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第3讲_机构的创新设计1
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3秒自动关闭窗口借助实例介绍生物等效性试验的统计设计与分析 - 疾病分析统计数据库
Statistics
借助实例介绍生物等效性试验的统计设计与分析
借助实例介绍生物等效性试验的统计设计与分析
中国预防医学科学院卫生统计研究室　张学中　马林茂
摘要　本文通过实例介绍生物等效性试验的统计设计和分析的基本概念,尤其着重介绍2×2交叉设计与作t检验的设计之间的区别。对这类试验所得数据结果介绍了各种分析方法:方差分析,双单侧t检验,非参数方法,给出响应数据不经过对数变换和经过对数变换所得不同结果。给出了用SAS软件计算做交叉设计所需样本大小的程序。实际例子用BASIC和SAS程序加以分析,所得结果是一致的,还对输出结果加以深入说明。本文对生物等效性研究数据的正态性检验用到峰态和偏态统计量,未见国内外有类似报道。
关键词　生物等效性;交叉设计;双单侧t检验
1. 生物等效性的概念
　　本文中的术语“生物等效性”(bioequivalence )用于评价同一药物的不同配方或不同的药物产品其效用是否相当,仿制药与专利药是否相当。均以试验品与参考品作比较,二者应有相似的剂量形式,并且它们在生物体内吸收的速率和延缓(吸收率和吸收度)没有显著的差别。目前关于生物等效性的实验设计与分析是基于以下假设的[1]:两药物的吸收率和吸收度相同即认为生物等效,它们的治疗效果也应是相同的。吸收率和吸收度是通过测量药代动力学响应,如AUC和Cmax而得到的。因此生物等效性应该是对于这些观测值所在总体分布而言的,当它是正态分布或对数正态分布时,只要比较均数和变异就可以了。也就是说,要看生物利用度是否是等效的,需要把这些利用度数值作为总体参数在两种配方中的样本作统计推断。Chinchilli给出3个关于生物等效性定义[2]:
　　总体生物等效性:对于两药物有关的概率分布函数而言是生物等效性;
　　平均生物等效性:对于两药物有关的概率分布函数的均数或中位数而言是生物等效性;
　　个体生物等效性:对于总体中大部分个体而言是生物等效性。
　　在药品的生物等效性的试验研究中, FDA在1992年颁布了一个指南[3],涉及到2×2交叉设计的一些问题时,是把它作为标准方法加以叙述和讨论的。不难看出这是此类试验的基础,所以我们主要限于此题目作详细而实用的讨论,更复杂的方法见文献[4~7]。
2. 2×2交叉设计概念
　　早在五十年代,交叉设计在农业试验研究中就有应用,然而直到近二十年才因为在临床试验中的应用而受到重视,认为交叉设计是用得广而误用最多的设计,它有时还称为“Grizzle&设计或“Hills-Armitage&设计[6]。
　　临床试验是新药试验或医学处置试验的重要组成部分。对于药物的评价通常是借助于比较它们对于人体的效应。从伦理的观点出发,病人所冒的风险必须降至最低,而且受试人体数目应该在符合统计学要求的前提下是尽量少。交叉设计因为对每位病人都连续接受两次或更多的处理,所以是合乎上述要求的。为完成这类试验,把受试对象随机分为几组,按一定顺序加以处理。在2×2交叉设计中,所有受试对象被随机分为两组,每个受试对象接受两种处理,简单标作A和B。首先让一组的受试对象接受A,然后交叉为B,而另一组的受试对象先接受B,然后交叉为A。在两次处理之间选取适当的时间间隔,不加任何处理,这一时间间隔称为“清除周期”,是为了避免一个周期内的处理影响到随后一周期的处理中。
　　交叉设计的目的是为了用受试对象内的差别(或对比)来估计多数主效应。因为通常情况是受试对象间的变异大于受试对象内的变异,这就导致用更为高效的检验方法,而不是用组间信息对独立两组作简单比较。在这里每个受试对象都是相当于自身对照。
　　如果清除周期选取得不是足够长,一个处理可能延续到下一个处理周期中去。这一携带效应会使对于直接的处理效应的估计更加困难甚至是不可能的。
为了避免心理效应,对受试个体的处理都采用双盲的方式,无论病人还是医生都不知道实际上所用的处理。
