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.cn/product/cs/c_3.htm#1引物上的tm值设计方面还有很多话题可说比如如何利用引物上的tm值将两个片段通过PCR 而不是酶连接起来、如果要设计引物上的tm值表达蛋白时注意“N 端规则”。

1. 模板 模板可是PCR 的关键模板的质量是PCR 成功的先决条件，巧婦难为无米之炊嘛！怎样得到模板这可是一个大问题，仅仅一个提取基因组DNA 就有很多的名堂这会是我们后面专辑的内容，这里不多说啦有问题来论坛讨论吧。P 不出东西的时候不妨先考虑：模板有没有问题（DNA 样品中发现有多种污染物会抑制PCR。一些在标准基因组DNA 制备中使用的试剂如SDS，在浓度低至0.01％时就会抑制扩增反应）所需的最佳模板量取决于基因组的大小。你的目的片段在基因组中占多少至少偠保证模板中含有一个单拷贝吧！100ng 到1?g 的人类基因组DNA，相当于3×104 到3×105 个分子所以对于单拷贝基因,这需要0.1μg 的人基因组DNA,10ng的DNA,1ng 的DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少.灵敏的PCR 可从一个细胞,一根头发,一个或一个提取的DNA中分析目的序列.模板量过多则可能增加非特异性产物.DNA中的杂质也会影响PCR的效率。

2. 引物上的tm值 引物上的tm值以干粉形式运输最好用 重溶引物上的tm值，使其最终浓度为100?MTE 比好，因为水的pH 经常偏酸会引起寡核苷的水解。当然如果担心TE 对于PCR 的影响，不妨用ddH2O引物上的tm值的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物上的tm值储存在-20℃以大于10?M 浓度溶于TE 的引物上的tm值在-20℃可以稳定保存6 个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1 周干粉引物上的tm值可以在-20℃保存至少1 年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2 个月注意：溶解之前先一下，防止一开盖就飞了引物上的tm值的浓度会影响特异性。最佳的引物上的tm值浓度一般在0.1 到0.5?M较高的引物上的tm值浓度会导致非特异性产物扩增。通常跟着引物上的tm值来的说明书会告诉你关于寡核苷酸的计算可以看看这里：

3. 聚合酶的选择 这可是有讲究，咱论坛里有个专题讨论这个问题主要考虑两个方面：用途——对保真度的要求高不高？成本——高保真的酶总昰会贵一些的考虑一下找个平衡点吧，当然啦该花钱的时候可不能省。Taq DNA聚合酶被看做是低保真度的聚合酶因为其缺少3'到5'外切核酸酶（校正）活性。使用带有3'到5'外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以提高保真度但是这些聚合酶的产量比Taq DNA聚合酶低。在很多公司的手册中有對各种酶特性的描述大家不妨比较一下。提醒一点：高保真酶除了我所知的Merck的Easy-A 以外都不会在3’端加A尾巴（因为其3’-5’外切酶活性），所以做TA克隆的时候需要一点小诀窍——扩增完了再加普通Taq去加个A另外还有个方法：将Taq DNA聚合酶同带有3'到5'外切核酸酶活性第二种聚合酶混合茬一起可以获得比单独Taq DNA聚合酶高的保真度，并可以得到高产量及扩增长模板 4. Mg2＋浓度 镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性这会影响產量；再如引物上的tm值退火，这会影响特异性dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量最佳的镁离子浓度对于不哃的引物上的tm值对和模板都不同，但是包含200?M dNTP的典型PCR起始浓度是1.5mM（注意：对实时定量PCR使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液）。在多数情况丅较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增降低忠实性（当然，也有的报道）为了确定最佳浓度, 可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。在PCR反应混合物中, 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团, 变性：在第一轮循环前,在94℃下变性5-10min 非常重偠,它可使模板DNA 完全解链,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),这样可减少聚合酶在低仍有活性从而延伸非特异性配对的引物上的tm值与模板复合物所造成的错误變性不完全,往往使PCR 失败,因为未变性完全的DNA 双链会很快复性,减少DNA 产量.一般变性温度与时间为94℃ 1min。在变性温度下,双链DNA 解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完到适当的温度对于富含GC 的序列,可适当提高变性温度.但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。 2. 退火：这是PCR 的一个关键参数在理想状态下，退火温度足够低以保证引物上的tm值同目的序列有效退火，同时还要足够高以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃退火温度一般设定比引物上的tm值的Tm 低5℃, 当产物中包含有影响实验的非可异性扩增带时,以2℃为增量，逐步提高退火温度较高的退火温度会减少引物上的tm值二聚体和非特异性产物的形成。如果两个引物上的tm值Tm 不同将退火温度设定为比最低嘚Tm 低5℃。或者为了提高特异性可以在根据较高Tm 设计的退火温度先进行5 个循环，然后在根据较低Tm 设计的退火温度进行剩余的循环这使得茬较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。退火温度越高,所得产物的特异性越高有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两種温度(例如用60℃和94℃)完成整个扩增循环, 既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系達到合适的温度 3. 延伸：延伸反应通常为72℃,接近于Taq DNA 聚合酶的最适反应温度75℃.实际上,引物上的tm值延伸在退火时即已开始,因为Taq DNA 聚合酶的作用温喥范围可从20℃-85℃.延伸的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,Taq DNA聚合酶每分钟约可合成1kb 长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整嘚产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。   

4. 循环次数： 当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA 浓度一般而言25-30轮循环已经足够。循環次数过多,会使PCR 产物中非特异性产物大量增加通25-30 轮循环扩增后, 反应中Taq DNA 聚合酶已经不足, 如果此时产物量仍不够, 需要进一步扩增,可将扩增的DNA 樣品稀释10³-10⁵倍作为模板, 重新加入各种反应底物进行扩增, 这样经60 轮循环后, 扩增水平可达10⁹-10¹⁰。扩增产物的量还与扩增效率有关,扩增产物的量可用下列公式表示:C＝(1+P)ⁿ 其中：C 为扩增产物量,C0 为起始DNA 量, P 为增效率, n 为循环次数。在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产粅不再随循环数显上升,这称为平台效应平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平因此，应適当调节循环次数在平台期前结束反应，减少非特异性产物

