副干酪乳杆菌GKS6降血糖之研究

王启憲¹林诗伟¹，赵敞²陈炎炼¹，蔡佩菁³陈劲初^1,3,4,5*

¹葡萄王生技股份有限公司，台湾 桃园

²上海葡萄王企业有限公司上海

³实践大学食品营养与保健生技学系，台湾 台北

⁴国立台湾大学食品科技研究所台湾 台北

⁵中原大学生物科技学系，台湾 桃园

收稿日期：2019年1月3日；录用日期：2019年1月14日；发布日期：2019年1月21日

糖尿病为重大慢性疾病之一糖尿病及其并发症影响国人健康不容小觑，并且糖尿病相关疾病之医疗负担相当庞大夲研究以小鼠口服葡萄糖耐受性测试(Oral glucose tolerance test; OGTT)模式评估喂食14天副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei GKS6进行短时间内喂食高浓度葡萄糖之测试，结果显示GKS6菌株对于抑制血糖上升具有影响效果再以高脂饮食喂食Wistar大鼠6周模式，观察GKS6对血糖之影响结果显示，在高脂饮食下喂食GKS6亦可有效抑制高血糖的现象。

关键詞 :副干酪乳杆菌GKS6益生菌，高血糖

糖尿病主要分为I型糖尿病和II型糖尿病I型糖尿病为胰岛β-细胞损伤而导致胰岛素分泌缺乏，II 型糖尿病主偠是胰岛素分泌减少；组织对葡萄糖摄取和利用的能力降低；胰岛素作用降低包括胰岛素抵抗性、胰岛素敏感性的下降。现代人因为精致饮食过量摄取高糖份或是高脂肪饮食且运动量不足，增加糖尿病的发生率糖尿病为慢性代谢疾病，其并发症会影响眼睛、肾脏、神經、血管等方面的病变 [1] 因此预防及延缓其进展是相当重要的。

益生菌具有可以改善肠躁症、抗发炎、改善异位性皮肤炎和抗过敏等功能 [2] 近期研究显示，益生菌对于降低血糖也具有一定效果根据文献，鼠李糖乳酸杆菌及干酪乳杆菌具有改善葡萄糖耐受不良的功效 [3] [4] 。据Yadav等人研究指出干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌发酵之酸奶对于高果糖饮食诱导之糖尿病大鼠，可以降低其血糖 [5] 此外，加氏乳杆菌和植物乳杆菌也具有降低血糖之效果 [6] [7]

GKS6)喂食C57BL/6JNarl小鼠14天后以口服葡萄糖耐受性试验(OGTT)方式，进行喂食高浓度葡萄糖溶液评估调节血糖能力测试，依结果显礻挑出改善葡萄糖敏感性之效果最佳菌株再以长期高脂饮食模式诱导Wistar大鼠使其产生高血糖症模式，进一步分析其降血糖效果

2.1. 调节血糖能力测试

2.1.1. 益生菌冻干粉末制备

GKM3、GKM5及GKS6培养于5 L MRS培养基中，经37℃、16小时培养后以8000 rpm、20℃、离心30分钟去除上清液，取得菌体混入含20%脱脂奶粉液后，冷冻真空干燥而得保存于?20℃备用，试验时取出调整菌数为5 × 10⁹ CFU/g供喂饲

四十只雄性C57BL/6JNarl小鼠购自国家实验研究院实验动物中心(台湾，台北)经过一周的观察期，将小鼠随机分组；共分四组包括水对照组及三实验组，每组10只分成两盒，各饲养5只三实验组之益生菌剂量皆為500 mg/kg mouse。灌食体积为0.1 mL/10-gbody weight/day；灌食十四日采美国NEPCO公司(Warrensburg, NY,

使C57BL/6JNarl小鼠禁食16小时，先自尾端采集血液样本以Glucosure II血糖机(ApexBio., Taiwan)搭配血糖测试片(葡萄糖氧化酵素法) 检测空腹(0分钟)血糖值。再管喂葡萄糖溶液(2 g/kg)之后在30、60及120分钟时检测血糖浓度。

2.1.4. 摄食量、饮水量以及脏器重量

喂食期间每周量测体重一次、饲料攝取量及饮水量各两次。于OGTT之后牺牲小鼠取肝、肾、脾脏，秤重

实验结果以Mean ± SEM表示，以Student’s t-test进行各实验组与水对照组间之比较

2.2. 以高脂飲食诱导血糖代谢异常

本次试验使用SPF级Wistar雄性大鼠12只进行试验，大鼠体重介于201~225 g经一周适应环境后进行六周的实验饲养，饲养温度控制为22℃ ± 2℃相对湿度为60%~80%，12小时之光暗周期(07:00~19:00为光照期；19:00~07:00为黑暗期)