　　为了弄清2×2交叉设计和分析的方法和原理,我们首先需要对t检验的设计有很好的理解,如图1和图2。按照配对t检验所设计的试验,当为自身配对时,两种处理在时间上就有先后,前后这两种处理的效应差异除处理本身的不同所引起的而外,还有以下几种可能。
　　①携带效应(carryover effects):前一处理留给、影响或改变后一处理。
　　②学习或疲劳效应(learning or fatigue effects):它们分别为正向和负向作用到后一处理。
　　③顺序效应(sequence effects):受试对象所接受的两种217 Periods
Subjects Random Sequences
groups Period 1 washout Period 2
1 1 Seq.1 TREAT1 TREAT2
2 4 Seq.1 TREAT1 TREAT2
3 6 Seq.1 TREAT1 TREAT2
4 9 Seq.1 TREAT1 TREAT2
5 10 Seq.1 TREAT1 TREAT2
6 12 Seq.1 TREAT1 TREAT2
7 2 Seq.2 TREAT2 TREAT1
8 3 Seq.2 TREAT2 TREAT1
9 5 Seq.2 TREAT2 TREAT1
10 7 Seq.2 TREAT2 TREAT1
11 8 Seq.2 TREAT2 TREAT1
12 11 Seq.2 TREAT2 TREAT1
two TREATs,two sequences,two periods
Fig 3. 2×2 Cross_over design
Period 1 washout Period 2
1 TREAT1 TREAT2
2 TREAT1 TREAT2
3 TREAT1 TREAT2
4 TREAT1 TREAT2
5 TREAT1 TREAT2
6 TREAT1 TREAT2
7 TREAT1 TREAT2
8 TREAT1 TREAT2
9 TREAT1 TREAT2
10 TREAT1 TREAT2
11 TREAT1 TREAT2
12 TREAT1 TREAT2
every subject for two TREATs
Fig 2. A Design For paired t_test
　　处理(A和B)中的任一个都有孰先孰后的问题,共两种顺序(先A后B或先B后A),它对响应的不同作用,称为顺序效应。
为了在试验中能检验这些效应是否显著,可以把原来作配对t检验的所有配对随机地分为两组:第一组中每对的两种处理按同一种顺序(例如先A后B);另一组则用相反顺序(先B后A).这就是所谓的2×2交叉设计:受试对象(即各个对,可以是自身配对)分二组,共有两种处理(或是药物、剂型等),两组在第一期各接受一种处理,在第二期分别再接受另一处理,形成交叉。它与一般的t检验设计的区别和联系,很容易从以下几个图表(图1~图3)中看出来。
3. 2×2交叉设计及试验结果的列表
　　表1a的数据是SQUIBB公司的一项2×2交叉设计及
试验结果的实例,取自报告“gemfibrozil 600 mg tables watcn b-08052”这里所引用的数据未经对数变换,表从左起前五栏是在试验之前,设计阶段按图3根据所需样本给出的;后两栏Cmax和AUC是在完成各试验运行后观测到的响应。试验共有48次观测(OBS),每个观测都列出其受试对象(subject),所属顺序组(SEQ),接受的处理(treatment,TMT),处理的时期(period),所得到的药时曲线下面积AUC和峰浓度Cmax。
　　从表1a可看到受试对象共24个单元,分为二组,在“SEQ”一栏分别标以1或2。如果一个对象在第一时期接受treat2,则第二时期为treat1,这一组对象的SEQ=1;当一个对象在第一时期接受treat1,则第二时期为treat2,这一组对象的SEQ=2。这样一来,如果一受试对象在一次试验观测中SEQ和period取值相反,则该对象在另一次观测中的这两个取值就一致.两种treat对两组对象在两时期中交换,对象的两种分组就是两种顺序,于是顺序和对象是两级受试对象,二者是嵌套的关系。表1b是表1a的另一种格式,这里所以不厌其详地都列出来,是因为将设计矩阵和试验结果列成统计表的过程,也是比较、归纳、理解和分析实验数据的过程。循此思路,还可以列出同一内容其它格式的表,例如把时期1和2分作两栏,将顺序相同的对象连在一起等等都成为不同形式的表,这种研究方法比公式推导更直观和更易于理解,想深入掌握这类设计方法的读者应再详细列出几种。