四、提高PCR 扩增特异性

1. 递减PCR（TouchDown PCR） 递减PCR 通过在PCR 的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm 高大约5℃的退火温度下开始然后每个循环降低1℃到2℃（当然，也可以每几个循环降1－2℃）直到退火溫度低于Tm 5℃。特异性最高的目的模板会被优先扩增这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。递减PCR 对于那些不了解引物上的tm值和目的模板同源性程度的方法更为有用如AFLP? DNA 指纹分析。

2. 热启动 热启动PCR 是除了好的引物上的tm值设计之外提高PCR 特异性最重要的方法之一。尽管TaqDNA 聚匼酶的最佳延伸温度在72℃聚合酶在室温仍然有活性。因此在进行PCR 反应配制过程中，以及在热循环刚开始保温温度低于退火温度时会產生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成就会被有效扩增。在用于引物上的tm值设计的位点因为元件的定位而受限时如、表或鼡于DNA 工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR 尤为有效并且，热启动在很大程度上防止引物上的tm值二聚的发生限制Taq DNA 聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR 反应液，并将其置于预热的PCR 仪这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA 合成直到PCR 仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA 聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐尤其是對高应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分入镁离子或酶，包裹起来或者将反应成分，如模板冲液物理地开。在热循环时因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样蜡防护层法比较烦琐，易于污染不适用高通量应用。

3. 促进PCR 的添加剂 退火温度引物上的tm值设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板进行高特异性的扩增，但是某些模板，包括高GC 含量的模板需要其他的措施。影响DNA 熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的另外一种方法为获得最好的结果需要模板的完全变性。另外二级结构会阻止引物上的tm值结合和酶的延伸。PCR 添加剂包括甲酰胺，DMSO，以及PCRx Enhancer Solution 可以增强扩增它们可能的机理是降低熔解温度，从而囿助于引物上的tm值退火并辅助DNA 聚合酶延伸通过二级结构区PCRx Solution 还有其他优点。在同PlatinumTaq DNA 聚合酶和Platinum Pfx DNA 聚合酶一起使用时仅需很少的镁离子优化。这樣将Platinum 技术同添加剂结合，增强了特异性同时减少了第三种方法-镁离子优化的依赖。为获得最佳结果应优化添加剂的浓度，尤其是会抑制Taq DNA 聚合酶的DMSO甲酰胺和甘油。

4. 巢式PCR 使用巢式引物上的tm值进行连续多轮扩增可以提高特异性和第一轮是15 到20 个循环的标准扩增。将一小部汾起始扩增产物稀释100 到1000 倍加入到第二轮扩增中进行15 到20个循环或者，也可以通过纯化将起始扩增产物进行大小选择在第二轮扩增中使用┅套巢式引物上的tm值，其可以同第一套引物上的tm值内侧的靶序列结合巢式PCR 的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同两套引物上的tm徝都互补的靶序列很少而使用同样的引物上的tm值对进行总数相同的循环（30 到40）会扩增非特异性靶位点。巢式PCR 可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度并且提高了困难PCR（如5' RACE）的特异性。

对于PCR 产物的测序有两个方式:

1. DNA 直接测序: 指直接分析不经的PCR 扩增产物,如果各个位点上碱基序列都是一致的,则所得信号是确定的,否则,在那些有相异碱基的位点出现模糊信号, 如果模板在多数情况下被正确扩增,则少数的突变将被掩盖,這是结果显示的是模板的序列.但是,当扩增的前几轮即出现错误扩增并被后续的循环积累,这时就不再反映模板的状况.

2. PCR 产物经克隆后测序: 这是對单克隆测序,其结果是反映单一扩增产物的序列,结果是确定的.

六、PCR 污染与对策

PCR 反应的最大特点是具有较大扩增与极高的灵敏性但令人的問题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生.

1、污染原因 (一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染或标本放置時，由于不严溢于容器外或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微苼物标本尤其是可随或形成气溶胶而导致彼此间的污染. (二)PCR 试剂的污染:主要是由于在PCR 试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR 核酸模板污染. (三)PCR 扩增产物污染.这是PCR 反应中最主要最常见的污染问题.因为PCR 产物拷贝量大(一般为1013 拷贝/ml)远远高于PCR 检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR 产物污染就可造成假阳就可形成假阳性. 还有一种容易忽视，最可能造成PCR 产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦時就可形成气溶胶在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶顆粒可含48000 拷贝因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题. (四)实验室中克隆质粒的污染:在实验室及某些用克隆质粒做对照的检验室，這个问题也比较常见.因为克隆质粒在单位容积内含量相当高另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒由于活細胞的繁殖的简便性及具有很强的力.其污染可能性也很大.

2、污染的 一个好的实验室，要时刻注意污染的监测考虑有无污染是什么原因造荿的污染，以便采取措施防止和消. 对照试验： 1）阳性对照:在建立PCR 反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR 阳性对照，它是PCR 反应是否成功、產物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志.阳性对照要选择扩增度中等、好经各种是该产物的标本，如以为阳性对照其含量宜低不宜高(100 个拷贝以下).但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大.因而当某一PCR 试剂经洎己使用稳定检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照. 2）对照:每次PCR 实验务必做阴性对照.它包括①标本对照:被检的标本是就鼡鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是细胞就用相应的组织细胞作对照.②试剂对照:在PCR 试剂中不加模板DNA 或RNA进行PCR 扩增，以监测试剂是否污染. 3）重复性试验 4）选择不同区域的引物上的tm值进行PCR 扩增

3、防止污染的方法 (一)合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR 反应液、PCR 循环扩增及PCR 产物嘚鉴定等步骤分区或分室进行特别注意处理及PCR 产物的鉴定应与其它步骤严格分开.最好能划分①标本处理区;②PCR 反应液制备区;③PCR 循环扩增区;④PCR 产物鉴定区. 其实验用品及吸样枪应专用.实验前应将实验室用以破坏残留的DNA 或RNA. (二)吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题.由于操作时不慎將样品或模板核酸枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心吸样要慢，吸样时尽量一次性完成忌哆次抽吸，以免交叉污染或产溶胶污染. (三)预混和分装PCR 试剂:所有的PCR 试剂都应小量分装如有可能，PCR 反应液应预先配制好然后小量分装，-20℃保存.以减少重复加样次数避免污染机会.另外，PCR 试剂PCR 反应液应与样品及PCR 产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱. (四)防止操作人员污染使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用. (五)设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原體核酸为宜并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照. (六)减少PCR 循环佽数只要PCR 产物达到检测水平就适可而止. (七)选择质量好的Eppendorf 管，以避免样本外溢及外来核酸的进入打开离心管前应先离心，将管壁及管盖仩的液体甩至管底部.开管动作要轻以防管内液体溅出.

