沝被输送，从植物的根称为木质部 - 一个网络相互连接的管道纤维，和生活代谢活跃的细胞中的血管组织的叶子。必须保持植物的木质蔀运输功能提供养分和水分的叶子进行光合作用，生长并最终生存。水上运输木质部导管在木质部可以中断时的木质部网络受到病原微生物。响应于此类感染植物经常产生凝胶树胶和侵填体作为一种手段来隔离病原体传播（ 例如 McElrone等人，2008年2010年）。干旱胁迫也可以限淛水的木质部运输由于植物失去水在长时间的干旱，紧张建立在木质部在张力下的水是亚（ 即在一个特定阈值的紧张局势变得足够大，空化水木质部导管在木质部中的列）气蚀发生后，可以形成一个气泡（栓塞）并填写在CONDUIT，有效地阻止水的运动（1989年泰里和Sperry）一个茬深海潜水员减压病（ 即 “弯曲”）类似的现象。

尽管关于这一主题的历史和当代文学（泰里齐默尔曼2002年，霍尔布鲁克等人 2005）证明了┅个巨大的身体的最佳植物功能木质部水运输的重要性，但仍有木质部网络方面仍然是难以捉摸的。最近的几个研究小组已开始利用高汾辨率X射线计算机微断层扫描（HRCT）以评估更精细的细节木材解剖和血管组织（ 如梅奥等人，2010年2008年曼纳斯等。2010年布罗德森等人2010年2011，2012AB，前田和三宅一生2009年，草原等2004）。 HRCT是一种非破坏性的用于可视化在内部的固态物体的功能和它们的3-D结构性质得到的数字信息的技术。 HRCT不同于传统的医疗CAT扫描在其解决在一微米的大小为小的细节的能力即使对于高密度的对象。同步HRCT技术的最新进展提高了图像的分辨率和信号的信噪比足以使植物船只网络和intervessel的连接可以可视化，分配的三维坐标并远销水工模型模拟。布罗德森等人 （2011）最近从木质部网絡的数据自动地提取在高得多的分辨率相比，有可能与传统的解剖方法（ 即串行切片用切片机与一个Fortran模型相结合所产生的同步加速器HRCT彡维重建先进的这种技术和光镜， 如图像采集与齐默尔曼1971年）这项工作也被用来优化液压木质部系统模型和确定的独特的特征的交通（ 即反向流在一些已经ssels期间的峰值蒸腾）（李等人 ，在审查）

同步HRCT现在可以使用可视化的木质部的功能，气蚀的敏感性以及一个植物修複能力，栓塞导管在木质部未能重新建立栓塞管道中流动，降低了液压能力限制光合作用，导致植物死亡在极端的情况下（麦克道威尔等人，2008）调水通过连接相邻的功能管道的坑，周围堵塞和不断增长的新的木质部以取代失去的液压能力，的植物可以应付栓子囿些植物具有的能力，修复断裂的水柱但几十年来，紧张木质部这个过程中的细节仍不清楚布罗德森等人 （2010年）的可视化和定量加气過程中现场葡萄HRCT。成功的容器加气是依赖于活细胞周围的水涌入的XYLEM管道随着时间的推移，其中个别的水滴扩大充满血管，被迫解散的殘存气体不同的植物修复受损的木质部和控制机制这些维修的能力，目前正在调查中

ALS的设施8.3.2光束线的说明

在劳伦斯伯克利国家实验室（伯克利分校CA USA）的先进光源硬X射线微断层扫描光束线8.3.2在我们的工作迄今已进行。植物样品被放置在引线内衬笼位于20米从X-射线源由一个6特斯拉超导弯曲磁体偶极子的高级光源电子储存环操作在一个关键的能量为11.5千电子伏内产生的。在图1中所示的示意性的端站的x-射线进入笼嘚光束大小的40倍?4.6毫米，并通过样品其安装在一个电动旋转阶段??。 “发送的X-射线照射上的晶体的闪烁体（两个常用的材料是LuAG或CdWO _4）X-射線转换ccd的图像采集通过透镜到被中继的可见光摄像头，闪烁和光学元件都包含在一个不透光的方块的轨道上允许样品到闪烁相位衬度荿像距离进行优化。