4. 2×2交叉设计的几点考虑
　　为进行生物等效性试验,所作2×2交叉试验设计需有以下理解和考虑。
4.1 样本大小的确定
　　在国际上较普遍采用LIU和CHOW[9]给出的公式(1)
来计算2×2交叉试验的样本大小,即表1a和表1b中的受试对象数(subject):
n=[t(α,2n-2 )+ t(β,2n-2 )]2[CⅤ-θ)]2(1)
　　式中符号与其SAS程序(见图4)有所不同,列于表2,以便于互相对比。
按照设定的一种顺序的样本数n得出自由度2n-2,进而得到t分布的分位数t(α,2n-2)和t(β,2n-2),所得n与设定的不会完全一致,用算得的当作新设定值,重新计算直至二者
Subjects Random Groups Treatment
3 6 Treatment 1
9 5 Treatment 2
Two parallel groups
Fig 1.A Design For Grouped t_test219
很接近,向上园整为最接近的整数,再乘以二,即为所求样本大小。
　　把受试对象随机分为二组,每组数目最好相同.以表1为例,共24例,每组12个,在SEQ(顺序)栏分别标成1或2。在1~24观测中各有12个。在24~48观测中的SEQ完全与前24观测相同。
　　每个受试对象(subject)都先后接受两种处理(TMT):SEQ=1,在试验的第一周期先接受treat2(TMT=2),而在试验的第二周期再接受treat1(TMT=1); SEQ=2,在试验的第一周期先接受treat1(TMT=1),而在试验的第二周期再接受treat2(TMT=2)。
4.4 携带效应
　　每个受试对象在第一周期先接受某种处理时它没有前一周期受(TREAT)的经历,所以这时所测得实验响应中含有的携带效应(carry_over effect)恒为0,是以“00”分组的;而在试验的第二周期则是在接受过treat的基础上进行的,所以存在携带效应,对SEQ=1是以&01&分组,对SEQ=2是以&02&分组。这样一来,按携带效应可把观测分为三组:00,01和02。
4.5几种嵌套关系
　　SEQ与subject之间是嵌套(nested)关系,可以在SAS程序中记为subject(SEQ), SEQ的平方和与自由度都是由subject中分解出来的。同样地,TMT与period之间也是嵌套关系,记为TMT(period), treat被周期嵌套; SEQ与TMT之间也是嵌套关系,记为SEQ(TMT),顺序被treat嵌套:两种次序因不同treat而异。
5. 对表1数据的分析
5.1 模型和假设及SAS程序和结果
　　为了分析表1数据,如同解决这类统计问题通常所作的那样,需要对各实验因素(自变量)和实验响应(因变量)之间关系模型作出假设,根据不同的实际问题,所假设的模型可以有不同形式,如果不考虑交互作用,较一般的形式为
Yijk=μ+γi+sik+πj+τt+λr+ eijk(2)
　　这里i=1,2是将任何观测按受试对象所受两种treat顺序的分组;
　　j=1,2是将任何观测按试验周期的分组;
　　k=1,2,...,ni,每一次序i中的受试对象例数;
　　t=1,2是将任何观测按所接受药物(treat)的分组;
　　r=0, 1, 2是对任何观测在第j周期时由j-1时期所携带的固定效应进行分组,0是第一周期的观测,1表示在第二周期观测之前该对象第一期i=1, 2表示在第二周期观测之前该对象第一期i=2;
　　Yijk:对于第k个对象,第i个顺序,第j个时期所观测到的实验响应,AUC或Cmax等;
　　μ:所有各次观测效应的总平均;
　　sik:第k个对象在第i个顺序中的随机效应;
　　γi:顺序i的固定效应,∑γi=0;
　　πj: j时期的固定效应,∑πj=0;
　　对任何观测在第j周期时由j-1时期所携带的固定效应进行分组;
　　τt:药物(treat)t的固定效应,∑τt=0;
　　λr:三种携带作用的任一种引起的固定效应,∑λr=0;
　　eijk:在观测值Yijk中的随机误差,它是在顺序分组之内的.