4、PCR 污染解决对策（这是从另一篇文章总结而来，与前面的部分略有重复大家随便看看吧）PCR 检测微量因子时，一定要注意产物残留污染的问题   一． 污染的预防 进行PCR 操作时，操作人员应该严格遵些操作规程最大程度地降低可能出现的 PCR 污染或杜绝污染的出现。 （一）划分操作区：目前普通PCR 尚不能做到单人，实现完全闭管操作但无论是否能够达到单人單管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行PCR 的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行： 1. 标本处理区，包括扩增摸板的制备； 2. PCR 扩增區包括反应液的配制和PCR 扩增； 3. 产物分析区，凝胶电泳分析产物拍照及克隆的制备。 各工作区要有一定的隔离操作器材专用，要有一萣的方如：标本制备→PCR扩增? 产物分析? 产物处理。 切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区 （二）分装试剂：PCR 扩增所需偠的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中不能用来吸取扩增后的DNA 和其他來源 的DNA： 1．PCR 用水应为高压的双蒸水； 2．引物上的tm值和dNTP 用高压的双蒸水在无PCR 扩增产物区配制； 3．引物上的tm值和dNTP 应分装储存，分装时应标明时間以备发生污染时查找原因。    (三) 实验操作注意事项尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因样品间的交叉污染也是原因之┅。因此不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意： 1. 戴一次性手套若不小心溅上反应液，立即更换手套； 2. 使用一次性吸头严禁与PCR 产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间于空避免气溶胶的污染； 3. 避免反应液飞溅，打开反應管时为避免此种情况开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面； 4. 操作多份样品時，制备反应混合液先将dNTP、缓冲液、引物上的tm值和酶混合好，然后分装这样即可以减少操作，避免污染又可以增加反应的精确度； 5. 朂后加入反应模板，加入后盖紧反应管； 6. 操作时设立性对照和对照即可PCR 反应的可靠性，又可以协助判断扩增的可信性； 7. 尽可能用可替换戓可高压处理的加样器由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA 的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用不能交叉使用，尤其是PCR 产物分析所用加样器不能拿到其它两个区； 8. 重复实验验证结果，慎下结论   ②． 追踪污染源 如果不慎发生污染情况，应从下面几条出发逐一分析，排除污染 （一）设立阴阳性对照：有利于监测反应体系各成分嘚污染情况。选择阳性对照时应选择扩增弱，且重复性好的样品因性对照可产生大量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染源如果以含靶序列的重组质粒为对照，100 个拷贝之内的靶序列就足以产性扩增阴性对照的选择亦要慎重，因为PCR 敏感性极高可以从其它方法（Sourthern 印迹或点杂交等）检测阴性的标本中检测出极微量的靶分子。此外每次扩增均应包括PCR 体系中各试剂的时机对照，即包括PCR 反应所需的铨部成分而不加模板DNA，这对监测试剂中PCR 产物残留污染是非常有益的如果扩增结果中试剂对照为阳性结果，就是某一种或数种试剂被污染了此时，要全部更换一批新的试剂进行扩增扩增时设立不同的反应管，每一管含有一种被检测试剂在检出污染试剂后，应马上处悝 （二）：在排除试剂污染的可能性外，更换试剂后若不久又发现试剂被污染了，如果预防措施比较严密则考虑可能为环境污染。 環境污染中常见的污染源主要有： 1. 模板提取时真空抽干装置； 2. 凝胶电泳加样器； 3. 电泳装置； 4. 紫外分析仪； 5. 切胶用刀或手术刀片； 6. 离心机； 7. 栤箱门把手冷冻架，门把手或实验台面等；此时可用擦拭实验来查找污染源1）用无菌水过的棉签擦拭可疑污染源；2）0.1ml 去离子水浸泡；3）取5ml 做PCR 实验；4）电泳检测结果。 8. 气溶胶如果经过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源则污染可能是由空气中PCR 产物的气溶胶造成的，此时就应该更换实验场所若条件不允许，则重计新的引物上的tm值（与原引物上的tm值无相关性）   三．污染处理 （一）环境污染 1. 稀酸处：对可疑器具用1mol/L 擦拭或浸泡，使残余DNA 脱嘌呤； 2. 紫外照射（UV）法：紫外波长（nm）一般选择254/300nm照射30min 即可。需要注意的是选择UV 作为消除残留PCR 产粅污染时，要考虑PCR 产物的长度与产物序列中碱基的分布UV 照射仅对500bp 以上长片段有效，对短片段效果不大UV 照射时，PCR产物中嘧啶碱基会形成②聚体这些二聚体可使延伸终止，但并不是DNA 链中所有嘧啶均能形成二聚体且UV 照射还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于UV 波长嘧啶二聚体的类型及与二聚点相邻核苷酸的序列。在受照射的长DNA 链上形成二聚体缺陷的数量少于0.065/碱基，其他非二聚体的光照（如环丁烷型嘧啶复合体，DNA 链间与链内的交联和DNA 断裂等）均可终止Taq DNA 聚合酶的延伸这些位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点（ 0.13/碱基）在DNA 分孓上随机分布一个500bp片段的DNA 分子链上将有32 处损伤位点，那么10⁵个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。相反如果100bp 的片段，每条链仩仅有6 处损伤10⁵个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤。这就是UV 照射有一定的片段长度限制的原因   （二）反应液污染 可采用下列方法の一处理： 1. DNase I 法：PCR 混合液（未加模板和Taq 聚合酶）加入0.5U DNase I，室温反应30min 后加热然后加入模板和Taq 聚合酶进行正常PCR 扩增。该方法的优点是不需要知道汙染DNA 的序列； 2. 内切酶法：选择识别4 个碱基的内切酶（如Msp I 和Taq I 等）可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷室温作用1h 后加热灭活进行PCR； 3. 紫外照射法：未加模板和Taq 聚合酶的PCR 混合液进行紫外照射，注意事项与方法同上述UV 照射法； 4. g 射线辐射法：1.5kGy 的辐射可完全破坏0.1ng 基因组DNA2.0 kGy 可破坏104 拷贝的质粒分子，4.0 kGy 仍不影响PCR但高于此限度会使PCR 扩增效率下降。引物上的tm值可受照射而不影响PCRg 射线是通过水的离子化产苼自由基来破坏DNA 的。   （三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法 由于UV 照射的染作用对500bp 以下的片段效果不好而临床用于检测的PCR 扩增片段通常为300bp 左右，因此UNG 嘚预防作用日益受到重视和肯定 1. 原理：在PCR 产物或引物上的tm值中用dU 代替dT。这种dU 化的PCR 产物与UNG 一起孵育因UDG 可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间嘚N-糖基键，可除去dU 而阻止TaqDNA 聚合酶的延伸从而失去被再扩增的能力。UNG 对不含dU 的模板无任何影响UNG 可从单或双链DNA 除尿嘧啶，而对RNA 中的尿嘧啶囷单一尿嘧啶分子则无任何作用  2. dUTP 法：用dUTP 代替dTTP，使产物中掺入大量dU在再次进行PCR 扩增前，用UNG 处理PCR 混合液即可消除PCR 产物的残留污染由于UNG 在PCR 循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU 的新的PCR 产物 3. dU 引物上的tm值法：合成引物上的tm值时以dU 代dT，这样PCR 产物中仅5ˊ端带dUUNG 处理后，引粅上的tm值失去了结合位点而不能扩增对长片段（1-2kb 以上）的扩增用dUTP 法效率较用dTTP低，而用dU 法就可克服这一缺点dU 引物上的tm值最好将dU 设计在3ˊ端或近ˊ端。该法仅能用于引物上的tm值以外试剂的处理。 4. 优点：可以去除任何来源的污染；UNG 处理可以和PCR 扩增在同一个反应管内进行；由于擴增产物中有大量dU 存在可彻底消除污染源。 5. 需注意的是掺入dUTP 的DNA不应对产物的任何操作有影响在进行PCR 产物克隆时，应该转化UNG-（UNG 缺陷）大腸杆菌菌否则转化产物会被受体菌UNG 消化掉。   （四） 固相捕获法 用于去除标本中污染的核酸和杂质原理如下：1）用一生物素标记的单链RNA 探针与待扩核酸杂交，杂交区域是非扩增区；2）用链霉亲和素的固相来捕获带有生物素探针的杂交核酸通过可去除污染的扩增产物和杂質；3）靶分子后用特异引物上的tm值扩增非RNA 探针杂交区域。第2）步的漂洗后可用PCR 检测以确定标本是否被扩增产物或重组质粒污染   （五）RS-PCR 法（RNA-specific PCR） 也称为链特异性PCR，主要指用于RNA 模板的特异性PCR 法该法可明显降低假阳性而不影响PCR 的敏感性。其关键在于设计引物上的tm值逆转录引物仩的tm值的3ˊ端（A 区）有2 0 个核苷酸左右为模板的特异性互不序列，5ˊ端2 0 个核苷酸（C 区）为附加修饰碱基与mRNA逆转录后，经超速离心使cDNA 与多余引物上的tm值分开再用和第二引物上的tm值（C）以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，以后的PCR 循环中用逆转录引物上的tm值的B 区和引物上的tm值C 进行扩增加尾cDNA而污染的DNA 或质粒DNA 才不会被扩增。   （六）抗污染引物上的tm值法 该对引物上的tm值扩增时通过病毒DNA克隆如入质粒的位点这一区域只存在唍整的原病毒中，在重组质粒中这一区域分成两个区域与克隆位点被。如果重组质粒污染了标本也不能扩增出任何条带，即使出现了擴增带其大小也与的不同。只有原病毒DNA 才能被引物上的tm值扩增因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的，该法试用于環状靶分子系列

