本发明涉及一种利用电子射线和/或x射线辐照哺乳动物细胞群的方法，其中所述细胞群包含至少一种目标哺乳动物细胞，其特征在于：i)利用电子射线和/或x射线对包含哺乳动物细胞群的组合物进行体外辐照，其中所述哺乳动物细胞群包含至少一种目标哺乳动物细胞，并且剂量率在5gy/秒至107gy/秒的范围内；ii)可选地从哺乳动物细胞群中分离或富集存活的目标哺乳动物细胞，以及可由此获得的药剂及其应用。
细胞疗法可用于治疗各种各样的疾病。当前特别有前景的是细胞疗法在癌症治疗领域中的研究水平和临床应用(melief等人，2011)。
然而，过去使用该治疗组时出现了一系列问题。一方面，在获取治疗细胞时，通常依赖于供体细胞，而供体细胞必须以足够的数量和满足临床需求的方式获得。患者自身的所谓自体制剂，特别是在经过术前治疗的癌症患者中，其潜在疗效有时会受到严重限制。
一种替代方法是，例如使用原发性肿瘤提取或通过病毒处理而永生化的细胞系。这样的细胞系可以以期望的数量生产，因此也适合作为“货架”产品。特别是符合自然杀伤细胞(nk细胞)特性的细胞系，已在临床中用于治疗肿瘤(carotta2016，suck等人2016)。
尤其令人感兴趣的是细胞系nk-92和khyg-1的治疗用途。这些细胞最初是淋巴瘤或白血病细胞，在90年代提取自患者，并进行持续培养(klingemann等人，1996；yagita等人，2000)。这两种细胞系均具有与nk细胞相符的特征，可以被例如白介素(il)-2激活并且对各种肿瘤实体具有优异的细胞毒性。
此外，此类产品和其他细胞产品在患者身上的应用，要受制于严格的安全要求。由于原则上它们是癌细胞，因此在给药前必须限制其生长。此外，在应用其他细胞治疗时，无阻碍的增殖也伴随着严重的副作用，例如，提到的致癌可能性，和免疫毒性作用。这些副作用应被严格避免。
因此，目前许多细胞治疗产品，特别是那些源于癌细胞系的细胞治疗产品，被伽马射线辐照灭活(tam等人，1999)。
这种类型的辐照完全抑制细胞生长，并最终在一定时间(通常为几天)之后导致经这种方式处理的细胞的死亡。此外，特别是已知伽马射线对其功能性效果(例如nk细胞的抗肿瘤细胞毒性活性)有负面影响(图1)。
例如，在使用前被伽马射线灭活的细胞治疗产品的当前示例如下：
(b)例如在制备原代nk细胞产品时，辐照所谓的“饲养”细胞，即用于培养实际治疗性细胞产品的细胞系(fujisaki等人，2009)
(c)在生产基于树突状细胞(dc)的所谓细胞疫苗的背景下，体外辐照肿瘤细胞(vandenberk等人，2016)
(d)辐照其他细胞产品，例如间充质基质细胞，以防止在细胞免疫抑制治疗的情况下的非定向增殖或免疫毒性扩增(deandrade、anavaleriagouveia等人，2014)。
所有这些细胞产品通常被体外辐射，即在病人身上以及身体之外使用之前，用通常约为10至50gy，典型的为30gy的高最终致命剂量的伽马射线辐照。
由这种现有技术方法而引起的极为重要的问题在于，由于这种不可避免的辐射而使细胞治疗药剂伴随有明显的功效丧失。
例如，这种经伽马射线辐照的nk-92细胞丧失至少50％的细胞毒性能力(tam等人，1999)。
同时也制备基因修饰的且被优化以用于肿瘤治疗的nk细胞系，然而所述nk细胞系与未改变的nk细胞相比表现为辐射敏感性更高。
在此，一方面，功能丧失通常可归因于漫长的辐照时间，这对于获得更高的剂量来说是必需的，然而也可归因于伽马辐射相关效应的积累，例如不期望的效应分子的氧化。
另外，细胞产品的伽马辐射的技术实现有时会是一个问题，因为它需要严格的屏蔽和安全措施，并且衰减辐射通常在技术上更难于控制(woa1)。
现有技术中描述了采用电子射线设备来对固体和液体进行消毒。此外还公开了电子射线的应用与基于辐照病毒颗粒的疫苗制备的关系(us8，173，139b1；woa1)。
因此，需要控制上安全且易于操作的方法，该方法用于制备适于施用于个体的细胞药剂，或者用于制备细胞药剂，其本身适于制备施用于个体的细胞药剂，其中该方法使得可以以被辐照细胞的尽可能大的比例获得被辐照细胞的活性和生物活性，尤其是在辐照后的较长时间内，例如辐照后的1天至7天内。
现有的技术问题可通过本发明的方法来克服：
因此，本发明在一个实施方式中涉及一种利用电子射线和/或x射线辐照哺乳动物细胞群的方法，其中所述细胞群包含至少一种目标哺乳动物细胞，其特征在于：
i)利用电子射线和/或x射线对包含哺乳动物细胞群的组合物进行体外辐照，其中哺乳动物细胞群包含至少一种目标哺乳动物细胞，并且其中剂量率在5gy/秒至107gy/秒的范围内；
ii)可选地从哺乳动物细胞群中分离或富集存活的目标哺乳动物细胞。
因此，本发明在另一实施方式中，涉及一种用于制备药剂的方法，所述药剂包含至少一种经处理的存活的目标哺乳动物细胞，所述药剂适合施用于个体，和/或一种用于制备经处理的存活的目标哺乳动物细胞的方法，其中所述目标哺乳动物细胞适于制备施用于个体的细胞药剂，本方法的特征在于：
i)利用电子射线和/或x射线对包含哺乳动物细胞群的组合物进行体外辐照，其中，所述哺乳动物细胞群包含至少一种目标哺乳动物细胞，并且其中剂量率在5gy/秒至107gy/秒的范围内；
ii)可选地从哺乳动物细胞群中分离或富集存活的目标哺乳动物细胞。
