请结合谷氨酸的等电提取电解清实验及茚三酮比色测定谷氨酸含量谈谈自己的体会

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2019-05-27 11:03 标签： 腐蚀性药物分类

内容提示：茚三酮比色法检测饲料中赖氨酸含量的研究

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凡含有自由氨基的化合物如蛋皛质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物可用比色法进行测定。氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤第一步昰氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。

　　721型分光光度计　　　　　　 台天平

　　减压蒸馏器 　　　　　　　　　干燥

　　研钵 　　　　　　　　　　　　容量瓶

　　移液管　　　　　　　　　　　 烧杯

　　试管架　　　　　　　　　　　 试管

　　KCN－乙二醇甲醚－茚三酮溶液*：称取1.25g重结晶茚三酮溶于25ml经重蒸馏的乙二醇甲醚中使成5%溶液将2.5ml10mmol/L KCN溶液用乙二醇甲醚溶液稀释至125ml充分混合。然后将125mlKCN—乙二醇甲醚溶与25ml茚三酮－乙二醇甲醚溶液相混合置试剂瓶待用，正常情况下应为浅黄色

　　标准氨基酸溶液：称取亮氨酸20mg溶于10ml蒸馏水中，则得浓度为200μg/ml的母液

　　上述所有试剂必须放在草酸保护的干燥器中，以免被空气中的NH3所污染

　　乙二醇甲醚(CH3OCH2CH2OH, methyl cellusolve)的处理：将5g硫酸亚铁加在500g乙二醇甲醚中，振摇1─2小时过滤除去硫酸亚铁（若濾液混浊没有关系），再在蒸馏瓶中蒸馏收集沸点121─125℃部分，此时应为透明无色液体KCN－乙二醇甲醚－茚三酮溶液配制后必须隔夜才能應用。配制后1星期内稳定若超过1星期则灵敏度降低，不宜作定量

　　茚三酮重结晶：即使AR级的茚三酮，由于保管不当常带微红色，配成溶液后也带红色影响比色测定，故需重结晶一次方可应用5g茚三酮溶于15ml热蒸馏水中，加入0.25g活性炭轻轻摇动，若溶液太稠不易操作可酌量加水5─10ml，30分钟后用滤纸过滤滤液放冰箱中过液，次晨即见微黄色结晶出现过滤，再以1ml冷水洗涤结晶置于干燥器中干燥，最後装入棕色试剂瓶中保存

　　取标准氨基酸母液将其稀释成0.5、1.0、5、10、20、30、40、50μg/ml的一系列浓度。

　　取不同浓度的标准氨基酸溶液1ml加0.2mol/L柠檬酸缓冲溶液(pH5.0)1ml，充分混和然后加入1mlKCN－乙二醇甲醚－茚三酮溶液，充分混匀后在100℃沸水浴中加热15分钟取出立即加入3ml60%乙醇稀释之。然后冷卻在波长570nm进行比色，读取吸光度A570然后绘制A570－氨基酸浓度曲线，或进行直线回归求得相应的直线公式（参阅读实验86）

　　称取植物样品3g于研钵中加少量80%乙醇，研磨成匀浆移于100ml容量瓶中，用乙醇将残渣洗入瓶中最后定容至刻度。过滤取滤液20ml，在室温下减压蒸发干燥蒸发的最后阶段在表面皿上进行，得到固形物使用前用蒸馏水溶解，配制成每ml约含样品0.1g的稀释液

　　与上述制作标准曲线的方法相哃。1ml样品（氨基酸含量大约在0.5─50μg）1ml柠檬酸缓冲液，1mlKCN－乙二醇甲醚－茚三酮溶液在100℃水浴中加热15分钟，取出立即加入3ml60%乙醇稀释之冷卻后即进行比色测定，读取A570（脯氨酸则在440nm波长测定注意需另行绘制标准曲线）。此法对于一些小肽也可以测定在多肽合成中常用来检驗有无自由氨基的肽类存在。

　　茚三酮与氨基酸所生成的颜色在1小时内稳定因此加乙醇稀释后，应尽快进行测定如果读数超过标准曲线范围，可再加60%乙醇稀释之不使A570超过0.8为宜。

　　按下列公式计算植物样品中氨基酸含(μg/ml鲜重)

　　式中x为从标准曲线查得的氨基酸含量(μg/ml)。

　　V为20ml样品蒸干后最后的定容体积(ml)

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