1D:1A:06:B2:45:B8:6C:D1:AF:xx:xx SHA256: BB:44:61:9E:13:16:AE:D9:44:DF:26:FF:2C:4C:CE:30:8F:FF:DF:55:ED:E3:58:76:AD:17:D6:BF:19:16:EC:D4 签名算法名称: SHA256withRSA 版本: 3什么是PCR?_百度知道
什么是PCR?
什么是PCR??
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我有更好的答案
　　聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。　　PCR技术简史　　PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。　　PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给 DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。　　PCR的改进与完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的 Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之 间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于 Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得 PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的 60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效 率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。　　PCR技术基本原理　　PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。　　PCR的反应动力学
PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%， 但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情 况下，平台期的到来是不可避免的。　　PCR扩增产物
可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所 结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没 有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合 时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的 “短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计， 这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。　　PCR反应体系与反应条件　　标准的PCR反应体系：　　10×扩增缓冲液
10ul　　4种dNTP混合物
各200umol/L　　引物
各10～100pmol　　模板DNA
0.1～2ug　　Taq DNA聚合酶
2.5u　　Mg2+
1.5mmol/L　　加双或三蒸水至
100ul　　PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+　　引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。　　设计引物应遵循以下原则：　　①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。　　②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。　　③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。　　④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。　　⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。　　⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。　　⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。　　引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。　　酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。　　dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。　　模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。 SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀 核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接 用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。　　Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。　　PCR反应条件的选择　　PCR反应条件为温度、时间和循环次数。　　温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。　　①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则 需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。　　②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长 度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：　　Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)　　复性温度=Tm值-(5～10℃)　　在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。　　③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子　　高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。　　PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。　　循环次数
循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。　　PCR反应特点　　特异性强 PCR反应的特异性决定因素为：　　①引物与模板DNA特异正确的结合；　　②碱基配对原则；　　③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；　　④靶基因的特异性与保守性。　　其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。　　灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。　　简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。　　对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。 PCR扩增产物分析　　PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。　　凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。　　琼脂糖凝胶电泳： 通常应用1～2%的琼脂糖凝胶，供检测用。　　聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。　　酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。　　分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。　　Southern印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。　　斑点杂交： 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。　　核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可
采纳率：12%
PCR诊断技术又叫多聚酶链式反应技术，它采用分子技术模拟核酸在体内的复制，从而判定疾病病原的种类，所以从本质上来说，这是一种实验室诊断方法。目前省内一些科研和检测机构，如山东省农科院、山东农业大学以及山东省兽医总站都已经熟练掌握了这项技术。 以往给动物治病，兽医都是采用看闻问摸的方法，这就要等到动物表现出明显的症状，才能初步判定疾病的类型，有时病症复杂了，还得经过很长一段时间的治疗性诊断，不仅错过了治疗的最佳时间，还会造成饲料和药品的浪费。甚至还会出现误诊。而PCR技术就不同了，它不需要观察动物的外观表现，所以无论是在潜伏期还是爆发期，只要对动物的相应器官进行检测，在两个小时内就能准确判定出畜禽疾病的原因和种类，这就意味着能够快速治愈爆发的疾病。另外，这项技术也能作为确定某些疾病流行的权威依据。特别是目前其他各种技术都很难确诊的病毒病，通过它就可以非常直观的得出结论。
PCR就是一种用来大量复制目的基因的生物技术
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我们会通过消息、邮箱等方式尽快将举报结果通知您。定义聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：Polymerase&Chain&Reaction），具体内容点击：&聚合酶链式反应，简称PCR聚合酶链式反应。聚合酶链式反应，其英文Polymease&Chain&Reaction(PCR)是体外特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase&Chain&Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向技术。&由美国科学家PE（Perkin&Elmer珀金-埃尔默）公司遗传部的Dr.&Mullis发明，由于PCRPCR技术在理论和应用上的跨时代意义，因此Mullis获得了1993年诺贝尔化学奖。
技术原理/PCR
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互聚合酶链式反应补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在聚合酶链式反应实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。&　　但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。
工作原理/PCR