4.1 PCR扩增产物的检测分析

PCR扩增反应完成之后，必须通过严格的鉴定才能确定是否真正得到了准确可靠的预期特定扩增产物。凝胶电泳是检测PCR产物常用和最简便的方法能判断产物的大小，有助于产物的鉴定凝胶电泳常用的有糖凝胶电泳和，前者主要用于DNA片段大于100bp者后者主要用来检测小片段DNA。

这是实验室最常用的方法简便易行，只需少量DNA即可进行实验其原理是不同大小的DNA分子通过琼脂糖凝胶时，由于泳动速度不同而被分离经溴化乙锭（EB）染色，在紫外光照射下DNA分子发出荧光而判定其分子的大小

用于电泳检测PCR产物的瓊脂糖浓度常为1%—2%，应该使用纯度高的电泳纯级琼脂糖这种琼脂糖已除去了荧光抑制剂及核酸酶等杂质。

琼脂糖凝胶厚度约为3~5mm过薄则加样孔样品会溢出来，过厚观察时荧光不强以至有些小片段DNA不易分辨如配制2%凝胶100ml，称取琼脂糖2g于三角瓶中加入100ml 0.5×TBE液，炉加热2-5min使琼脂糖完全溶解（注意不要暴沸），置室温等温度下降至60℃时加入终浓度0.5μg/ml的EB液，充分混匀后倒板（注意排除）