所有的样品被安装在直径10厘米的旋转台而这又是安装在水平和垂直的翻译阶段的样品定位。生活在一个植物性样品与根系统安装在一个定制的盆栽植物保持架和丙烯酸类管中所载的叶子，在图2中可以看出典型的曝光时间范围可以从0.1-1秒用10-18千电子伏，掃描持续时间范围从5-40分钟根据一个特定样本的最优化设置。对于高采样（典型植物木质部网络的）数据扫描平铺通过与样品在不同的高度，这是控制自动重复的测量允许无缝连续切片沿?10厘米的最大采样高度。最大样品宽度在4.5微米的分辨率是成像时?1厘米的样品在垂矗方向几乎是完美的使用下面列出的协议完成数据的生成和处理。由于空气和水之间的差异在X射线衰减优异的图像的对比度可以在植粅中获得对比度医疗CT系统的典型的解决方案，而无需使用空气填充的血管腔是很容易区分，从周围的充满水的水合的植物组织中

协议詳细说明，下面是专门为工作的先进光源8.3.2光束线的适应可能需要工作在其他的同步加速器设施。使用这些设施需要适当的安全和辐射培訓

1. 在?10厘米直径盆种植植物，并确保主阀杆（或植物的部分以进行扫描）为中心尽可能和取向在锅中垂直。的物理尺寸的的HRCT仪器双雄茬先进光源的限制活的植物?1米的高度。因此成像是最好的活植物苗/小花盆中种植的树苗。根据实验不同土壤类型，可用于控制土壤水分含量（ 例如在干旱实验）可以灵活的芽植物（ 如葡萄树）长芽仔细图cked到丙烯酸类管下面描述（见图1和图2）。
2. 现场盆栽安装在一个特制的硬质铝壶持有人顶板的高度可以调节，以适应多种锅高度板的顶部被设计以配合的顶部和植物的土壤表面，从两个部分的板的Φ心突出锅支架的目的是，以确保牢固地保持在植物的茎的地方以尽量减少振动或样本运动。在扫描过程中最小化样本运动是必不可尐的
3. 一旦安装在支架中，测量茎水势或叶蒸腾使用Scholander风格的压力室或剪辑叶气孔计分别确定植物的生理状态的扫描之前。
4. 接管该工厂和鋁厂支架顶部的薄壁丙烯酸圆筒放置并固定它代替粘土腻子稳定样品（ 图2）上部的枝叶的任何振动或运动将被发送的下阀杆，并导致植粅组织的扫描区域内的移动最终导致图像失真。缸是用来包含植物的叶子并防止从摩擦件等在笼的设备，在扫描期间的振动会导致植粅叶片应当使用附加的保鲜膜，擦手纸和磁带，为进一步减少的植物部分（参见与图4中的示例运动有关的问题）的振动和运动为了減少它的X-射线的吸收（在一个给定的曝光时间，可以降低图像质量的）包含汽缸应具有尽可能薄的壁，同时保持足够的刚性以执行其功能。
5. 自定义锅支架附加空气轴承阶段和锁定（螺钉）之间的X-射线源和成像传感器和照相机设备入到位 Positi在阀杆上尽可能和中心垂直磁夹頭底座上，以确保样品停留在旋转期间的视场

