O D 2 6 0/O D 2 8 0和琼脂糖凝胶电泳都能检测样品是否混有RNA,为什么大家都用电泳法哪种方法灵敏度高?
熟练掌握分光光度法检测
链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收其吸收峰在
不仅与总含量有关,也随构型而有差异
对标准样品来说,浓度为
样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时会影响
一般情况下同时检测同一样品的
计算其比值来衡量样品的纯度。
时表明有蛋白质或酚污染;>
的比值用於估计核酸的纯度
说明去盐不充分可以再次沉淀和
器材:移液器;石英比色皿;紫外分光光度计等。
、紫外分光光度计开机预热
、用重蒸水洗涤比色皿吸水纸吸干,加入
缓冲液后放入样品室的
、将标准样品和待测样品适当稀释(
、把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的
、设定紫外光波长,分别测定
、计算待测样品的浓度与纯度
有蛋白质的话比值下降小于1.8就认为有较多的蛋白了。
但是这实际并不是定量的
关系比值受试剂、样品的影响,特别是样品中如果蛋白质对这个波段有吸收峰(实际上经常有)或者有较多的游离碱基误差就一塌糊涂了。所以这个方法和电泳一样只能作为定性处理说白了只能判断比值高的就是核酸多,比值低的就是蛋白多RNA多不多参考一下是否大于2.0。所以个人经验认为DNA粗提物去测吸光度是殺鸡用牛刀外加不靠谱。
至于电泳只能检测DNA的情况,RNA因为很难和EB结合所以无法显示。也就是无法判断RNA的含量DNA含量也是根据上样量囷条带亮度根据经验来判断。
用什么方法要看有什么要求在满足要求的前提下什么方法简单方便用什么方法。不是说什么方法精确就用什么方法比如你不过是跑个PCR,何必去检测RNA浓度呢跑个电泳不就行了么,也省的你洗比色皿电泳的时候还能上网灌灌水,何乐而不为要是我,我连RNase都懒得加对PCR又多大影响,浪费这个钱做什么呢
如果你的样品需要非常纯净,那就需要去测OD而且是应该先进行纯化后洅去测OD,样品比较纯净的时候吸光度法才比较靠谱说白了就是检验一下纯化是否成功。
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