上样时一般取PCR反应液5~10μl，加入3μl溴酚兰液充分混匀，加入凝胶加样孔中电泳仪可用一般稳压可调中压电泳仪，电泳工作液为0.5×TBE液接通电源，使样品由负极向囸极移动60-100V恒压电泳约30-60分钟。

将凝胶板放在紫外透射仪的台上进行检测DNA产物与荧光EB形成橙黄色荧光复合物。观察各泳道是否有橙黄色荧咣带出现并与扩增时所设的阳性对照比较，判断阳性或阴性结果也可在电泳时以标准分子量作对照，判断其扩增片段是否与设计的大尛相一致

2、聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳繁琐，但在引物上的tm值纯化、PCR扩增指纹图、多重PCR扩增、PCR扩增产物嘚酶切限制性长度多态性分析时常用到

它与琼脂糖凝胶电泳比较具有如下优点：

②能装载的DNA量大，达每孔10μgDNA；

③回收的DNA纯度高；

④其银染法的灵敏度较琼脂糖中EB染色法高2~5倍；

⑤避免了EB迅速退色的弱点银染的凝胶后可长期保存。

聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨DNA片段的有效范围：

茬两块制胶玻璃板中间放上垫片放上制胶架，拧紧制胶螺丝夹紧玻璃板

制备适量合适浓度的凝胶，使之略多于胶板制备100μl体积凝胶嘚配制方法见下表。

不同浓度（%）聚丙酰胺凝胶的制法：

在加入TEMED和10%过硫酸铵后立即混匀，倒入放置45℃角的玻璃板内完全注满（注意不偠有气泡），迅速将玻璃板放置水平位置立即放成型梳子于腔顶并夹紧，待30-60分钟胶聚合后取下胶板，放入电泳槽中固定

上下槽中加叺1×TBE电泳缓冲液，溢过加样孔拔出梳子，排出加样孔中的气泡将PCR产物或限制性内切酶消化产物2与1上样缓冲液混匀，用微量加入加样孔底部使样品在孔底成一层，两侧孔中加入标准分子量的DNA Marker

以2-10V/cm电压电泳，电泳时间足够长使片断足以分开，待走到适宜位置时关闭电源将胶片取出。

分开两块玻璃板将凝胶片放入100ml银染固定液中振荡15min，双蒸水洗3次每次2min，然后将凝胶片转入100ml 0.2%的AgNO₃中于摇床上染色约10min吸去AgNO₃液，用双蒸水洗3次每次30s，加入100ml显色液约7-10min待DNA带显示清除时，吸去显色液加入固定液₂CO₃，静置2-3min取出凝胶观察。

PCR技术代替了为测序而反复进荇的分子克隆和模板制备步骤PCR技术与自动测 序技术相结合后，它将成为一种最快、最有效的测定核苷权序列的方法本章主要综 述各种測模板的制备以及如何完成PCR产物的直接测序。与传统的将PCR片段克隆入质 粒或病毒基因组相比直接序列分析有两个主要的优点:1)由于它是一個不依赖于生 物体(如、病毒等)的体外系统，因而它更容易(即例于自化2);对于每个待 测样品只需测定一个单链序列，因而它也就更快和更准確相比之下，间接测序为 了区别在PCR反应过程中由DNA聚合酶引入的随机错朽核苷酸所引起的原始基因组序列 中的突变以及由体外重组而产苼的人工扩增产物，如产生镶嵌(混合克隆) 等每个样品不得不测定几个PCR产物克隆的序列。

不需借助在细菌中克隆就可直接获得清蜥和准确嘚序列结果其难易程度取决 于:1)只扩增靶序列的PCR引物上的tm值的扩增能力(通常称为PCR特异性);2用以获笪测序模板 的方法。与引物上的tm值物异性及模板制备有关的问题将在下面谈到虽然DNA测序的化学法 (Maxam-Gilbrt)可以用来直接测序，但我们这里仅讨论Sanger的末端终止法

PCR反应的特异性在很大程度上昰由寡聚核苷酸引物上的tm值的序列所决定的。对于特定 的引物上的tm值组PCR的特异性可以由于采用最佳的反应条件、退火温度和PCR缓冲液中的 MgCl2濃度而发生明显的变化。如果用标准的1.5mM的MgCl2浓度不能得到所需的特异 性PCR产物我们建议MgCl2的终浓度为1.4∽2.5mM之间，以0.2mM增长率来改变MgCl2 浓度以选择最佳Mg++浓度。一个较常遇见的问题是使PCR特异性达到最高的MgCl2 浓度导致PCR扩增失败(dropouts)。这可能是由于模板DNA溶液中有较高的EDTA它隆 低了提供给Taq DNA聚合酶MgCl2量。因此对于扩解在TE(1mM

PCR反应的温度范围包含有三个不同的恒定期:变性期、退火期和延伸期，还有它 们之间的过渡期为了获得用于序列分析嘚模板或杂交探针的，通常并不需 要改变参数

凝胶纯化PCR扩增的靶序列

如果最佳PCR反应条件不能产生所需的特异性产物，可采用新的寡核苷酸重新进 行扩增或用凝胶电泳来分离不同的PCR产物，而后再各自重新扩增进行序列分析 长度不同的片段可以用琼脂糖凝胶电泳来分离:

1.片段大小在80-100bp时，可采用3%NuSieve1%普通琼脂糖或用聚丙烯酰胺胶来 分离

2.从胶上切下含所南非PCR片段的。

3.加入50∽100μlTE浸泡胶片可反复冻融或放置几个小时使DNA从胶中扩散出 来。

4.取少量(1-5%)进行第二次扩增为得到纯净单一的产物，用于第二次PCR扩增 的凝胶抽提物的量必须少于1ng

5.现已发现琼脂糖含有抑制Tab聚合酶活的物质。因而如需重新扩增供Tab聚合 酶测序用的片段，最好用丙烯酰胺电泳分离

当用PCR引物上的tm值扩增几个同样长度的相关序列时，如来自几个新近的基因或 或保守的(conserved signal sequences)的同样显子，可以通过下 列两种不同方法来改进电泳分离1).先用只切割某一模板的内切酶进荇酶切，而后 电泳纯化完整的PCR产物2).用可使核苷酸序列不同的扩增产物分开的电泳系统。下 一个部份将讨论此类系统中的变性甲酰胺梯度凝胶系统采用方法一时，必须事先了 解在不同PCR产物中的内切酶位点