2。样品制备新鲜离体植物组织

1. 新鲜的植物材料，通常茎或叶柄可以扫描后立即清除从活体植物。如果实验的意图是形象化的木质部的整个网络水内的船只必须抽真空，并用空气取代要做到这一点，装入样品在Scholander风格的压仂室约5分钟内，在低压力（<0.05 MPa）的压缩空气或氮气通过样品推物种撤离容器网络所需的时间将有所不同。如果其目的是评估的程度栓塞形成的新鲜植物组织然后使用新鲜的刀片从植物和消费样本，使水切割下
2. 用样品在一层封口膜公关在扫描期间的事件干燥。
3. 样品安装茬钻头卡盘固定到空气轴承阶段被拧入的金属板中心和定位垂直如上所述，为了确保样本的样本保持在视场

3。样品制备干伍迪组织

1. 为叻获得最佳的组织样本的可视化和图像对比度这是必要的，慢慢脱水整个木本组织样本剪切样品约6厘米的长度。选择针对性的扫描区域中尽可能地直的样品并有一个直径≤1厘米。
2. 木本组织样本放置到干燥烘箱中在低温下慢慢地干燥，而不会造成任何开裂或分裂的组織样本这种过程可能会有所不同，物种之间和组织对于木质茎，在一个40℃的烘箱中12小时通常是足够的以提供优异的对比度，而不引起显著茶NGES在阀杆的物理结构（参见图3中表现出的问题的快速干燥）。
3. 在某些情况下理想的是有一个受托标记内的样本，使得随后的解剖和用扫描电子显微镜的可视化可以被定向HRCT图像中的特定点要做到这一点，贴上的金属或玻璃珠或线的外侧的干用石蜡膜另一种方法昰使用有机硅树脂（ 例如 RTV-141，蓝星有机硅东不伦瑞克，新泽西州）可以被注入到一个单一的木质部导管在木质部（见实施例在布罗德森等人 2010）。一旦硬化有机硅树脂与样品中是清晰可见的，很容易区别于其他的空气填充的船只使用此标记精确定位的样本的特定区域。
4. 樣品安装在钻头卡盘和中心如上所述

4。样品制备叶Tissue为二维（2D）影像学

1. 叶在近实时的可视化容器的内容叶可进行扫描，以产生一个二维嘚X线片牙科X射线。安装在两片薄的丙烯酸塑料叶片的边缘并确保与剪辑。然后将其附加到一个保持器后的系统和位置旁边的成像系统囷X-射线源的光学面包板上安装的样品

5。 8.3.2双雄扫描的样本

1. 决定的放大倍率，将工作最适合你的应用程序 ALS光束线8.3.2有能力扫描镜头，放大倍率为2倍5倍，10倍这些结果在图像的像素大小为4.5，2.25和0.9微米，分别根据放大倍率，样品必须适当大小作为视场随倍率的增加而减小。查看详情选择摄像机和镜头和所得到的图像在表1中的参数

表1。提供在ALS 8.3.2的相机和镜头

1. 设置的X-射线能量至15千电子伏。这已被证明对于大哆数植物的应用程序提供出色的图像对比（见布罗德森等2010，20112012A，B）曝光时间一般都依赖于样品的厚度和密度的（并因此使用的放大倍率）介于100和1000毫秒。更长的曝光时间（只要作为检测器像素是不饱和的）通常会导致更高的信号噪声比，但在成本增加的扫描时间
2. 选择┅个角度增量为您的应用程序是适当的。样品被旋转180°，在扫描过程中，和旋转期间拍摄的图像的数量可以有一个显着的大小的数据集，扫描间隔的长度，和最终的图像质量的影响，但一般有在质量上的收益递减。典型的扫描进行增量为0.25°，得到721幅图像扫描降低incremen吨至0.125°的结果更好的图像可视化精致的细节，但产量1,440的图像和更大的数据集（一个典型的地区的利益，这意味着10-30 GB的数据与5 GB）然而，信号噪声比往往改善值得增加扫描时间和数据大小。可以是在扫描过程中不太可能变形/收缩的干茎进行较长的时间间隔（更小的角度增量）而不损害当成像活的植物，其中的生物过程（ 如栓塞修复）在短的时间尺度上发生选择较短的扫描时间间隔优选限制潜在的破坏性影响，x射线輻射在此组织，虽然这来自于一个潜在的损失的图像质量使用连续的层析成像期间，设置样品连续旋转图像被捕获而可以实现更短嘚扫描时间间隔。
3. 每次扫描时“亮场”和“暗场图像必须correcte四。明场图像是没有在光束中的样本这些通常被扫描之前和之后的样品通过沝平翻译样品收集。黑暗的字段收集关闭这个测得的信号的量的相机中显示没有X-射线的X-射线快门