如今，令人惊讶地发现，通过以依据本发明的高剂量率，用电子射线和/或x光辐照包含至少一种目标哺乳动物细胞的哺乳动物细胞群，可降低，例如完全抑制目标哺乳动物细胞的增殖能力，而同时所述细胞是存活的：分别在相同的辐照剂量下，与常规的以较低剂量率的x射线或γ射线辐照的细胞相比，令人意外地，本发明的被辐照的细胞群在辐照后的较长时间内具有在被辐照的细胞群中更高比例的存活的细胞。尤其是，与常规被辐照的细胞相比，细胞在经历依据本发明的辐照后可以具有更高的期望生物活性，例如细胞毒性。
因此，通过实施例和附图2至12证明，在相同的剂量下，就细胞的活性以及期望的细胞毒性的生物活性而言，依照本发明的用高剂量率的电子射线辐射进行的辐照比常规的用低剂量的伽马射线或x射线辐射的辐照效果更佳。
在现有技术已知的常规的用伽马射线或x射线辐照的方法中，使用低剂量率；即在更长的时间内使用一定剂量。
电子射线辐照和x射线辐照的另一个优点(尤其是与伽马射线辐照相比)在于近患者(“床侧”)应用和/或“高通量”应用的潜力：由于需要相对较低的屏蔽，因此可以在医院的常规放射单位中分散地实施依据本发明的辐照方法。这样可以节省路程和时间。
除此之外，还避免了电离大气层对伽玛射线的长期氧化效应，这也可能对被辐射的生物(尤其是细胞)成分的功能性产生负面影响。而在电子射线设备或x射线设备中依照本发明的5gy/秒至107gy/秒范围内的高剂量率的短时间的剂量激增，由于治疗时间短(例如，毫秒范围)而可排除此类副作用。
因此，与基于放射性核素衰变的伽马辐射器相比，使用电子射线和/或x射线具有以下优势：所需高剂量率的更精确的可控制性，以及降低此类设备的操作者和环境的安全风险。
在本发明的方法中，哺乳动物细胞被辐照。哺乳动物细胞可以是任何哺乳动物的细胞，例如人、猪、牛、马、狗、猫、绵羊、猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠或兔子。在特别优选的实施例中，哺乳动物是猴子或人类，最优选的是人类。哺乳动物细胞可以是直接取自哺乳动物的细胞，原代细胞，培养的哺乳动物细胞或基因修饰的哺乳动物细胞，例如哺乳动物细胞的细胞系。这种细胞系的优选实施例是永生化细胞系，例如在实施例中使用的永生化癌细胞系。
哺乳动物细胞可以是来自哺乳动物不同部位的细胞，并且可以是血细胞、pbmc细胞、血浆细胞、肿瘤细胞、健康或患病组织的细胞，器官细胞如肝细胞、肾细胞、脾细胞、胰腺细胞、造血干细胞、来自体液(例如尿液，唾液或脑脊液)的细胞，和/或预备用于移植的细胞。
优选地，干细胞不是人类胚胎干细胞，和/或哺乳动物细胞群优选不包含人类胚胎干细胞。
在本方法中，哺乳动物细胞群被辐照。所述哺乳动物细胞群包含至少两个细胞，优选包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、102、103、104、105、106、107、108或者109个细胞，例如102至109个细胞、103至108个细胞、104至108个细胞、或105至107或108至109个细胞。
所述哺乳动物细胞群包含至少一种目标哺乳动物细胞。所述目标哺乳动物细胞是在经过辐射后增殖能力降低，同时在辐照后1天至7天内保持目标哺乳动物细胞的活性的哺乳动物细胞，优选地，在辐照后1天至7天获得目标哺乳动物细胞的生物活性。优选地，在辐射后3天，被辐照的目标哺乳动物细胞至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％存活，和/或在辐照后3天，目标哺乳动物细胞的生物活性至少是在其他相同条件下未受辐照的相同哺乳动物细胞的生物活性的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。其中哺乳动物细胞群可由目标哺乳动物细胞组成，或者哺乳动物细胞群包含至少一种目标哺乳动物细胞和一种或多种其他哺乳动物细胞。
例如，可以辐照作为目标哺乳动物细胞的、培养的永生化哺乳动物细胞系或肿瘤细胞。在该实施方式中，哺乳动物细胞群可以由目标哺乳动物细胞组成。在该实施方式中，哺乳动物细胞群不包含或基本上不包含其他哺乳动物细胞。
除目标哺乳动物细胞外还包含一种或多种其他哺乳动物细胞的哺乳动物细胞群可以是，例如，包含多种细胞类型的移植物，诸如造血干细胞移植物，或2、3种或者更多不同细胞类型的哺乳动物细胞的共培养物。例如，饲养细胞可包含在有饲养细胞和目标哺乳动物细胞(例如肿瘤细胞)的共培养物中。
因此，在一个优选的实施方式中，本发明的方法的特征在于：所述哺乳动物细胞群由目标哺乳动物细胞组成，或基本上由目标哺乳动物细胞组成。
在另一优选的实施方式中，本发明的方法的特征在于：所述哺乳动物细胞群包含至少一种目标哺乳动物细胞，以及一个或多个其他的哺乳动物细胞。
在另一优选的实施方式中，本发明的方法的特征在于：所述哺乳动物细胞群包括至少两种不同的原代哺乳动物细胞的混合物，尤其是所述哺乳动物细胞群是细胞移植物，或者免疫细胞或体液的混合物。
原代哺乳动物细胞是取自哺乳动物并保留其表型特性的哺乳动物细胞。永生化细胞不是哺乳动物的原代细胞。
例如，免疫细胞的混合物可以是包含以下一种或多种细胞的组合物：t细胞、特别是treg细胞、cd4+细胞或cd8+t细胞、nk细胞、b细胞或dc细胞。
体液可以是例如血液、血浆、全血、尿液、储存液或脑脊髓液。
例如，细胞移植物可以是造血干细胞移植物。此外，细胞移植物可以是同种异体的或自体的。
在另一优选的实施方式中，根据本发明的方法的特征在于：所述哺乳动物细胞群包含一个或多个细胞系，或由一个或多个细胞系组成。