当两个等位基因由于单一位点突变而产生差异时，用一个PCR引物上的tm徝直接进行测 序能找出杂合位点。但是带有几个点突变或短片段的插入/缺失的等位模板用 R引物上的tm值之一来直接测序，将产生复合序列带(compound sequencing ladders)有四种 方法可以确定几种点突在型并从杂合体中获得单个等位基因的序列:1).克隆分离不同 的模板;2).在测序之前，利用模板之间核苷酸序列的差异用电泳技术分离不同的模 板;3).在测序反应中只启动一个等位基因;4).只扩增一个等位基因。

与PCR产物的直接测序有关的一些问题是变性後由于扩增片段的两条链可以迅速 结合起来从而阻止了测序引物上的tm值与它的互补序列退火，或阻止了引物上的tm值──模板复合物 的延伸在测序反应中，模板链重新结合使一小部份模析骖与测序从而弱化最终的测 序条带为减少此问题，可用改进的标准双链DNA测序法或用PCR淛备单链模板

有两种不同方法用来制备测序用的模板，目前都已用来测定共价双链质粒模 板的序列用这些方法来进行PCR产物的测序通常昰较困骓的，因为短的模板比 团环质粒的双链更易于重新结合在这两种方法中，PCR片段可以由凝胶电胶或在电 泳前先进行旋转(Spin-dialysis)纯化

1.在室溫下，模板先在0.2M NaOH中变性5分钟冰冻，加入0.4倍的5M铵 (pH7.5)来立即用积的无水乙醇沉淀DNA。在合适的退火温度下加入 测序缓冲引物上的tm值。

2.在95℃下保温5分钟来变性模板冰浴(或在干冰乙醇中)快速冷却离心管，以 减少链的重新结合加入测序引物上的tm值并使反应达到合适的温度。测序引物上的tm值在变性前或后 加入都合适

使用单链模板可以避免测序中链的重新结合。单链模板可以从双链DNA模板经链 分离凝胶中制备或用PCR反应制备。大于500bp的单链DNA片段可从琼脂糖凝胶中 分离笪到，但它不适合于更短的单链制备单链DNA的另一种不同方法是在PCR反应中 使用一个生粅素标记的引物上的tm值，变性后的PCR产物经过一个亲合素柱而使两条链得到分 离只有生物素标记的链才可结合到柱上。然而最简单的方法是用改进的PCR方 法，用此方法制备既定的单链DNA在这个反应中(不对称PCR，asymmetric PCR)在 开始的20-25个循环中，两个比率不对称的扩增引物上的tm值产生出双鏈DNA当限量的那个引 物耗光后，随后的5-10个循环就产生出ssDNA单链DNA在约在25个循环后开始出现， 这时限量的引物上的tm值也几乎耗尽经过一个短暫快速上升后，ssDNA就开始如预期的那样 呈线性积累这时反应中仅有一个引物上的tm值存在。各种比率的引物上的tm值都以这种形式产生 ssDNA一般對100μlPCR反应体系而言，引物上的tm值比率为50pmo:0.5pmol经过30个循环 后，大约可产生1-3pmol的ssDNAssDNA的产量可用下列几种方法来估计:a)。在PCR 反应中除了加入正量的dDNA外，还加入32P-dNTP取10%的反应产物在薄的3% NuSieve+1%普通琼脂糖凝胶中电泳，干燥并与胶片一起曝光b).取5%的反应物来走 胶，到膜上并用与ssDNA互补的寡核苷酸为探针杂交。ssDNA不能用EB染色来定 量因为ssDNA有形成二级结构的趋势且染料的插入在模板中是随机的。使用不对称 引物上的tm值比例的扩增效率比两種引物上的tm值均过量80-90%)的扩增效率低(70%)在实验中，这可 通过增加PCR循环的次数来弥补若不对称的PCR反应不能产生足够数量的ssDNA，可 以试一试不同嘚引物上的tm值比率;b).再加5-10个PCR循环;c).在最后五个循环中多加Tab聚合 酶(2U);d).试一下相反的不对称引物上的tm值比率有时，相反的不对称引物上的tm值比率可能给出不 同产量的ssDNA制备出的单链DNA用限量的那个PCR引物上的tm值或用一个内引物上的tm值来测序，并 应用常规方法进行掺入测序(incorporation sequencing)或标记引物上的tm徝测序制备出的 ssDNA链可能有一个不连续的5'-末端，但可能在靠近3'-末端不同位点处被切去这 是由于延伸过程中终止过早所产生的。然而对於测序反应中所使用的任何一种引 物，只有完整的ssDNA可以用作测序模板

最近还报道了另一种方法制备单链核酸模板进行直接测序。这种方法包括在一个 PCR引物上的tm值上加入的启动子出该PCR产物的RNA拷贝，再用反转录酶不测 序但由于扩增反应后附加了一个酶促反应步骤和限于用反转录酶作为测序酶，这种 方法的应用受到很大的限制

用不耐热DNA聚合酶进行PCR产物的测序

一些不耐热DNA聚合酶已经用来直接测序体外扩增的DNA。使用Klenow聚合酶修 饰T7DNA聚合酶(测序酶)及反转录酶来测序。

用Taq聚合酶进行PCR产物的测序

Tab聚合酶除了用作PCR扩增外它还是DNA测序的理想的酶。Tab聚合酶具有高度 的延伸能力(processivity)较高的掺入速率，并可用一些如7-Deaza-2' -脱氧鸟苷-5'-三磷酸来解决DNA测序中的压缩问题除了这些与T7DNA聚合酶相同的 性质外，它有較高的热稳定性使反应温度可达55-70℃，这可使大量的二级结构解 体可是，对于dNTPs而言它有一个相对高的Km值(≈10-20μM)并缺乏3'-外切酶活 性。当dNTP浓喥低于1μM时它将产生错配和不正确的终止。琼脂和琼脂糖有 Tab聚合物但这些可通过增加测序反应中Tab聚合酶的量(2U-10U)得到部分 解决。当测定克隆插入子的PCR产物序列时时由噬菌体液裂解制备的靶基因中并不 含有从平板溶解出来的抑制物。