　　公式(2)作为评价生物等效性所假设的模型,它意味着有以下三条假设:
　　(A)sik是独立正态分布,均数为0,方差为σs2;
　　(B)eijk是独立正态分布,均数为0,方差为σe2;
　　(C)sik和eijk是互相独立的;
　　前述下标t和r未出现在Yijk中,因二者是由i,j和k所决定的,于是可以理解为何要把(2)简化或归纳成4种模型假设: (2a), (2b),(2c)和(2d) .从所列出的实际数据看,五个回归变量不是完全独立的,也要求只能借助不同模型选择其中一部分变量:
　　Yijk=μ+πj+τt+λr + eijk(2a)
　　Yijk=μ+πj+τt+ (τπ) + eijk(2b)
　　Yijk=μ+γi+(sγ)+πj +τt+ eijk(2c)
　　Yijk=μ+γi+(sγ)+τt+(γτ) + eijk(2d)
与之相应的SAS程序为
data Exam82;
input n subj seq period treat $ carry $ y @@;
1 1 1 2 1 1 70.9
2 2 1 2 1 1 92.7
3 3 2 1 1 0 66.6
(这里应有48个观测,所略去的数据共有43个观测,见 Table 1a)
47 23 1 1 2 0 61.9
48 24 2 2 2 2 76.0
class seq subj
model y= period treat carry /solution ss1 ss2;
title &parametrization 2a&;
＊该模型未考虑回归变量之间的任何裂区性质,故也称作经典模型;
class seq subj
model y= period treat treat(period) /solution ss1 ss2;
title“parametrization 2b”;
＊该模型考虑回归变量之间所存在的关系, treat和周期之间除了各自独立地引起效应之外,还考虑到嵌套关系引起的效应,这里亦相当二者的交互作用;
class seq subj
model y=seq subj(seq) period treat /solution ss1 ss2;
random subj(seq);
title“parametrization 2c”;
＊该模型考虑试验顺序(seq)亦可理解为对受试对象的分组方式,有几种顺序就相应有那麽多种分组方式,显然受试对象是嵌套在顺序之内的;
class seq subj
model y=seq subj(seq) treat seq(treat) /solution ss1 ss2;
random subj(seq);
title &parametrization 2d&;
＊该模型不仅考虑试验顺序(seq)与受试对象的嵌套关系还考虑了处理和顺序的交互作用,也可理解为嵌套关系。
程序运行后,部分输出如下:
OBS n SUBJ SEQ PERIOD TREAT CARRY Y
1 1 1 1 2 1 1 70.9
2 2 2 1 2 1 1 92.7
3 3 3 2 1 1 0 66.6
4 4 4 1 2 1 1 99.0
45 45 21 1 1 2 0 65.4
46 46 22 2 2 2 2 61.5
47 47 23 1 1 2 0 61.9
48 48 24 2 2 2 2 76.0
Variable N Mean Std Dev Minimum Maximum
N 48 24....0000000
Subj 48 12....0000000
SEQ 48 1....0000000
Priod 48 1....0000000
Y 48 72....0000000
parametrization 2a 4
General Linear Models Procedure
Dependent variable: Y
Source DF SumofSquares MeanSquare FValue Pr&F
Model 3 250...23 0.8740
Error 44 33 360.
CorrectedTotal 47 00
R-SquareRSDRootMSE YMean
Source DF TypeISS MeanSquare FValue Pr&F
Period 1 82...23 0.6343
Treat 1 0...00 0.9795
Carry 1 167...46 0.4993
Source DF TypeIISS MeanSquare FValue Pr&F
Period 0 0. . . .
Treat 1 90...25 0.6195
Carry 1 167...46 0.4993
说明: Period ,Treat,Carry三者不独立,Period的变异包含在其余二者之内,所以Type I SS中是有Period效应的,而在Type II SS中考虑完Treat和Carry之后,就没有Period的份了。
parametrization 2b 6
General Linear Models Procedure
Dependent variable: Y
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr & F
Model 3 250...23 0.8740
Error 44 33 360.
Corrected Total 47 00
R-SquareRSDRoot MSE Y Mean
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr & F
Period 1 82...23 0.6343
Treat 1 0...00 0.9795
Treat(Period) 1 167...46 0.4993
Source DF Type II SS Mean Square F Value Pr & F
Period 1 82...23 0.6343
Treat 1 0...00 0.9795
Treat(Period) 1 167...46 0.4993
　　说明:如果假定没有CARRY效应, PERIOD ,TREAT ,TREAT(PERIOD)三者是独立的, TYPE I SS与TYPE II SS是一致的。
2a与2b两个模型都是不显著的:要么是误差太大,要么是还有因素的效应没有分解出来.这二模型虽然不能用于预计,估计和检验,但对分析变量之间关系还是有用的。
parametrization 2c 8
General Linear Models Procedure
Dependent Variable: Y
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr & F
Model 25 33 570..86 0.0001
Error 22 7 83.
Corrected Total 47 00
R-SquareRSDRoot MSE Y Mean
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr & F
SEQ 1 167...01 0.1703
Subj(SEQ) 22 67 637..66 0.0001
Period 1 82...99 0.3298
Treat 1 0...00 0.9576
Source DF Type II SS Mean Square F Value Pr & F
SEQ 1 167...01 0.1703
Subj(SEQ) 22 67 637..66 0.0001
Period 1 82...99 0.3298
Treat 1 0...00 0.9576
说明: Error的DF为22,它的Sum of Squares为,这是总的剩余,在此为受试对象内变异,而从总变异中分
解出的各效应中SUBJ(SEQ)是对象间变异。因为对象是按SEQ分组的,所以SEQ应以SUBJ(SEQ)作为误差来衡量其显著
parametrization 2d 11
General Linear Models Procedure
Dependent Variable: Y
Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr & F
Model 25 33 570..86 0.0001
Error 22 7 83.