在另一优选的实施方式中，根据本发明的方法的特征在于，所述目标哺乳动物细胞是正在增殖、过度增殖或永生化的目标哺乳动物细胞，特别是其中所述目标哺乳动物细胞是癌细胞、癌细胞系和/或免疫细胞，尤其是所述细胞系是一种自然杀伤细胞系、t细胞系或基因修饰的细胞系，和/或免疫细胞是自然杀伤(nk)细胞、t细胞或基因修饰的免疫细胞。
特别是，这些细胞需要减少增殖的能力，如果可能的话，减少100％，以避免体内不定向的增殖和/或免疫毒性作用。同时，重要的是，在辐照后保持存活更长时间，以便细胞可以产生所期望的治疗、预防或美容效果。
然后，可以将被辐照的哺乳动物细胞系，例如在实施方式中使用的nk细胞系，用于癌症治疗，因为通过辐照减少了有害的、无抑制的增殖，同时在辐照后，更长时间地保持存活。
同样，该方法可以应用于作为目标哺乳动物细胞的所谓的“饲养细胞”。“饲养细胞”是用于培养实际治疗细胞产品的细胞系，例如在原代nk细胞产品的生产中。
根据本发明，还可以辐照在离体治疗后在基于树突细胞(dc)的所谓细胞疫苗生产中使用的肿瘤细胞。
然而，也可以辐照其他细胞药剂，例如作为目标哺乳动物细胞的间充质基质细胞。也可在根据本发明的能够避免体内无向增殖和免疫病毒性扩展的辐照后，在细胞免疫抑制治疗的背景下采用此类间充质基质细胞。
如果除了目标哺乳动物细胞之外，种群中还存在一个或多个其他哺乳动物细胞，那么也可以通过辐照，改变种群中一个或多个其他哺乳动物细胞的增殖能力，尤其是可以减弱其增殖能力，对于至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的哺乳动物细胞来说，在辐照后优选保持存活1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。优选地，降低一个或多个其他哺乳动物细胞的增殖能力，同时对于至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的细胞来说，在辐照后优选保持存活1天、2天、3天、4天、5天、6天或者7天，然而，这并非强制性要求。这种差异可能是由于不同细胞对辐射的敏感性不同所致。
在本发明的实施方式中，用于制备包含至少一种经处理的存活的目标哺乳动物细胞药剂的方法，其中所述药剂适于施用于个体，和/或一种用于制备经处理的存活的目标哺乳动物细胞的方法，其中这些目标哺乳动物细胞适于制备施用于个体的细胞药剂。
例如，可以根据本发明辐照永生化的细胞系。可以将包含根据本发明辐照的细胞系的存活的细胞组合物作为药剂施用于个体以进行肿瘤治疗。包含依据本发明进行辐照的细胞系的、增殖能力降低的、存活的细胞的药剂适于施用于个体，优选地，存活细胞的增殖能力降低100％。相反，如果药剂导致个体死亡或者疾病而没有有效的治疗效果，则不适于施用于个体。如果药剂适合于为治疗、预防、诊断或美容目的而施用于个体，则该药剂适合施用于个体，特别是人。
例如，可以根据本发明辐照饲养细胞。包含根据本发明辐照的存活的饲养细胞组合物可用于制备向个体施用的细胞药剂。该实施方式中的细胞药剂可以是细胞系的细胞群。“饲养细胞”可以用于培养细胞药剂，例如，在原代nk细胞产品的生产中。在该实施方式中，nk细胞产品适于并预备施用于个体。
细胞药剂是包含至少一种活细胞的组合物，优选包含至少一种活细胞的药物或化妆品组合物，更优选包含至少一种活细胞的药物组合物。
施用于个体的细胞药剂，优选为无菌的和/或不含致热原。
个体是哺乳动物，优选是人类。
在本发明方法的步骤(ii)中，可选地，从哺乳动物细胞群中分离或富集存活的目标哺乳动物细胞。
例如，如有需要，可以在步骤(i)中辐照之后，在施用于个体前，例如通过免疫学方法，如单采血液分离术或离心，过滤或洗涤，分离或富集目标哺乳动物细胞。
本发明的方法要在使用合适的电子射线和/或x射线发生装置的情况下离体进行。这样的设备在现有领域中是已知的。
优选地，根据本发明的方法使用产生电子射线的装置来进行，该装置连续地或快速地进行脉冲运作。
在另一优选的实施方式中，根据本发明的方法利用产生电子射线的装置来进行，该装置根据冷阴极原理或热阴极原理提供电子。
在另一优选实施方式中，根据本发明的方法是利用产生电子射线的装置来实施的，该装置被设计为轴向辐射器(扫描器)或线性宽带辐射器。
在根据本发明的方法的另一优选实施方式中，组合物被静态地收纳于装置中或被连续地传输通过电子射线或x射线束。
优选地，使用产生x射线的装置来实施根据本发明的方法，该装置通过特殊的目标物布置和具有高功率密度的高频偏转的电子射线来提供根据本发明的高剂量率。此类用于电子射线的产生和高频偏转的装置在现有技术领域中是已知的。
以5gy/秒至107gy/秒的剂量率实施本发明的方法。令人惊讶地发现，在这种高剂量率时，对细胞的损害，特别是对细胞的继发损害最小。因此，与常规辐照的哺乳动物细胞相比，用本发明的方法辐照的目标哺乳动物细胞在更长的时间内是存活的，同时目标哺乳动物细胞的增殖能力会被降低(见图2至12)。此外，与常规辐照的哺乳动物细胞相比，通过本发明的方法辐照的目标哺乳动物细胞，优选地在辐照后的较长时间内具有更高的生物活性。在nk细胞的情况下，生物活性优选地是针对肿瘤细胞的细胞毒性。如实施例和图2至12所示，用本发明的方法成功辐照了nk细胞。