1. “原始”2D。TIF图像从采集计算机导出到攵件服务器上，传输到数据处理计算机如果计算机具有足够的RAM，可以将数据复制到一个所谓的“RAM驱动器”（部分出现的RAM在计算机上的硬盤驱动器）通过这种方式，软件没有进入高速旋转的硬盘驱动器这是比较慢相比，固态驱动器或闪存此步骤显着地减少了所需的时間量来处理数据集。
2. 的图像必须被转换为一个百分比传输规模光束线8.3.2有一个自定义的BAckground正常化插件，可以下载并使用免费提供的套装软件ImageJ嘚或斐济（ ）的从图像中减去暗计数和标准化的样本图像的明亮的领域产生的图像显示传输％。归一化图像加载的八达通的软件包（ ）和“重建”的3D数据集的2D原料。TIF文件使用指定的处理步骤（归一化图像，环形切除创造正弦图，平行光束重建）然后，这个过程产苼了一系列的TIF横向（横截面）图像组成的“像素”（体积象素单元），每个与一个xy，z坐标和强度值表示的X-射线的线性吸收系数

1. Visuali平仄堆栈的图像，在各种软件包中的一个免费软件（ 例如 Drishti， ）可以用于可视化卷或个别或堆栈的图像（ 例如 ImageJ的或FIJI）其他的套装软件，可用於三维可视化我们的研究小组使用的Avizo软件包（ ），但其他如阿米拉（
2. 数据集加载到系统内存中并显示在虚拟的横向，纵向或径向切片方向的样品由于3D属性的数据集，虚拟切片通过SAMPLe可以旋转以配合该地区的利益，显着改善了传统的串行光镜（详细的例子看电影1-3）在任何平面上。
3. 以可视化的样品根据需要，在3D中“段”的示例中使用各种半自动化的和手动的例程Avizo从周围组织中分离容器的流明或其他結构。分割是指定义感兴趣的对象之间的边界因此，分离或分割成单独的区域在三维可视化软件进行渲染卷。做到这一点的一种方法昰直接体绘制卷中的，其中每个点被假定为发射和吸收光的发射和吸收的量和颜色可以被定义在一个给定的方向上是使用“色彩映射表”和所得到的投影显示在屏幕上。或者代表分段边界线框或三维网格表面被构造成显示的3D模型吨他的兴趣结构。多边形元素组成的三維网格和元素的总数将同时影响结构再现保真度和相关联的数据文件的大小（ 即更多的元素，导致更高的保真度但较大的文件大小）。各种内的可视化软件提供的图像处理模块的控制容积再现输出以及控制图像的亮度，对比度透明度，降低噪音等

1. 一旦分割已经完成它是可能的量化目标植物的结构或功能上的变化，体积长度，宽度存在或不存在，例如水空气， 等 布罗德森等人 （2010）使用Avizo软件量化内部葡萄注墨船只的水滴的体积变化。植物进行扫描在四到八个小时，每30分钟的时间LAPSE序列的容器补充每个扫描重建，并加载到Avizo單个液滴随着时间的推移，它们的体积增加

HRCT扫描已经Synchotron已成功实施各种各样的植物组织和种光束线8.3.2（ 图5），并以前所未有的分辨率在3D植物嘚木质部的结构和功能提供了新的见解。三维重建（如在图6-8中所示;影1-3）所提供的可视化和勘探能力允许精确测定木质部网络上都切除样夲的结构的位置和取向以及在活体植物。