Corrected Total 47 00
R-SquareRSDRoot MSE Y Mean
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr & F
SEQ 1 167...01 0.1703
Subj(SEQ) 22 67 637..66 0.0001
Treat 1 0...00 0.9576
SEQ(Treat) 1 82...99 0.3298
Source DF Type II SS Mean Square F Value Pr & F
SEQ 1 167...01 0.1703222
Subj(SEQ) 22 67 637..66 0.0001
Treat 1 0...00 0.9576
SEQ(Treat) 1 82...99 0.3298
说明: 2c与2d两个模型在数值上是一样的,只是SEQ(TREAT)取代了PERIOD,这两种效应是混杂的。
5.2 方差分析
　　上述SAS输出是方差分析的结果,现把其中各Corrected Total (总离均差平方和)如何分解成所来源(Source)的效应,用数学公式加以说明。
首先把总离均差平方和SST=∑∑∑(Yijk-Y)2进行分解:k j i
SST=∑∑∑(Yijk+Yi.k-Yi.k-Y…)2=∑∑∑[(Yijk-Yi.k)2+(Yi.k-Y…)2]k j i k j i
由于2∑∑∑(Yijk-Yi.k)(Yi.k-Y)=0,Yi.k=∑Yijk=∑Yi.k= niYi.kk j i j j
∑∑{(Yi.k-Y)∑(Yijk-Yi.k)}= 0k j j
所以SST=SSB+SSW,SSW=∑∑∑(Yijk-Yi.k)2,k j i
SSB=∑∑∑(Yijk-Y…)2k j i
即总离均差平方和可分解为受试对象间平方和以及受试对象内平方和,它们都还可以进一步分解,样本间平方和又可分解
为:SSB=SScarry+SSInter
而样本内平方和又可分解:SSW=SSDrug+SSPeriod+SSIntra
公式中SScarry次序(携带)效应的平方和;SSInter受试对象间剩余平方和;SSDrug药物效应的平方和;SSPeriod周期效应的平
方和;SSIntra受试对象内剩余平方和。
C=∑∑∑..Yijk2
2(n1+n2)i j k
这里C是对2×2交叉设计,两受试对象次序分组各含n1和n2个个体情形下观测值平方的均数估计值;
SSperiod=∑Y.j.2/(n1+n2) -C,SSdrug=∑Y.j.2/(n1+n2) -C
此二公式还可写为:
SSperiod= (Y11-Y12+Y21-Y22)2
SSdrug= (Y11-Y12-Y21+Y22)2,SScarry= (Y1..-Y2)2,
2(n1+n2)n1+n2
样本间和样本内平方和分别为:
2niY2i.k 2Yi..2 2 ni 2 2Y2i.j
SSinter=∑∑-∑, SSintra=∑∑∑Y2ijk-∑∑-SSinteri=1k=12i=12 nii=1i=1j=1 i=1 j=1ni
SSinter=SSbetween-SScarry
　　为了准确理解这些公式的意义和相互关系,把表1b中B-08052试验数据(未经对数变换)记成数据文件,可用BASIC程序算出样本间平方和(sss),样本内平方和(sst-sss),次序(携带)效应的平方和(ssq1);受试对象间剩余平方和(sssq);药物效应的平方和(ssg);周期效应的平方和(ssd);受试对象内剩余平方和(sse)。为节省偏幅,这里略去程序本身,而将运行结果列于表3。
SEQ(交叉的顺序)效应如果是显著的,在统计学上可能有四种情况的混杂:
①真实的顺序效应;
②携带效应(carry-over);
③药物与周期的交互作用;
④随机化不好。
　　在本分析表中,符号＊＊为传统的ANOVA中以最后剩余均方(83.24148),即对象内均方作为求F的分母;而符号＊则按对象间剩余均方(637.4417)作求F的分母。
6. 用双单侧t检验法判定生物等效性
6.1 问题的提出
　　药物生物等效性的统计推断是以试验品与参考品作比较,从它们的样本均数XT和XR推断总体均数μT和μR是否等效。
为比较上述差别,检验两个总体均数的传统方法是t检验。按照该方法,如果算得的t值小于显著临界值时,认为二总体在统计上无差别,则可能犯很大的假阴性错误,即可能223
Table 3. ANOVA for DATA B-08025
Source DF SS MS F P(Fp&F)
Between subjects:
SEQ 1 167.2 0..614＊
SEQ 1 167.2 2.01 0.1703＊＊
SUBJECT(SEQ) 22 . 0.0001
Within subjects:
TMT 1 0...00 0.9576
PERIOD 1 82.09 0.99 0.3298
Error 22 .24148
Total(corrected) 47 16105.22
程序窗口显示意义
Number of observations=48数据文件共48行(观测数)
Number of subjects=24受试对象数
group means= 72.99584 (ref.) 72.85416 (test)参考和试验品均数
period means= 74.5二周期均数
subject means=每个受试对象内均数
( 1 ) 77.65 ( 2 ) 96.85 ( 3 ) 65.1