剂量率(剂量/时间)可以由技术人员适当地调整。通常认为，就特定的所需施加剂量而言，高束流需要很少的辐照时间，而很少束流需要很长的辐照时间。剂量率将由专业技术人员在考虑例如以下因素的条件下进行调节：例如在组合物被连续传输的情况下，考虑介质的流速以及取决于束类型的束流范围。通过高剂量率，即使在短的辐照时间内也可以在组合物中获得高的施用剂量。
根据本发明的方法，(i)用电子射线，(ii)用电子射线和x射线，或(iii)用x射线，在本发明的5gy/秒至107gy/秒范围内的剂量率来执行辐照。
在一个优选的实施方式中，以本发明的在5gy/秒至107gy/秒范围内的剂量率，用x射线实施该方法。
在本发明的另一特别优选的实施方式中，以根据本发明的剂量率用电子射线，或以根据本发明的剂量率用电子射线和x射线进行辐照，更优选以根据本发明的剂量率用电子射线辐照。其中应该注意的是，在利用电子射线辐照时，在射线的入射点处，还产生x射线辐射。因此，当用电子射线辐照时，也用x射线辐照。但是，在用根据本发明的电子射线辐照的情况下，x射线的剂量率将明显更低，大约在千分比的范围内。
如果打算以根据本发明的剂量率用电子射线和x射线辐照，则可以用电子射线和x射线以任何顺序依次实施根据本发明的方法步骤。在另一实施方式中，可以使用一种产生电子射线的装置，该装置在除了电子射线之外还以本发明的剂量率发射x射线。
如果通过现有技术中描述的确定细胞存活情况的方法可以确定细胞是存活的话，哺乳动物细胞在当前细胞中则是“存活的”。这样的方法在现有技术领域中是众所周知的，并且包括基于扩散的方法和基于电阻测量的方法。在一个优选的实施方式中，在穿孔的细胞膜上使用基于扩散的方法来确定其存活。基于穿孔细胞膜扩散的方法在现有技术领域中是众所周知的，并且包括穿孔染料，例如台盼蓝、亮蓝色fcf、结晶紫和dna嵌入荧光染料、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidin-2-phenylindol，dapi)、溴化乙锭或碘化丙啶。这些穿孔染料可以侵入穿孔的细胞膜进入活力受限的细胞。相反，活细胞几乎不被染色。染色后的活细胞计数可以例如通过显微镜，利用流式细胞仪通过台盼蓝染色和/或通过碘化丙啶染色进行，并且可以手动进行或在照相机辅助和/或计算机辅助下进行。在一个特别优选的实施方式中，使用台盼蓝染色来确定哺乳动物细胞的存活情况，如实施方式中所述的那样。
增殖能力降低，特别是降低了100％的活性细胞将在一段时间后死亡。因此，优选地在辐照后1天至7天内，特别是在辐照后2天或3天至7天内确定辐照后活细胞的存在。例如，可以在辐照后2天、3天、4天、5天、6天或7天测定细胞的存活。
在本发明的一个优选实施方案中，辐照后的1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的被辐照的目标哺乳动物细胞为存活的，更优选地在辐照后3天，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的被辐照的目标哺乳动物细胞是存活的。
在另一优选实施方式中，根据本发明的方法的特征在于：所述哺乳动物细胞群或目标哺乳动物细胞在辐照后适于施用于个体，和/或适于制备施用于个体的细胞药剂。
在另一优选的实施方式中，根据本发明的方法的特征在于：哺乳动物细胞群或目标哺乳动物细胞在辐照后适于以治疗、预防或美容目的施用于个体，和/或适合制备施用于个体的细胞治疗、预防或美容药剂。
特别是，辐照后目标哺乳动物细胞的增殖能力降低，并且辐照后1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的目标哺乳动物保持存活。
根据哺乳动物细胞群和目标哺乳动物细胞的类型，细胞适于并预备用于个体的治疗、预防和/或美容性施用。
在疫苗方面，例如在过度增生性疾病或癌症的领域中，这些细胞适于对个体进行治疗性和/或预防性施用，以用于预防或治疗癌症或过度增生性疾病。
在诸如造血干细胞制剂的移植物方面，这些细胞适于治疗性地施用于个体，用于预防或治疗需要移植的疾病，例如针对白血病的造血干细胞制剂。
在免疫细胞方面，所述细胞适于对个体进行治疗和/或预防性施用，根据免疫细胞不同，可以用于预防或治疗例如过度增殖性疾病，癌症，免疫疾病或慢性退行性疾病。
在一个特别优选的实施方式中，哺乳动物细胞或目标哺乳动物细胞群适于施用于个体，以治疗和/或预防过度增殖性疾病，免疫疾病或慢性退行性疾病，和/或该药剂包含至少一种经处理的活性哺乳动物细胞、移植物(特别是造血干细胞移植物)、疫苗、细胞毒剂或单采产品。
在另一优选的实施方式中，根据本发明的方法的特征在于：剂量在0.1gy至1kgy的范围内，优选在1gy至100gy的范围内。
在另一优选的实施方式中，根据本发明的方法的特征在于：剂量率在10gy/秒至104gy/秒的范围内，特别是在50gy/秒至103gy/秒的范围内，例如在10gy/秒至103的范围内，或50gy/秒至103gy/秒范围内。
如上所述，短时间的剂量激增是有利的。
在另一优选的实施方式中，根据本发明的方法的特征在于：辐照时间在0.1毫秒至10秒的范围内，特别优选地，辐照时间在10毫秒至8秒的范围内。更优选地，辐照时间在0.1毫秒与1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒之间，或者在0.5毫秒与1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒之间。