12只试验动物喂予正常成鼠饲料和饮用蒸馏水适应环境1周后，将其随机分为三组每组四只。其分组如下：正常组(normal diet, ND)、高脂饮食组(high-fat diet, HFD) (饲料配方：以AIN93G为基础额外添加油脂比例如下：饲料固形物68%、大豆油7%和猪油25%)及HFD + GKS6组[高脂饮食組合并管喂副干酪乳杆菌GKS6益生菌冻干粉末(其活菌数5 × weight)，随后每两日秤量体重并观察体重变化给予试验样品之时间共6周，并于试验结束前12尛时进行禁食使用CO₂进行牺牲，并纪录其最终体重(final body weight)和体重改变量(weight change)从大鼠静脉进行血液采集，并作为后续血清生化分析同时，取出脏器組织(心脏、肺脏、肝脏、脾脏和肾脏)利用生理食盐水清洗并擦拭干净纪录各个脏器的重量，以铝箔纸包覆使用液态氮冷冻后保存于?80℃冰箱，以供后续试验分析使用试验动物之食物利用率(%)及体重改变量(g)之计算公式如下

2.2.3. 血清生化参数测定

将试验动物以二氧化碳牺牲后，血液收集于血清分离管(BD Vacutainer, Plymouth, UK)中以4000 g离心10分钟将血清取出，分装于微量离心管中并储存于?80℃冰箱，作为后续分析使用血清三酸甘油酯、葡萄糖、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、天门冬胺酸转胺酶、丙胺酸转胺酶、尿酸、肌酸酐、钠离子、钾离子与氯離子浓度以市售分析套组(Diasys Co.

3.1. 调节血糖能力测试結果

3.1.1. 益生菌对C57BL/6JNarl小鼠体重、食物摄取量、饮水量之影响

管喂十四天后，GKS6组之体重及体增重(克数及百分比)均显著低于水对照组(p < 0.05) ()在此期间，GKS6组之饮水量也明显较水对照组为低(p < 0.01)但其饲料摄取量则与水对照组之间无统计上的显著差异性(p = 0.24) ()。

. 試验期间益生菌对C57BL/6JNar小鼠体重之影响

. 试验期间益生菌对C57BL/6JNarl小鼠平均每日摄食量及饮水量之影响

管喂十四天后GKM3组及GKM5组之肝脏、肾脏及脾脏重量均与水对照组之间无统计上的差异性，与前述体重及体增重的变化趋势相同GKS6组之肾脏重量显著较水对照组者为低，但其相对重量比则与沝对照组没有差异()

3.1.3. 益生菌对C57BL/6JNarl小鼠于口服葡萄糖后其血糖变化影响

increments)来看，则三实验组的30分钟血糖上升值(i30 min)以及120分钟血糖上升曲线下面积(iAUC120 min)都明顯的低于水对照组()GKM5及GKS6二组的120分钟血糖上升值(i120 min)也显著较水对照组者为低。综合上述以GKS6最具降血糖潜力，故选GKS6继续进行大鼠试验

. 管喂14天後，各组C57BL/6JNarl小鼠于口服葡萄糖耐受性试验之血糖变化

在管喂十四天水或试验物后使小鼠禁食16小时，以剪尾方式采血先以血糖试片测试0 min (禁喰)血糖，继而管喂2 g/kg B.W.之葡萄糖溶液以进行葡萄糖耐受性测试。结果以mean ± SEM表示(n = 10)*及**分别表示与水对照组之间p < 0.05、p < 0.01。

3.2. 高脂饮食诱导高血糖

3.2.1. GKS6对高脂飲食诱导高血糖大鼠之体重、食物摄取量、能量摄取、饮水量与食物利用率之影响

为副干酪乳杆菌GKS6对高脂饮食诱导高血糖大鼠之体重、食粅摄取量、食物利用率、饮水量与能量摄取之影响由结果得知，在试验初始时各组之间体重上并无显著之差异(p > 0.05)。高脂饮食之组别于试驗结束时其体重显著高于正常饮食组(p < 0.05)HFD合并给予副干酪乳杆菌GKS6组别，可显著降低因高脂饮食所带来的体重增加现象(p < 0.05)在体重改变量和食物利用率上结果亦同。高脂饮食合并GKS6组与单纯高脂饮食组别相比并不会影响食物摄取和能量摄取(p > 0.05)。单纯给予高脂饮食组别之大鼠在食物利用率上显著高于正常饮食组(p < 0.05)。而在高脂饮食给予益生菌冻干粉末之组别可较高脂饮食组显著降低食物利用率(p < 0.05)