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时&&聚合酶链式反应间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 体系与条件标准的PCR反应体系：PCR扩增程序10×扩增缓冲液10ul&　　4种dNTP混合物各200umol/L&　　引物各10～100pmol&　　模板DNA0.1～2ug&　　2.5u&　　Mg2+1.5mmol/L&　　加双或至100ul&　　PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+ ) 工作步骤标准的PCR过程分为三步：&　　1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA&　　2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。&　　3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′&端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。 反应特点特异性强&　　PCR反应的特异性决定因素为：&　　①与模板DNA特异正确的结合；&　　②配对原则；&　　③Taq&DNA聚合酶合成反应的忠实性；&　　④的特异性与保守性。&　　其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq&DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。&　　灵敏度高&　　PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU()；在细菌学中最小检出率为3个细菌。&　　简便、快速&　　PCR反应用耐高温的Taq&DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-，一般在2～4&小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。&　　对标本的纯度要求低&　　不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA&粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。 循环参数1、预变性（Initial&denaturation）．&　　模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5分钟。&　　2、引物退火（Primer&annealing）&　　退火温度一般需要凭实验（经验）决定。&　　退火温度对PCR的特异性有较大影响。&　　3、引物延伸&　　引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。&　　延伸时间随扩增片段长短而定。&　　4、循环中的变性步骤&　　循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性：&　　变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。&　　5、循环数&　　大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。&　　6、最后延伸&　　在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。&　电泳检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。&　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，&④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。&　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消&化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模&板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处&理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应&固定不宜随意更改。&　　酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而&导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。&　　引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不&理想、容易弥散的常见原因。有些批号的质量有问题，两条引物一条浓度&高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单&位。②引物的浓度不仅要看，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。&　　Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特&异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。&　　反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多&大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul&后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 物理原因变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。&　　靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。　靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用方法来减轻或消除。&　出现非特异性扩增带&　　PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带&与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、&或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数&过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶&则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引&物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次&数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。&　　出现片状拖带或涂抹带&　　PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量&差，浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓&度。增加模板量，减少循环次数。 反应五要素参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+&　　引物：&引物是PCR特异性反应的关键，PCR&产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，&就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。&　　设计引物应遵循以下原则：&　　①引物长度：&15-30bp，常用为20bp左右。&　　②引物扩增跨度：&以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。&　　③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。&　　④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。&　　⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。&　　⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，&被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，&这对酶切分析或分子克隆很有好处。&　　⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：&每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度目前有两种Taq&DNA聚合酶供应，&一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。&　　dNTP的质量与浓度　dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M&NaOH或1M&Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，&-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(&等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。&　　模板(靶基因)核酸　模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：&溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS&还能与蛋白质结合而沉淀；&蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。&　　Mg2+浓度　Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq&DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 反应条件选择PCR反应条件为温度、时间和循环次数。&　　温度与时间的设置：&基于三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40&～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq&DNA&聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，&除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq&DNA酶仍有较高的催化活性)。&　　①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。&　　②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA&比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：&　　Tm值()=4(G+C)＋2(A+T)&　　复性温度=Tm值-(5～10℃)&　　在Tm值允许范围内，&选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，&提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。&　　③延伸温度与时间：Taq&DNA聚合酶的生物学活性：&　　70～80℃&150核苷酸/S/酶分子&　　70℃&60核苷酸/S/酶分子&　　55℃&24核苷酸/S/酶分子&　　高于90℃时，&DNA合成几乎不能进行。&　　PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够&的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 常见类型1、巢式PCR：采用两对引物进行PCR，其中第二对引物位于第一对引物内。实时定量PCR2、：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。&3、：是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。4、等位基因专一PCR&：该法可用于检测点突变。如用于检测镰刀形贫血症。5、&：有一个碱基变化的两种引物在较宽松的复性条件下竞争DNA模板，&其中只有完全互补的引物才能大量配对。该法可用于测定某一DNA&片段上是否带有某一已知碱基置换。6、多重PCR：用于检测特定基因序列的存在或缺失。&7、原位PCR：直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增。可进行细胞内定位和检测病理切片中含量较少的靶序列。8、差示PCR：利用特殊设计的引物，在RT&的基础上进行PCR，以研究不同基因的表达状况。9、实时定量PCR：实时定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA&(or&cDNA)&的起始浓度进行定量的方法，实时荧光定量&PCR是目前确定样品中DNA&(或&cDNA)&拷贝数最敏感、最准确的方法。&
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