在另一优选的实施方式中，根据本发明的方法的特征在于：在步骤(i)中辐照时，所述包含哺乳动物细胞群的组合物以薄层形式存在。
如果相对于辐照时辐射的射入深度组合物为薄的，特别是，其中在辐照期间穿过组合物的束流路径的长度小于5cm，那么组合物是以薄层形式存在的。
辐照薄层形式的组合物，可以令组合物中的哺乳动物细胞基本均匀地被辐照。
薄层形式的组合物可以在辐照时，例如在固体载体上，以薄的液体射流形式存在，或以气雾剂(例如气雾剂颗粒)形式存在。
在一个优选的实施方式中，组合物在辐照时位于固体载体上。固体载体优选包括平坦的表面或基本平坦的表面，其中组合物施加在所述表面上。例如，固体载体可以是平坦的表面或基本上平坦的表面，或者可以包含具有平坦的表面或基本上平坦的表面的空腔。固定载体可以是柔性的，例如薄膜，或者可以不是柔性的，例如板或阵列。
固体载体可以是与期望的哺乳动物细胞和目标哺乳动物细胞的群体相容并且基本无毒的任何载体，优选地是基本上耐辐射的。如果在辐照期间，没有发生有害的辐射分解产物从被辐照的载体向组合物的迁移，则该载体是耐辐射的。例如，可以考虑塑料膜，例如聚丙烯膜、pe膜或pvc膜、塑料板和塑料阵列，例如具有一个或多个凹部(井)的培养板，或塑料托盘，如培养皿。
在一个优选的实施方式中，辐照在固定载体上的组合物，使得射线首先遭遇组合物，然后才遭遇固体载体。
被辐照的组合物的表面大小和形状没有特别限制。优选地，应当将被辐照的组合物的表面设计为，可以均匀地辐照所有组合物。这可以通过辐照保持静止的组合物或使组合物连续通过束流路径来完成。例如，步骤(i)中的组合物的表面积可以在1mm2至100cm2之间。
该组合物可以在辐照期间包括覆盖物，或者可以不包括覆盖物。例如，覆盖物可以是盖子或薄膜。例如，组合物可以在袋子中。如果使用覆盖物，则覆盖物优选是射线可穿透的，并且是耐辐射的。
为了实现基本上均匀的辐照，优选地将薄层构造成使得该层的厚度在射线路径扩散的首选方向上对应于一个或几个哺乳动物细胞的直径，例如一个或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100或1000个哺乳动物细胞的直径。如果组合物作为在固体载体上的薄层被辐照，就和实施方式中一样，射线则优选地垂直或基本垂直地入射在层上。在稀薄液体射流的实施方式中，稀薄液体射流束优选被横向地，基本垂直于液体射流地辐照。
因此，在一个特别优选的实施方式中，薄层的厚度在0.5μm和3cm之间。优选地，薄层的厚度在1μm与1或2cm之间，1μm与100μm或1μm与50μm之间。
辐照之前，包含哺乳动物细胞群的组合物可以是任何组合物，所述组合物包含的哺乳动物细胞包含至少一种活的或存活的目标哺乳动物细胞。例如，组合物可以是冷冻的、冻干的，可以是凝胶、溶胶或液体。组合物优选是凝胶，特别是水凝胶或液体。
在另一优选的实施方式中，所述包含哺乳动物细胞群的组合物在步骤(i)中被辐照时是冻结的，是凝胶、溶胶或液体，优选为凝胶或者液体。在液体组合物的情况下，哺乳动物细胞可以处于悬浮状态，和/或粘附在固体载体上。
组合物优选包含水，更优选地包含水溶液，其中该水溶液特别优选包含一种或多种缓冲物质和/或介质。缓冲水溶液可以是例如pbs。这种溶液的ph优选在ph5.5至8.5的范围内，更优选在ph6.5至8.0的范围内。此外，组合物可以包含形成水凝胶的物质，或者可以是冷冻的或液态的。
在另一优选的实施方式中，根据本发明的方法的特征在于：所述包含哺乳动物细胞群的组合物，在步骤(i)中辐照时以以下形式存在：
a)以细胞悬浮液形式存在，或
b)以固体载体上的粘附细胞层形式存在。
粘附的细胞层可优选地包含一个或多个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或50个细胞层。
在另一优选的实施方式中，在步骤(i)中辐照后的哺乳动物细胞群基本上不包含细胞组织，更优选地不包含连续的组织，例如肝片。细胞的均匀分布有助于均匀辐照。
电子射线可以优选地以在80kev和10mev范围内的能量加速。
在另一优选的实施方式中，根据本发明的方法的特征在于：利用电子射线辐照，以80kev至10mev之间的加速能量对对电子射线进行加速，特别是以80kev至300kev之间的加速能量进行加速。
在另一优选的实施方式中，根据本发明的方法的特征在于：利用x射线辐照，并且x射线的能量在5kev至600kev之间，优选在5kev至300kev之间，在400kev或500kev之间，更优选在10kev至200kev之间。
在一个优选的实施方式中，电子射线和/或x射线基本上在常压下施用，其中所述常压优选以地球大气的混合气体形式存在。
在辐照过程中会出现温度升高。因此，为了避免变性过程，如果温度低或不升高则是有利的。
因此，在本发明方法的另一优选实施方式中，组合物在辐照前的温度在-200℃至38℃之间，优选在-130℃、-80℃、-10℃或0℃至37.7℃之间，更优选在10℃和37.5℃之间，还更优选在15℃和37.5℃之间。
在另一实施方式中，可以在组合物的温度于辐照前小于1℃(例如冷冻的组合物)的情况下进行辐射。在这种情况下，所述组合物在辐照后的温度也可以小于1℃，或者辐照后的组合物的温度可以为1℃或更高。
在根据本发明的方法的另一优选的实施方式中，与辐照前相比，在辐照后组合物的温度升高在0k和5k之间，优选在0k和1k之间。