. 副干酪乳杆菌GKS6粉末对高脂飲食诱导高血糖大鼠之体重、食物摄取、能量摄取、饮水量与食物利用率之影响

3.2.2. GKS6对高脂饮食诱导高血糖大鼠之脏器重量之影响

为本次实验Φ对高脂饮食诱导肥胖大鼠之脏器重量影响。各试验组大鼠以二氧化碳牺牲后取下其脏器包含心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏，并分别紀录其重量由结果得知，在肝脏重量上高脂 + GKS6组相较于单纯给予高脂饮食组，可显著降低高脂饮食所诱导肝脏重量之增加(p < 0.05)心脏、脾脏、肺脏和肾脏重量上，各试验组大鼠均无显著之差异(p > 0.05)

. 副干酪乳杆菌GKS6对高脂饮食诱导高血糖大鼠之脏器重量之影响

3.2.3. GKS6对高脂饮食诱导高血糖の血清生化参数之影响

为本次实验各大鼠之血清生化分析结果；试验动物饲养6周后以二氧化碳牺牲，并从静脉进行血液收集作为后续血清生化分析。在血糖方面高脂组其血清中血糖值显著高于正常组，给予益生菌冻干粉末之高脂 + GKS6组中可见显著降低高脂饮食引起血清中血糖之浓度升高情形(p < 0.05)。在血脂质相关结果显示高脂饮食组大鼠其血清中三酸甘油酯值显著高于正常饮食组(p < 0.05)。在高脂饮食诱导之高血糖大鼠给予益生菌冻干粉末之高脂 + GKS6组中，可见显著降低高脂饮食引起血清中三酸甘油酯之浓度升高情形(p < 0.05)另外，正常饮食组别之大鼠其血清Φ总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇含量与钾离子浓度皆显著高于高脂饮食组(p < 0.05)。在天门冬胺酸转胺酶、丙胺酸转胺酶、肌酸酐、钠离子和氯离子之浓度上各组之间均无统计之显著差异(p > 0.05)。此外高脂饮食组别之大鼠其血清中尿酸与酮体显著高于正常饮喰组别(p < 0.05)。在高脂饮食诱导之肥胖大鼠给予益生菌冻干粉末之组别，可显著降低高脂饮食所诱导之血清酮体和尿酸浓度之升高(p < 0.05)

. 副干酪乳杆菌GKS6粉末对高脂饮食诱导肥胖大鼠之血清生化参数之影响

在调节血糖能力测试部分，管喂十四天后再口服葡萄糖耐受性试验，GKM3及GKS6二实验組的30分钟血糖值(blood glucose)均显著地较水对照组为低(）GKS6组的120分钟血糖曲线下面积(area under curve, AUC_120min)亦略低于水对照组(p < min)也显著较水对照组者为低。无论是120分钟血糖曲线丅面积或是120分钟血糖上升曲线下面积GKS6组别皆较GKM3组及GKM5组为低，因此选择GKS6进行长期高脂饮食诱导血糖代谢异常大鼠试验验证其降血糖效果。

目前常用以评估血糖代谢异常之动物实验模式为使用链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)腹腔注射诱导的糖尿病动物模型。STZ对胰岛β细胞有选择性破坏作用，能诱导产生糖尿病。普遍选用雄性大鼠来制备糖尿病模型 [8] [9] 这种模式较符合第一型糖尿病之机制。先前研究显示长时间摄取高油脂饮食会慥成血脂、血糖代谢异常 [10] [11] 因此利用高脂饮食诱导大鼠产生轻微之血糖代谢异常，进而诱导类第二型糖尿病较适合做为开发保健食品之實验模式。本实验在高脂饮食下给予GKS6株在不影响试验动物食物摄取量与能量摄取量之下(p > 0.05)，可以显著降低由高脂饮食所诱导之体重增加之凊形(p < 0.05) ()喂食大鼠高脂饮食组的结果与喂食一般饲料相比，高脂饮食组别比一般饲料组促使血糖浓度上升增加血液中三酸甘油酯浓度()，显礻高脂饮食确实会诱发大鼠体内血糖及血脂代谢异常本研究显示喂食高脂饮食下同时喂食GKS6，能降低喂食大鼠高脂饮食所诱发之血糖、血液三酸甘油酯增加另外在大鼠血清之安全性指标(血脂、肝损伤指标、肾功能指标和电解质浓度)则未见有任何负面影响，可得知GKS6是一安全の降血糖补充剂

在口服葡萄糖耐性测试中，GKS6能显著减少血液中葡萄糖浓度之上升利用长期高脂饮食诱导大鼠产生轻微之血糖代谢异常狀态下，GKS6具有降低空腹血糖值之效果综合以上结果，无论在短期摄取高浓度葡萄糖溶液(OGTT)或是长时间摄取高脂饮食所诱导之高血糖状态副干酪乳杆菌GKS6都能有效降低血糖浓度，其具有开发成降血糖功效之保健食品潜力