( 4 ) 85.85 ( 5 ) 112.15 ( 6 ) 83.3
　　冒很大的消费者风险,而医药管理部门则要求从减少消费者风险出发,例如要求β=0.05或β=0.10。所以传统t检验不能简单用于生物等效性的统计推断上。于是出现了对称置信区间法(Westlakes Symmetric Confidence Interval) ,置信极差法(Chow and Shao's Confidence Region),安德逊-胡克法(Anderson and Hauck' s Procedure),贝叶斯法(Bayesian' s Approach),双单侧T检验法(Schuirmann's Two One_sided Tests Procedure),非参数法(Nonparametric Statistical Procedures),其中双单侧t检验法用得最普遍,也为FDA(美国食品药物管理局)采纳来评价生物等效性。
6.2 双单侧t检验的假设
　　双单侧t检验的原假设,也一如即往,为了比较和推断试验品与参考品两个总体均数(分别为μT和μR)的差别,然而却把一定范围之外的不等效作为出发点:
H0:μT/μR≤θ1或μT/μR≥θ2,与之相应的备择假设为:
H1:θ1&μT/μR&θ2
如果不以比的形式而以差的形式则表述为:
H0:μT-μR≤(θ1-1)＊μR或μT-μR≥(θ2-1)＊μR
H1:θ'1&μT-μR&θ'2
其中θ'1=(θ1-1)＊μR,θ'2=(θ2-1)＊μR
　　这里有两点不同于通常的检验假设:
第一,从专业上而不是统计上规定了生物等效的范围,其上下界分别是以θ1和θ2表示,是对标准品而言的。
第二,不是把两总体生物等效视为H0,而是把其差或比落在生物等效的范围之外作H0,这样一来,等效视为备择假设,是小概率事件。
6.3 双单侧t检验的统计量
( XT-XR)-θ'1θ'2-(XT-XR)　
S√2/nS√2/n
　　这里S2=SSIntra/(n-2)是方差分析中样本内的剩余均方,n=n1+n2是两次序样本和,对2×2交叉设计是总观测数的一半,XT和XR分别为试验品与参考品样本均数。当t1和t2分别都大于t1-α(υ),其中υ=n-2,则认为是生物等效的,这里应有三点需　　注意:
　　1)生物等效性范围(bioequivalence range)是专业性规定,用参比品均数μR乘以两个份额θ1和θ2表示上下限:θ1＊μR──θ2＊μR,按照FDA的规定,θ1和θ2曾取过下列数值:
θ10.8 0.8 80% 0.7 0.7 0.9 0.9
θ21.2 1.25 120% 1.3 1.43 1.1 1.11
　　目前的规定是对于参比品响应值未经对数变换的数据,取0.8和1.2, ;经过对数变换则取0.8和1.25。也有人把这一范围表示成XR-0.2XR到XR+0.2XR。
　　2)试验品均数落于生物等效性范围内还不能说它与标准参考品就是等效了,必须是试验品的90%置信区间都落在这一范围内才视为生物等效.这与双单侧T检验完全是一致的。
　　3)求t1和t2的公式中S是从总平方和中分出受试对象间,周期与TREAT的平方和后的剩余的均方根,它很容易由SAS的GLM过程得到。
7. 2×2交叉设计及试验结果的实例分析
　　表1a的数据,在节3已有详细描述,我们分别用SAS和BASIC语言,编程序,对之进行分析处理,所得结果是一致的能够互相验证。为节省篇幅,只列出BASIC程序的结果,7.1是对AUC值未经对数变换的结果;而7.2是经过对数变换的结果。为便于理解,又在随后加入少量补充说明。
7.1 对AUC值未经对数变换的计算机输出224
( 7 ) 51.1 ( 8 ) 78.6 ( 9 ) 69.55
( 10 ) 113.15 ( 11 ) 58.65 ( 12 ) 56.1
( 13 ) 77.85001 ( 14 ) 91.60001 ( 15 ) 61
( 16 ) 73.65 ( 17 ) 53.75 ( 18 ) 49.05
( 19 ) 69.55 ( 20 ) 70.1 ( 21 ) 64.2
( 22 ) 59.15 ( 23 ) 56.9 ( 24 ) 75.35
Sequence means=71.66每种顺序平均
totally-mean=72.925总平均
Normality test正态性检验
Skewness(inter) left: 0.7691821 (P= 5.)受试对象间峰度,左倾,不显著
Skewness(intra) right:-1.226886 (P=0 .9947231 )受试对象内峰度,右倾,不显著
Kurtosis(inter) peak: 2. (P=0 .4887297 )受试对象间峰态,尖峭,不显著
Kurtosis(intra) peak: 1.431555 (P=6. )受试对象内峰态,尖峭,不显著
Independency test between intra- & inter- var.受试对象之内和之间变异
Pearson Corr=-0.1076234 (P=0 .6916584 )独立性检验, r不显著
ANOVA table方差分析表
Source Sum of squares Mean square DF
Between subjects:Sequence 167.2 1
Subj(Sequence) .4417 22
Within subjects:Treatments 0..