因此，在本发明方法的另一优选的实施方式中，组合物在辐照后的温度在-200℃至38℃之间，优选在-130℃、-80℃、-10℃或0℃至37.7℃之间，更优选在10℃和37.5℃之间，还更优选在15℃和37.5℃之间。
在根据本发明的方法的另一优选实施方式中，组合物的密度为0.9至2g/cm3之间，优选为1.0至1.8g/cm3之间。
哺乳动物细胞通过根据本发明的辐照，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的细胞群体在辐照后1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天仍保持存活，即在很大程度上保持存活，同时增殖的能力降低。在一个优选的实施方式中，在辐照后3天，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的细胞群体保持存活。专业人员已知，不同的细胞会具有不同的辐射敏感性，因此，针对不同细胞上述数值会变化。
在一个优选的实施方式中，在辐照后包含哺乳动物细胞群的组合物，包含至少一种目标哺乳动物的活细胞，并且组合物的目标哺乳动物细胞在辐照后的增殖能力降低。优选地，增殖能力可以降低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
在一个优选的实施方式中，辐照后的增殖能力降低了100％。在该实施方式中，这些细胞不能再繁殖。对于过度增殖的细胞，例如待施用的肿瘤细胞或永生化细胞系，增殖能力需要减少100％，因为这些细胞在有剩余增殖能力的情况下不适于施用于个体。
可以通过在允许体外生长的条件下确定细胞数量，以此来确定增殖能力。在存在合适培养基的情况下，此类条件通常在10℃至38℃之间。至少在两个不同的时间点来确定细胞的数量。确定细胞数量的方法是本领域专业人员已知晓的，并且包括例如确定细胞增殖或存活情况的方法。细胞存活情况的确定可以如上所述方式进行。确定增殖的方法也是专业人员知晓的，并且包括例如上述的存活情况检测以及铬释放测定或淋巴细胞转化测定(ltt)。
辐照后增殖能力的降低，可理解为与其他相似条件下未辐照过的相同哺乳动物细胞相比，增殖能力降低。
在一个优选的实施方式中，被辐照的活性目标哺乳动物细胞具有期望的生物活性，特别是辐照后的1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。这种所需的生物活性取决于目标哺乳动物细胞的类型。例如，细胞可以具有治疗、预防或美容方面的有效活性。优选地，生物活性可以是细胞毒性、免疫原性、免疫抑制和免疫耐受的介导。在nk细胞的情况下，生物活性优选是对肿瘤细胞的细胞毒性。如实施例和图2至12所示，用本发明的方法成功辐照了nk细胞。优选地，在其他都相同的条件下，所期望的生物活性在辐照后1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天，至少是没有经过辐照的哺乳动物细胞的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。更优选地，在相同条件下，所需的生物活性在辐照后3天，至少是没有经过辐照的哺乳动物细胞的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。对于本领域专业人员来说，确定所需的生物活性的方法是熟知的。例如，用于确定细胞毒性、免疫原性、免疫抑制或免疫耐受介导的体外和/或体内测定。
在另一优选实施方式中，根据本发明的方法的特征在于：
a)包含哺乳动物细胞群的组合物在辐照后包含至少一种存活的目标哺乳动物细胞；
b)辐照后，组合物的目标哺乳动物细胞在辐照后增殖能力降低，
尤其是，其中目标哺乳动物细胞是过度增殖或永生化的细胞，并且其辐照后的增殖能力降低了100％，
c)辐照后，组合物的目标哺乳动物细胞具有生物活性，尤其是治疗、预防或者美容活性，优选地，所述生物活性选自细胞毒性、免疫原性、免疫抑制和免疫耐受的介导。
在另一实施方式中，本发明涉及一种用于制备药剂的方法，所述药剂包含至少一种适于施用于个体的经处理的目标哺乳动物细胞，其特征在于：
a0)提供包含哺乳动物细胞群的组合物，其中哺乳动物细胞群包含至少一种目标哺乳动物细胞，
a1)执行根据本发明的方法，
a2)可选地将一种或多种药学上可接受的载体和/或助剂添加到含有哺乳动物细胞群的组合物中，和/或
a3)可选地将一种或多种其他具有治疗、预防或美容活性的药剂添加到含有哺乳动物细胞群的组合物中，
其中，以任意顺序来执行步骤a1)至a3)。
因此，可以用本发明的方法辐照那些已经制备完成并可即用于施用的组合物，例如，疫苗、细胞毒性产品或单采产品，这些产品中已含有合适的辅料，和/或添加剂，和/或一种或多种其他的具有治疗、预防或美容的活性的药剂。
在另一实施方式中，可以根据本发明实施对细胞群的辐照，接着可以可选地将一种或多种药学上可接受的载体和/或辅料添加至组合物中，和/或可以将一种或多种其他具有治疗、预防或美容活性的药剂添加至组合物中。
