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请教如何计算出兼并引物的退火温度我是一个新手,如何根据公司送来的兼并引物的单子上的Tm值推出实际PCR时的退火温度呢?引物单子上有两个Tm值,分别是1M 钠离子,50mM钠离子条件下的Tm值.实际PCR时的退火温度怎么算呢?
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实际pcr的退火温度一般都是从55℃开始的,有杂带退火温度就提高一点,目的带比较微弱退火温度就降低一点,不用管那个引物单子上的温度,那样太麻烦,有的实验室一天做几百个样品的pcr,如果个个要看引物单子上的温度然后在设计条件,你想想看,那得用多少台pcr仪器啊,所以一般都取默认条件,55℃30s
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PCR引物设计及评价
PCR引物设计及评价
来源：互联网
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【实验目的】 1、掌握引物设计的基本要求，并熟悉使用Primer premier5.0软件进行引物搜索。 2、掌握使用软件oligo6.0对设计的引物进行评价分析。 【实验原理】 一、引物设计原则 聚合梅链式反应（polymerase chain reaction）即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的方法，故又称基因的体外扩增法。PCR技术已成为分子生物学研究中使用最多，最广泛的手段之一，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环，使用不合适的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行，可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。引物设计原则如下： 1、引物应在序列的保守区域设计并具有特异性。引物序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。这样可以减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性； 2、引物的长度一般为15-30 bp。常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应； 3、引物不应形成二级结构。引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行； 4、引物序列的GC含量一般为40-60%。过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大； 5、引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)； 6、引物5'端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。可根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。 7、引物3'端不可修饰。引物3'端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3'端使用碱基A。 8、引物序列自身或者引物之间不能在出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加； 9、G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3'端 G值较低（绝对值不超过9），而5'端和中间 G值相对较高的引物。引物的3'端的 G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应； 值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低，在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。 二、引物设计软件Primer premier5.0及oligo6.0 &Premier&的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计、限制性内切酶位点分析和DNA 基元(motif)查找。&Premier&还具有同源性分析功能，但并非其特长，在此略过。此外，该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设计简并引物，另外还有序列&朗读&、DNA 与蛋白序列的互换、语音提示键盘输入等等。有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物，由于大多数氨基酸（20 种常见结构氨基酸中的18 种）的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。&Premier&可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（Plant Mitochondrion）、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mito-chondrion）和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）。 对引物进行分析评价的的软件中，&oligo& 是最著名的。它的使用并不十分复杂，Oligo 6.0的界面是三个图，Tm图、ΔG图和Frq图。&Oligo&的功能比&Premier&还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。所以引物设计的最佳搭配是&Premier&进行引物搜索&Oligo& 对引物分析评价。 【实验内容】 1、使用Primer premier5.0软件进行人瘦素 (leptin) mRNA引物的设计。 2、使用oligo6.0对引物进行评价分析。 【实验方法】 一、引物搜索 1、打开Primer premier5.0软件，调入人瘦素 (leptin) 基因序列：点击&file&
&DNA sequence&；或者直接点击&file&
&DNA sequence&，弹出一对话框如下图，然后将序列人瘦素 (leptin) 基因复制在空白框。
2、序列文件显示如图，点击&Primer&；
3、进一步点击&search& 按钮，出现&search criteria&窗口，有多种参数可以调整。搜索目的（Seach For）有三种选项，PCR引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers），杂交探针（Hybridization Probes）。搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（Search Ranges），引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode），参数选择（Search Parameters）等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。我们将Product Size设置300－350，其他参数使用默 认值。
然后点击&OK& ，随之出现的Search Progress窗口中显示Search
Completed时，再点击&OK&。
4、这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分为100，即各指标基本都能达标（如下图）。