Periods 82.09 1
Error .24148 22
Total(correct)
F(sequence)=0.262382 P=61.4%顺序效应不显著
F(subject)=7.657741 P LESS THEN 0.01%受试对象效应显著
F(treatment)=3. P=95.6 %分析处理效应不显著
F(period) = 0.9932198 P=33 %周期效应不显著
Lower bioeq. range = 58.39668生物等效范围下界
Upper bioeq. range = 87.59501生物等效范围上界
t1= 5.= 5.596843 t_alpha= 1.717145双单侧t检验结果
Root MSE 9.123677
SEM= 2.633779
90% confident interval: 90%置信区间0.9361025 - 1.060016 (test/refer.)比值68.33159 - 77.37674 (test)试验品Bioequivalent !生物等效!
P(&-t1)= 8.P(&t2)= 6.二t值相应概率The power=0 .9999856等效区间后验概率Wilconxon Two one-sided test双单侧非参检验结果
D12_1 score1= 221u= 4.070319P= 3.相当t1及概率
D12_2 score2= 79u= 4.070319P= 3.
D22_1 score21= 92u= 3.319764P= 5.相当t2及概率
D22_2 score22= 208u= 3.319764P= 5.
END 0F JOB作业完成这里的正态性检验,独立性检验方法对于任何方差分析问题都可参考,在SAS系统中用PROC UNIVARIATE的W检验更好;方差齐性检验是用方差比(F)。对峰度(skewness)检验,如统计量为正,则左倾,负为右倾;峰态(kurtosis)检验,如统计量为正,则为尖峭,如统计量为负,则为平凹。两种检验都按概率大小判断是否显著。按照计算t1和t2的公式,不难验证:
(72.85416 - 72.99584) -(1 - 0.8)×72.99584
t1= =5.48926
(1.2 - 1)×72.99584 -(72.85416 - 72.99584)
t2= = 5.59684
关于生物等效性的统计学判断,按以上计算结果可以从两个角度进行。一个是按双单侧t检验:本例t1= 5.48926而t2= 5.59684二者都大于t_alpha= 1.717145,所以认为是要拒绝H0,而认为是生物等效的,这与通常的t检验是相反的;另一个是按试验品的90%置信区间,本例为68.33159 - 77.37674,此二数值的计算如下:
68.33159 = 72.145×2..316+1..633779
将此二值分别除以标准品的均数(72.99584 ),得到以比值表示的90%置信区间为.9361025———1.060016,落于0.8到1.2之间,故称生物等效。
7.2对AUC值经过对数变换的计算机输出
　　前述数据分析结果是将响应值没有经过对数变换,在进入&DO ANALYZE&后运行中显示
&The responses must be log-transformed ?(Y/N) &时键入&Y&就作对数变换,否则不作对数变换,下面就是对Clayton数据(见显示5的右栏)作对数变换的分析结果:
程序窗口显示意义
Number of observations= 48数据文件共48行(观测数)
Number of subjects= 24受试对象数
group means= 70.74618 (ref.) 70.76852 (test)参考和试验品均数
period means= 72.99二周期均数
subject means=每个受试对象内均数
( 1 ) 77.35608 ( 2 ) 96.76106 ( 3 ) 65.08273
( 4 ) 84.8369 ( 5 ) 112.0451 ( 6 ) 83.23057
( 7 ) 50.97999 ( 8 ) 78.19183 ( 9 ) 69.41383
( 10 ) 113.1431 ( 11 ) 58.6406 ( 12 ) 55.30689
( 13 ) 77.79408 ( 14 ) 91.41621 ( 15 ) 60.66334
( 16 ) 72.01123 ( 17 ) 53.20282 ( 18 ) 48.89867
( 19 ) 69.48307 ( 20 ) 69.66467 ( 21 ) 64.18879
( 22 ) 59.10329 ( 23 ) 56.67988 ( 24 ) 75.34717
Sequence means= 69.4每种顺序平均
totally-mean= 70.75735总平均
SSS-C-SSq-SSQ1 ..21 1. 1.