因此，在本发明方法的另一优选实施方式中，步骤(i)中的组合物是液体悬浮液，固体载体上的凝胶或贴壁细胞，或含水的冷冻组合物，例如哺乳动物细胞在水溶液中的悬浮液。该水溶液特别优选包含一种或多种缓冲物质和/或介质。缓冲水溶液可以是例如pbs。这种溶液的ph优选在ph5.5至8.5的范围内，更优选在ph6.5至8.0的范围内。此外，步骤(i)中的组合物可以包含一种或多种其他药学上可接受的载体和/或辅料，或者如有需要的话可以在步骤(i)和可选的步骤(ii)之后添加它们。此外，步骤(i)中的组合物可以与一种或多种其他治疗、预防或美容有效药剂一起添加，或者如有需要的话可以在步骤(i)和可选的步骤(ii)之后添加。
因此，在本发明方法的另一实施方式中，步骤(i)中的组合物包含药学上可接受载体和/或辅料。
在疫苗的情况下，添加剂可以作为辅料包含在内。添加剂对本领域专业人员来说都是熟知的。合适的添加剂是那些足以增强对免疫原的免疫反应。用于基于抗体的疫苗的合适添加剂包括，例如铝盐，如磷酸铝或氢氧化铝，角鲨烯混合物(saf-1)，鼠李肽，皂苷衍生物，分枝杆菌细胞壁制剂，单磷酰脂质a，支原体衍生物，非离子嵌段共聚物表面活性物质，植物皂苷a(quila)，霍乱毒素b亚基，聚磷腈及其衍生物和免疫刺激复合物(iscom)，例如在takahashi等人(1990)nature344：873-875中所述。例如，基于th-1的细胞毒性疫苗的合适添加剂是polyi：c。
例如，合适的载体材料和辅料是水或适于施用的水溶液，其特别优选地包含一种或多种缓冲物质。可以根据施用方式、剂量、剂型、贮存和活性成分来选择合适的载体材料和辅料。辅料包括载体材料，例如微晶纤维素，乳糖，甘露醇，溶剂，例如聚乙二醇，乳化剂和分散剂或湿润剂，例如十二烷基硫酸钠，聚氧山梨醇酸酯，粘合剂，例如聚乙烯基吡咯烷酮，合成的和天然的聚合物，例如白蛋白，稳定剂，例如抗氧化剂如抗坏血酸，染料，例如无机颜料，例如氧化铁，以及调味剂和/或增香剂()。
施用的剂量和途径还取决于待施用的细胞药剂的类型。例如，可以考虑全身性的，例如静脉内或腹膜内施用，肠内或肠外施用，或局部施用，例如肿瘤内或皮下施用。此外，取决于要施用的细胞药剂的类型，例如，每次施用可以将104至109个细胞施用于个体。
在适当情况下，可能需要偏离前面提到的量，但具体取决于体重，施用途径，对活性成分的个体反应，制剂类型以及施用时间或间隔。因此，在一些情况下，以小于上述最小量就足够了，而在其他情况下，必须超过所述上限。在较大剂量施用的情况下，建议在一整天内分成数个单剂量分配。
在另一实施方式中，本发明涉及一种药剂，所述药剂包含至少一种经处理的存活的目标哺乳动物细胞并适于施用于个体，和/或包含用于制备适于施用于个体并经处理的存活的目标哺乳动物细胞，所述药剂可按照根据本发明的任何一个方法来制备。
在一个优选的实施方式中，根据本发明的药剂和/或依照本发明被处理的活性目标哺乳动物细胞的特征在于：所述目标哺乳动物细胞具有在根据本发明的方法中公开的一个或多个特征，优选其中所述药剂用于治疗或预防疾病。
在另一实施方式中，本发明涉及用于产生电子射线和/或x射线的装置的以下用途，
i)用于制备药剂，所述药剂包含至少一种经处理的存活的目标哺乳动物细胞，所述药剂适于施用于个体，和/或用于制备经处理的存活的目标哺乳动物细胞，其中，这些目标哺乳动物细胞适于制备施用于个体的细胞药剂，和/或
ii)用于用电子射线和/或x射线辐照包含至少一种目标哺乳动物细胞的哺乳动物细胞群，其特征在于：利用电子射线和/或x射线对包含哺乳动物细胞群的组合物进行体外辐照，其中哺乳动物细胞群包含至少一种目标哺乳动物细胞，并且剂量率在5gy/秒至107gy/秒的范围内。
在另一实施方式中，本发明涉及电子射线和/或x射线的以下用途，
i)用于制备药剂，所述药剂包含至少一种经处理的存活的目标哺乳动物细胞，所述药剂适于施用于个体，和/或用于制备经处理的存活的目标哺乳动物细胞，其中，这些目标哺乳动物细胞适于制备施用于个体的细胞药剂，和/或
ii)用于用电子射线和/或x射线辐照包含至少一种目标哺乳动物细胞的哺乳动物细胞群，其特征在于：利用电子射线和/或x射线对包含哺乳动物细胞群的组合物进行体外辐照，其中哺乳动物细胞群包含至少一种目标哺乳动物细胞，并且剂量率在5gy/秒至107gy/秒的范围内；
针对本发明的这些用途可以应用相同的实施方式，对于本发明的方法也公开了相同的实施方式。因此，在另一优选的实施方式中，根据本发明的用途的特征在于：其具有一个或多个依据本发明的方法公开的特征。
图1：根据tam等(1999)与suck等.(2006)，常规辐照(伽马，10gy)的nk细胞系的抗肿瘤细胞毒性的丧失。kont.“＝kontrolle(对照)。nk-92和khyg-1＝nk细胞系(自然杀伤细胞系)。k562＝淋巴瘤肿瘤细胞系，作为细胞毒性靶标。a)：nk-92-nk细胞系；b)：khyg-1nk细胞系。各个左柱：对照；各个右柱：用10kgy辐照后3天。
图2：通过电子辐照器以不同剂量对nk-92细胞的辐照，以及增殖的限制和被辐射细胞的保持存活的情况。除虚拟辐照外，以相同的方式对对照进行处理。左起各个柱：1.未处理的nk-92细胞；2.以20±10gy的剂量(以下称为“最小剂量”)处理的nk-92细胞；3.用5倍最小剂量处理的nk-92细胞；4.用10倍最小剂量处理的nk-92细胞；5.用50倍最小剂量处理的nk-92细胞；6.用100倍最小剂量处理的nk-92细胞。对细胞悬液的液体薄膜的电子辐照导致细胞组分的增殖活性受到限制，而活力在很大程度上得以保留。