5、按照搜寻结果显示，在主窗口中检查该引物对的二级结构情况，逐条分析，依次筛选。下面进行序列筛选：点击其中一对引物，如第21#引物，在&Peimer Premier&主窗口，如图所示：该图分三部分，最上面是图示PCR模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由&None& 变成&Found& ，点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有&Found&，只有&None& 。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。
二、引物分析 1、打开oligo的页面如下：
2、单击file菜单再点open或点击&打开&快捷图标或者用快捷键&CTrl＋O&可弹出一对话框，然后选择序列人瘦素 (leptin) 基因。出现以下窗口。
3、点击&window&再点击&Tile&，出现以下窗口，图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG和Frq，因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade排列方式不太方便，可从windows菜单改为tile方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标。 ?G值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的?G值在5'端和中间值比较高，而在3'端相对低（如图：） Tm值曲线以选取72℃附近为佳，5'到3'的下降形状也有利于引物引发聚合反应。 Frq曲线为&Oligo 6&新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用3'端Frq值相对较低的片段。
4、在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm图块上左下角的Upper按钮 ，选好上游引物，此时该按钮变成红色，表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。
5、当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价。可以用&Analyse&菜单分析你的引物：比如有无引物二聚体、发卡结构等等。首先检查引物二聚体尤其是3'端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5为好。当然，在设计克隆目的的PCR引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。这种PCR需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC含量，以45-55％为宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火温度的选择。
当我们结束以上三项检测，按Alt+P键弹出PCR窗口，其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。 【作业】 1、提交使用Primer premier5.0及oligo6.0软件进行人瘦素 (leptin) mRNA引物的设计结果； 2、总结引物设计应注意的关键事项。
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1、引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不能大于38bp；
2、引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；
3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之间，Tm值曲线以选取72度附近为佳，5'到
3’的下降形状也有利于引物与模板的结合；
4、ΔG值（自由能）反应了引物与模板结合的强弱程度，3'端的ΔG值相对要低，且绝对值不要超过9，否则不利于正确引发反应，3'末端双链的ΔG值在0--2kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，但在-6时只达到40%，-8时少于20%，-10时接近于0；
5、错配率一般不要超过100，否则会出现非目的条带。但对于某些特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为340以上，而在错误位点的引发效率为110，并且不好找到其他更合适的引物，那么这对引物是可以接受的；
6、Frq曲线为Oligo6软件新引进的一个指标，解释了序列片段存在的重复几率大小，选取引物时，应该用Frq值相对较低的片段；
7、引物二聚体及发卡结构的能量的绝对值一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体而且会降低引物浓度从而导致PCR不能正常发生；
8、3'端最好不要是连续碱基，GGG或CCC会导致错误的引发，同时3'端最后一个碱基最好不要是A或T，若是，会导致错配；
9、以公式Tm=4*（G+C）+2*（A+T）-5计算Tm值，也就是退火温度。选择较低Tm值的引物的退火温度为反应的退火温度，最好保证每个引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范围内；
10、模板与稳定性较小的引物之间的Tm的差异越小，PCR的效率越高。因为解链温度也取决于它的长度，如果期待的产物长度等于或小于500bp，选用端的引物（16-18bp），如果产物长5kb，则用24bp的引物；
11、在DNA测序和PCR中最好用5'末端稳定（GC含量多），而3'端不稳定（AT含量多）的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应；
12、引物和产物之间的Tm值相差别太大，20摄氏度范围内最好。
13、对引物的修饰一般在5'端进行，例如加酶切位点，加酶切位点的同时要根据需要添加保护碱基。
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重新安装浏览器，或使用别的浏览器我做引物特异性扩增，引物上的TM值是61.9度，我把退火温度从55度降到51度，隔一度试一次，二聚体还是有呢_百度知道
我做引物特异性扩增，引物上的TM值是61.9度，我把退火温度从55度降到51度，隔一度试一次，二聚体还是有呢
因为55度买有扩出条带，所以我就温度往下走，没有往上调，38个循环参数，请问有哪位大侠能解决呢？谢谢
这个要看你的实验目的了，你可以根据引物设计时给出的退火温度前后各十度做个温度PCR，然后选择能扩出带的温度。如果二聚体对实验影响较大的话则建议你换引物吧。
请问，您的意思是？在引物设计给出的退火温度基础上，加10度和降10度做PCR吗？我怕的就是55度都没有出条带，那么温度更高了，会不会更没有条带呢？
对，软件给出的退火温度只能作为一个参考，实际的退火温度我们都是通过温度梯度PCR测出来的，鉴于你的样品在55度未扩增可以退几个温度试试。祝你顺利！
采纳率：54%
你的退火温度已经挺低的哦，循环数也不小，如何还扩不出来可能就是表达量太少，不好扩，建议用realtime PCR试试
可是，做real time PCR 不是也得摸索最佳条件吗？我就是想先摸索好了条件，之后再上荧光定量的
你应该试着把退火温度往上调，55，58，61这样，还有你的目的条带是多少啊？
我的目标条带是176BP，因为55度没有出条带，但是降低温度之后。54度。53度都有条带了，但是因为有引物二聚体，所以不知道是降低温度好呢，还是升高退火温度好呢，还有其他参数要不要改变？谢谢
那些条带会不会全是引物二聚体啊？？温度都已经很低了，建议还是试着调高温度做一次吧。176bp，25个循环都已经足够了，除非表达量太低了，或许是引物设计得不太好
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