totally-mean= 70.75735
SSg-SSd-SSe 6. 2. 0..7
101.9 101.7
Normality test正态性检验
Skewness(inter) left: 0.3467537 (P=0 .2321168 )受试对象间峰度,左倾,不显著
Skewness(intra) right:-0.841043 (P=0 .9612696 )受试对象内峰度,右倾,不显著
Kurtosis(inter) plane:-0.5639647 (P=0 .7299727 )受试对象间峰态,平凹,不显著
Kurtosis(intra) peak: 0 .8698384 (P=0 .1725765 )受试对象内峰态,尖峭,不显著
Independency test between intra- & inter- var.受试对象之内和之间变异
Pearson Corr=-0.1307313 (P=0 .7286988 )独立性检验, r不显著
ANOVA table方差分析表
Source Sum of squares Mean square DF
Between subjects: Sequence 1. 1. 1
Subj(Sequence) 2..
Within subjects: Treatments 6. 6. 1
Periods 2. 2. 1
Error 0.. 22
Total(correct) 2.
F(sequence)= 0.1786047P= 67.7 %顺序效应不显著
F(subject)= 6.499078PLESS THEN 0.01%受试对象效应显著
F(treatment)= 3.P= 95.3 % TREAT效应不显著
F(period) = 1.22931P= 28 %周期效应不显著
Lower bioeq. range = 56.59694生物等效范围下界
Upper bioeq. range = 88.43272生物等效范围上界
t1= 5.= 5.909247 t_alpha= 1.717145双单侧t检验结果
Root MSE .
90 % confident interval: 90%置信区间
0.937597 - 1.06723 (test/refer.)比值66.33141 - 75.50243 (test)试验品Bioequivalent !生物等效!
P(&-t1)= 2.P(&t2)= 3.二t值相应概率
The power=0 .999994等效区间后验概率
Wilconxon Two one-sided test双单侧非参检验结果
D12_1 score1= 220u= 4.012584P= 4.相当t1及概率
D12_2 score2= 80u= 4.012584P= 4.
D22_1 score21= 87u= 3.608439P= 1.相当t2及概率
D22_2 score22= 213u= 3.608439P= 1.
END 0F JOB作业完成对于取对数的AUC或Cmax数据,在TREAT过程中还要注意以下几点:
(1)各项平均不应以对数平均的形式报告出来,而应以其反对数报告出来,与原来的测量值就便于比较了,按原底数以对数均数作指数的幂,实质上是几何均数。
(2)方差分析中的各项检验,计算F和P,都在取对数条件下进行。
(3)受试对象内误差均方(MSE)以及两种TREAT均数之差的标准误(SEM)也都是对数下的数值。
(4)求和的公式中的数值,当然也应该采用取了对数的数值,而θ1′和θ2′则分别为LOG(0.8)和LOG(12.5):
(ln(70.76852) - ln(70.74618))-ln(0.8)
t1= =5.925989　
(ln(1.25) - (ln (70.76852) -ln(70.74618))　
t2= =5.909247　
(5)关于生物等效性的统计学判断,按以上计算结果可以从两个角度进行。一个是按双单侧t检验:本例t1=5.925989而t2=5.909247二者都大于t_alpha=1.717145,所以认为是要拒绝H0,而认为是生物等效的,这与通常的t检验是相反的;另一个是　　按试验品的90%置信区间,本例为66.343,此二数值的计算如下:
　　　　　　　　66.33141=EXP(ln(70.7145×0.)
　　　　　　　　75.50234=EXP(ln(70.7145×0.)
　　将此二值分别除以标准品的几何均数(70.74618),得以比值表示的90%置信区间为0..06723,落于0.8到1.2之间,故称生物等效。
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STATISTICAL DESIGN AND ANALYSIS OF BIOEQUIVALENCE STUDIES BY EXAMPLE
ZHANG Xue-Zhong, MA Lin-Mao (Chinese Academy ofPreventive Medicine, Beijing, 100050)
ABSTRACT This paper provides principal concepts about statistical design and analysis of bioequivalence studies by
real example. The differences between the 2×2 Cross_over design and the design for t_test are discussed. For the outcomes
of bioequivalence studies, several analytical methods are introduced: ANOVA, two one_sided t_test, non_parametric
method.Different results of its responses data, Non_logarithm_transformed or logarithm_transformed, are provided. An e-
quation and SAS program for sample size of 2×2 Cross_over design are given in the paper. A real example is analyzed by
BASIC and SAS programs, which outputs are consistent and interpreted deeply. It is peculiar for the normality test of
bioequivalence studies data.
KEY WORDS cross_ two one_ t_test
疾病数据库