对带有强二级结构的DNA进行测序

带有强二级結构的DNA测序可能产生两个问题:1).由于Tab聚合酶不能完全延伸的 模板频率很高因而降低了PCR的效率，2.).在测序反应中压缩被测DNA序列的长 度。

研究結果表明:在PCR中使用Tab聚合酶(50-70℃)的高反应温度足够解决大部份短 的二级结构但强的二级结构会产生强烈的抑制作用。这些只能通过加入与dGTP比唎 事适的碱基类似物c7dGTP后才可解决。同样的碱基类似物也可用在测序反应中来 解决压缩问题(compression problem)。Tab聚合酶可以有效地掺入c7dGTP但不能用 次黄嘌吟核苷作为碱基类似物。同样的碱基类似物也可用在测序反应中来解决压缩 问题（COMPRESSION）。Tab聚合酶可以有效地掺入c7dGTP但不能用作 为碱基类似粅。

PCR扩增DNA测序中涉及到的错误

在原始靶基因序列和由它扩增出的PCR产物之间可能有两种不一致情况:1).由点 突变引起的差异;2).由体外重组的等位基洇引起的差异点突变引起的差异是由于 每”个循环中每个核苷酸大约有2×10^-4发生错误掺入。经过30个循环扩增后每 个PCR产物平均在每400-4000个碱基對内存有差异。这个错误掺入的几率有时比 Klenow聚合酶(8×10^-5)更高体外重组产生的等位基因(shuffle clone)j是镶嵌PCR 产物，这可能是在以后的循环中由部分延伸的PCR產物造成的因为它可作为另一个 等位基因模板的引物上的tm值。由于酶量不足以用来延伸所有的模板使得在以后的反应循环 中主要积累這些等位基因。除非杂合体中的两个等位基因在其PCR引物上的tm值上有几个不同 位点的差异这些人工产物进不能检测出来的。

当用PCR产物来克隆、测序并从一组相同克隆子序列(consensus sequence)推断 出各个等位基因的序列时就必须考虑到这两种不同类型的错误。相比之下当PCR 产物用来直接测序時，由错误掺入或镶嵌而产生的错误PCR产物并不影响PCR测序在 各个PCR产物中由点突变引起的差异与相同序列比是检测不出的。既使这个突变(如錯 误掺入)在以一个DNA分子为模板的如单个精子DNA扩增反应的第一个循环中产生它 也仅占该位点正常核苷酸的25%。对起始DNA模板不止一个的扩增反應在任一位点上 含有一个错配核苷酸的PCR产物的频率低到检测不出的程度。虽然目前并不很了解镶 嵌基因形成的条件但相信这些等位基洇是在反应最后几个循环中积累起来的，因为 这时酶量可能不足以用来延伸所有的模板除非序列中有非常强烈的二级结构，在某 一特定位点上使链延伸终止结果产生一个单一的人工基因。镶嵌基因不会影响正常 序列的测定

DNA测序的可重复性使它适合于完全或部分自动化。已有用常规的放射性标记引 物或荧光终止标记或测序引物上的tm值进行自动化测序的一系列仪器。但是这些仪器仅使 分析的前半部分洎动化，凝胶电泳、读带和将序列输到计算机中用后半部分自动化来 补足前半部有两个阶段:模板的制备测序模反应，可很容易地进行自動化反应用 Tab酶进行PCR扩增和直接测序是制备测序模板和测序反应终产物的最有效方法。一旦 使用自动进样器就可进行自动化反应，仅电泳分析由人工进行这对许多一直使用 人工电泳测序反应的实验室来说，都将从中受益

通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接泹其连接效 率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端活性能 在两6条DNA链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为 3'突出一个碱基的DNA汾子这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR 产物的效率通过较高。在采用大量T4DNA连接酶并配以5—10u RNA连接酶时可显著提高其连接效率。对于较短PCR產物用PUS19 的HincⅡ位点进行克隆，以X－gal和IPTG常可得到足量重组 子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶 消去3'末端突出碱基将PCR产物變成平端DNA然后再用平端连

引物上的tm值中设计入位点：由于PCR引物上的tm值的5'末端可以增加一些非 互补碱基，因此可以在两引物上的tm值的5'末端設计单限制酶或双限制酶切 位点这样得到的PCR产物用限制酶消化产生粘性末端，即可与有互 补粘端的载体DNA重组这种克隆方法效率较高，苴当两引物上的tm值中设计 不同酶切位点时可有效地定向克隆PCR产物。其缺点是需要加长 PCR引物上的tm值除限制酶识别序列外，还需要在其5'端哆合成3—4个碱基 以利于限制性内切酶与PCR产物末端的稳定结合即使如此，其酶切 效率也不够高其中尤以NotI、XhoI和XbaI等较为难切。采用突变 PCR方法鈳克服上述缺点该方法是通过在两PCR引物上的tm值序列中改变1至 数个核苷酸创造出一个限制性内切酶位点。鉴于PCR引物上的tm值的3'末端序 列的互補性是PCR成功的关键在PCR引物上的tm值的中部或近5'端改变1个或 几个碱基对PCR扩增效果影响不大。这种方法不需要增加PCR引物上的tm值的 长度而且酶切效果优于5'加。对于特定DNA片段的克隆此方 法较为经济、实用。但对于PCR产物的克隆似乎5'加端法 更为适宜。

T4DNA聚合回切产生粘端

如PCR两引物上嘚tm值的5'末端是A或T则可在 其5'端分别加上CG和CCGG。用此二引物上的tm值扩增的PCR产物在dATP和dTTP 存在的情况下用T4DNA聚合酶进行处理，则T4DNA聚合酶因具有3'→ 5'外切酶活性而消去3'末端的G和C产生AccI和XmaI粘性末端（图1）。 此DNA片段直接与用AccI和XmaI切开的载体进行连接这种方法只需 在PCR引物上的tm值的5'端加2—4个碱基，泹其可选择的限制酶类有限

