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猪戊型肝炎病毒的分子流行病学调查及ORF2区的克隆和表达
【摘要】：
戊型肝炎是一种由戊型肝炎病毒引起的,经过粪-口途径传播的新发传染病和人畜共患病。人与猪易感,其中猪是重要的储存宿主和传染源。
本研究首先应用HEV ELISA抗体检测试剂盒对湖北地区4个猪场80份血清进行HEV抗体IgG检测,结果显示检测的80份血清中阳性血清56份,抗-HEV抗体阳性率高达70.0%。
在此基础上,从年,我们从湖北、河南、安徽及湖南四省采集猪临床肝脏样品及肛拭子样品共计583份,根据GenBank中的序列(登录号DQ279091)设计两对引物,应用套式RT-PCR方法检测HEV RNA。将PCR扩增产物克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒并测序,利用生物学软件对其遗传进化进行分析。结果表明：从样品分析,HEV总阳率为9.6%(56／583),肝脏样品阳性率为15.55%(21／135,),肛拭子样品阳性率为7.81%(35／448)；从猪场分析,9个猪场中有5个猪场存在HEV,猪场阳性率平均为55.56%(5／9)。将其中具有代表性的两株病毒的PCR产物克隆并提交NCBI,获得了GenBank登录号,其中肝脏样品登录号为：GQ202266,肛拭子样品登录号为：FJ445406。序列分析表明：38株阳性样品之间同源性为92-100%,与戊型肝炎病毒基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型同源性分别为77%、77%、87%、96%。遗传进化分析显示,从肛拭子中分离的毒株(FJ445406)与猪源毒株DQ279091处在同一分支上,属于基因4型；肝脏中分离的毒株(GQ)虽然处在4型分支上,但和4型人源毒株处在一个亚支,属于4型中另一亚型,提示该毒株可能是与人源毒株亲缘关系较近。总体来讲,华中地区猪群中存在HEV,其基因型相对稳定,属同一基因型(4型)。
由于戊型肝炎病毒缺乏有效的细胞模型,研究进展相当缓慢。我们在前人研究的基础上,利用A549和IBRS-2、HepG2三种细胞系分别接种HEV的肝脏样品和肛拭子样品,并作3次重复。结果表明：A549和IBRS-2两种细胞系均能增殖HEV病毒,并能稳定传代。其中在A549细胞系中病毒能连续传代21代；IBRS-2细胞系中病毒能连续传代12代以上。用RT-nPCR检测细胞内核酸发现,A549细胞中第一代(前4天)检测不出HEV RNA,但在IBRS-2中却能检测到。以上研究进一步丰富了HEV细胞模型。
此外,本研究参照GenBank上登录的人源AJ272108的cDNA序列设计了5对套式RT-PCR引物,分别扩增ORF2、VLP1、VLP2、NE基因。将扩增产物克隆到pMD18-T载体并测序,然后亚克隆至原核表达载体pET-28a,构建原核表达质粒pET-ORF2(1 aa-674 aa)、pET-VLP1 (134 aa-625 aa)、pET-VLP2 (147 aa-540 aa)、pET-NE (407 aa-620 aa)。将表达载体转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导,表达蛋白进行SDS-PAGE电泳、转膜和Western blot蛋白印迹分析。结果表明：构建的4个重组质粒中pET-ORF2、pET-VLP1不表达,pET-VLP2和pET-NE在大肠杆菌中获得了高效表达；VLP2和NE表达产物与猪HEV阳性血清发生特异性免疫反应。该研究为研制猪戊型肝炎分子诊断试剂及基因工程疫苗提供了材料。
【学位授予单位】：华中农业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2010【分类号】：S858.28
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