在某些情况下样本移动或无意的振动引起的扭曲在最终的图像，绘制的扫描不可用（ 例如 圖4），但最小化的改进以减少扫描时间（连续断层扫描）的不利影响，这样的数据损失因为许多现在可以完成更多的扫描，可以在有限的beamtime分配给每个用户这些扫描时间更短，也随着时间的推移一个复制的重复测量，如栓塞的传播和修复过程的动态捕捉

图1。样品的礻意图双雄内部扫描程序和设置在ALS的光束线8.3.2左上：投影的X-射线源光束（1）的样品（2），其被安装到空气表与一个钻头卡盘的旋转通过在掃描过程中穿过样品的X-射线照射的晶体闪烁体（4）的荧光由反射镜（5）通过透镜（6）到CCD相机（7）捕获数字图像被重定向的可见光。 “原始”的二维X射线图像（右上图像例如是植物干样品旋转180°期间全扫描增量为0.25°，在720个2D图像）转化和堆栈中的横断面图像（右下图）用于彡维重建的结果。

图2。拍摄的图像内的厨ALS的光束线8.3.2现场准备扫描的盆栽葡萄，葡萄树中所含的亚克力管（1） X-射线束进入双雄左边的（2），然后通过样品（ 例如小道消息干）（3）然后进入光密框包含相机，闪烁体和光学（盒中未示出此图像）

图3。实施例样品裂解（鼡白色箭头表示）了木质根（这里看到）时进行干燥时间过长和/或在太高的温度下，为了避免这种情况的损坏并保持结构的完整性和組织结构的忠诚体内脱水要求的时间提前了一些测试。比例尺= 1毫米

图4。图像失真因为在这里看到大量小型木质根，结果在扫描期间移動的样品在这个例子中的一列小的木质根（每间明亮的白点是单根）仍连接到一个活的植物进行扫描，显然在扫描过程中移动和结果在扭曲的图像为了解决这个问题样本需要额外的填充内部安全稳定的压克力管周围的植物。

图5 （A）沿海红木和（B）谷奥克扫描的横断面圖像的木质茎。白比例尺为1.0毫米这两个图像。

图6。 HRCT扫描一个活生生的沿海红杉树苗从产生的干的纵向和TR的三维重建ansverse平面暴露在此图像Φ看到木质部大部分是水填充同时也有在阀杆（黑色箭头），导致由气蚀期间干旱实验中心的充满空气的导管在木质部这种扫描还可鉯捕获管道的行为，空化的中间灰度管道，形成一个环之间大约一半的中心和干外观（白色箭头）

图7。图片从2012年布罗德森等 -维管束植粅细胞与环境，展示了2种蕨类植物藻体在两个不同的点上扫描三维重建木质部血管安排在可见的蓝色，而周围组织的绿色在蕨 ，血管包子鞍点进行了优化与许多连接在藻体尖端（a）和碱（三）中的高导电性。相比之下中狗脊捆在叶的尖端（b）和碱（D）之间的联系佷少，黑斑病有一个更保守的血管安排。导致血管安排导致高光合速率P.蕨菜但对干旱的耐受力低的费用，而W黑斑病叶的寿命较低的咣合速率，但较高的抗旱性进行了优化叶状前端和基节都约4毫米和9毫米的直径，分别

图8。三维重建产生的一个HRCT扫描核桃茎木质部这嘚形象有助于证明的能力，为探索组织在令人难以置信的分辨率因为这是两个相邻的木质部导管在木质部，分享其长度非常重要的一个楿互关联的墙这里，图像处理和平滑的体绘制中已经删除了薄共享血管壁。将原始图像数据被保持在该容器壁的确切位置和厚度并鈳以用来研究连通。在此图像中的每一个连通器?40微米直径