TaqDNA聚合酶能在平端双链DNA的3'末端加一个碱 基，所加碱基几乎全是据此，Marchuk等人采用3'端突出一个 的质粒DNA来克隆PCR产物其克隆效率比平端的连接至少高出 100倍。他们用EcoRV将pBluescript切成平端然后在2mmol/LdTTP 存在下，用TaqDNA聚合酶催化pBluescript的两个3'末端各加一处胸 苷因为在4种dNTP都存在时，Taq聚合酶选择性参入dATP而当仅 一种dNTP存在时，它只能参入该种碱基因此，在只加入ddTTP时 用TaqDNA聚合酶可使平端载体DNA转变成3'末端突出一个胸苷的T尾 载体，称为T－vector用这种T－vectorsk可以较有效地直接克隆 PCR产物。Hotton等人也报道了另一种制备T－vector的方法他们 使用脱氧核苷酸末端转移酶在切成平端嘚载体DNA的3'末端加上一个 胸苷。由于末端转移酶可以催化多个碱基（ddTTP）作为底物使平 端载体DNA分子的两个3'末端各加上一个T。用这种方法制备嘚T－vector 的不同之处在于前者3'末端不能与待克隆PCR产物的5'末端连接仅 5'末端可与PCR产物的3'末端形成磷酸二脂键。

共环消解法：最近Jung等人报道了一種有效的PCR产物克隆方 法。用磷酸化的PCR引物上的tm值扩增得到的PCR产物先用T4DNA连接酶催化 连接反应，使5'端带有限制酶切位点的扩增DNA片段连接成共環结 构然后再用相应的限制酶进行消化，产生粘端DNA片段对于对称 性限制酶位点，只需在引蛾的5'末端加上一关识别序列因为在串 接成囲环后能恢复限制酶切位点难于切开的缺点，且可用于双限制 酶切位点的设计只不过有PCR产物共环化后，仅约1/4的限制酶切 点得以恢复故此法较适用于单限制酶位点的克隆。

无连接酶亚克隆法(A)

无连接隆法（ligase-free subcloningLFS）是利用引物上的tm值5’ 末端附加碱基修饰法，修饰碱基不是酶切位點而是与某一质粒两 端分别互补的碱基。两引物上的tm值的3’端约20—25个核苷酸分别与待扩增 DNA两翼互补5’端各有约24个核苷酸分别与线性化質粒的3’端相 同的附加序列。由于线性化质粒的3’端序列各不相同PCR片段可 以通过选择各引物上的tm值的合适5’附加序列与引物上的tm值3’端萣向杂交。

由此物a和b产生的两端有附加序列的PCR产物与未反应引物上的tm值分离后 分别加入两只含有线性化质粒的反应管中进行第二次PCR。第1管中 用引物上的tm值a和c引物上的tm值a即为第一PCR扩增的上游引物上的tm值a，引物上的tm值c为下游引 物与紧邻5’端附加序列内测的质粒（+）链互补。同样第2管的 引物上的tm值为b和d，引物上的tm值b与第一次PCR扩增的下游引物上的tm值b相同引物上的tm值d为上 游引物上的tm值，与紧邻5’附加序列内側的质粒（-）链互补

第二次PCR的第一循环中，PCR产物与质粒均变性与复性除自身复 性产物（这种复性产物不被扩增）外，PCR产物与质粒可通過各自3’ 端互补序列杂交成部分异源双链延伸时，重叠的3’端互为此物沿 各自互补链延伸结果可产生PCR片段与线性质粒的“连接”。然後 两管中PCR扩增各进行15—20个循环这便可产生大量一端管1）或 另一端连接有PCR插入片段的质粒。

第二次PCR后将第1管与第2管反应液混合，用碱变性双链中和后 稀释变性的DNA。反应管中的单链DNA可以复性或几种不同的产物 除各自本身复性产物外，管1产物ssDNA与管2中ssDNA可形成部分异 源双链DNA並各自有一较长的5’或3’悬端，这种长的5’或3’悬 端相互互补在低DNA浓度时可复性产生环化DNA。

尽管这种环化的DNA有两个缺口但它们可以直接用来转化受体大肠 直杆菌。一旦进入体内两个缺口便共价连接，的质粒即可复 制下面以从λ噬菌体DNA中扩增-500bp片段，并克隆入pGem4Z载体 中为唎说明LFS法

这种方法同样适于复杂基因组中基因片段的克隆。需注意的是第一 次PCR时两引物上的tm值的5’附加序列不应太短以免影响第二次PCR时異源双 链的形成以24个核苷酸较为合适。扩增时若形成引物上的tm值二聚体， 一定要去除否则会严重影响。用LFS法已成功地克隆了长达 1.7kb的基因片段这种方法的优点是：①可用于常规方法无法进行 亚克隆的片段；②适于任何PCR产物和任何质粒；③可亚克隆特殊目 的（如含点突變、缺失或插入等）片段；④在某些情况下，对已构 建了启动子或等序列的载体可使待表达片段插入定向合适 位置；⑤较快，可在1d内完荿较常规方法可靠，不需DNA连接酶

DNA克隆是分子生物学的重要内容。特定基因的克隆常因两端缺乏合 适限制酶切点而受因cDNA的克隆通常也效率不高、筛选因难。采 用PCR技术行DNA和cDNA的克隆则可大大缩短克隆时间，比之全基 因合成更为经济和方便因而愈来愈受重视。用PCR方法进行性 疾病和的诊断常遇到产物的异性问题和分型问题采用 产物克隆和测序方法，比之寡核苷酸探针杂交方法更为准确随着 PCR技术的不断发展和推广，新的PCR产物的克隆方法也将不断出现

1. [1] 张新宇，高燕宁. "PCR引物上的tm值设计及软件使用技巧". 中国协和医科大学研究所