图3：通过电子辐照器对khyg-1nk细胞的辐照，以及增殖的限制和被辐射细胞的活性的获取。除虚拟辐射外，以相同的方式对对照进行处理。左起各个柱：1.未处理的khyg-1细胞；2.用最小剂量处理的khyg-1细胞；3.用5倍最小剂量处理的khyg-1细胞；4.用10倍最小剂量处理的khyg-1细胞；5.用10倍最小剂量处理的khyg-1细胞；6.用100倍最小剂量处理的khyg-1细胞。对细胞悬液的液体薄膜的电子辐照导致细胞组分的增殖活性受到限制，而活性在很大程度上得以保留。
图4：利用已公开的常规辐照(伽马辐照，10gy，对于nk-92细胞根据tam等1999公开的内容进行修饰，和对于khyg-1细胞根据suck等2006公开的内容进行修饰)的nk-92和khyg-1自然杀伤细胞系的存活情况和用电子射线以最小的增殖抑制辐照的nk-92和khyg-1自然杀伤细胞系的存活情况进行比较。a)：从左起各个柱为：1.常规处理(10gy伽马)的nk-92细胞；2.常规处理的nk-92细胞transil2-1；3.常规处理的nk-92细胞transil2-1；4.用最小剂量电子射线处理的nk-92细胞。b：从左起各个柱为：1.常规处理(10gy伽马)的khyg-1细胞；2.用最小剂量电子射线处理的khyg-1细胞。
图5常规辐照或最小计量电子射线辐照后nk92的增殖。nk细胞系nk92用常规x射线辐照(剂量：10、20和40gy，仪器：sarrp，xstrahl有限公司，英国)(“x-ray”)或最小剂量电子射线辐照(“ebeam”)。在以下条件下进行电子辐照：剂量率：约300gy/秒(计算值)。辐照时间：0.033至6.6秒。计算的剂量：0、10、20和40gy。辐射后直接将细胞以一百万个细胞/毫升的密度接种在6孔(凹槽)平底平板中的nk细胞培养基中。通过台盼蓝染色对细胞进行计数。在四天(24、48、72和96小时)内对增殖进行观察。辐照24小时后的计数作为参考值。常规辐照的数据从一式三份的实验中计算出，并显示为平均值±sem。最小剂量电子射线辐照的数据从三个独立的实验中计算出，并表示为平均值±sem，n＝3。
图6：常规辐照或最小剂量电子射线辐照之后nk92的存活情况。用(a)常规x射线辐照(剂量：10、20和40gy，仪器：sarrp，xstrahl有限公司，英国)或(b)最小剂量电子射线辐照nk细胞系nk92。在以下条件下进行电子辐照：剂量率：约300gy/秒(计算值)。辐照时间：0.033至6.6秒。计算的剂量：0、10、20和40gy。细胞以一百万个细胞/毫升的密度接种在6孔(凹槽)平底平板中的nk细胞培养基中。使用bdaccuritmc6测量细胞存活情况。四天(24、48、72和96小时)内对细胞的存活情况进行观察。常规辐照的数据从一式两份的实验中计算出，并显示为平均值±sd。最小剂量电子射线辐照的数据在三个独立的实验中计算出，并表示为平均值±sd，n＝3。与传统辐照的数据相比，p值＜0.05(*)达到了统计显著性，并使用未配对的双侧t检验进行了计算。
图7：常规辐照和最小剂量电子射线辐照后nk92的细胞毒性能力。效应细胞与靶细胞5：1。用(a)常规x射线辐照(剂量：10、20和40gy，仪器：sarrp，xstrahl有限公司，英国)或(b)最小剂量电子射线辐照nk细胞系nk92。在以下条件下进行电子辐照：剂量率：约300gy/秒(计算值)。辐照时间：0.033至6.6秒。(计算剂量：0、10、20和40gy)，并在四天(24、48、72和96小时)内检测特异性裂解。对于铕细胞毒性测定，在nk细胞培养基中将nk92与靶细胞系k562以5：1的e：t比例培养2小时。常规辐照的数据从一式三份的实验中计算出，并显示为平均值±sd。最小剂量电子射线辐照的数据从三个独立的一式三份的实验中计算出，并表示为平均值±sd。与传统辐照的数据相比，p值＜0.05(*)达到了统计显著性，并使用未配对的双侧t检验进行计算。简称：“e：t”是指效应细胞比靶细胞。
图8：常规辐照和最小剂量电子射线辐照之后nk92的细胞毒性能力。效应细胞比靶细胞1：1。用(a)常规x射线辐照(剂量：10、20和40gy，仪器：sarrp，xstrahl有限公司，英国)或(b)最小剂量电子射线辐照nk细胞系nk92。在以下条件下进行电子辐照：剂量率：约300gy/秒(计算值)。辐照时间：0.033至6.6秒。计算的剂量：0、10、20和40gy。四天(24、48、72和96小时)内检测特异性裂解。对于铕细胞毒性测定，在nk细胞培养基中将nk92与靶细胞系k562以1：1的e：t比例培养2小时。常规辐照的数据从一式两份的实验中计算出，并显示为平均值±sd。最小剂量电子射线辐照的数据从三个独立的一式三份的实验中计算出，并表示为平均值±sd。与传统辐照的数据相比，p值＜0.05(*)达到了统计显著性，并使用未配对的双侧t检验进行计算。简称：“e：t”是指效应细胞比靶细胞。
图9：常规辐照或最小剂量电子射线辐照之后khyg1的增殖。对nk细胞系khyg1用常规x射线辐照(x光(剂量：10、20和40gy，仪器：sarrp，xstrahl有限公司，英国)仪器：sarrp，xstrahl有限公司，英国)(“x-ray”)或最小剂量电子射线(“ebeam”)辐照。在以下条件下进行电子辐照：剂量率：约300gy/秒。计算的剂量：0、10、20和40gy。辐射后直接将细胞以一百万个细胞/毫升的密度接种在6孔(凹槽)平底平板中的nk细胞培养基中。通过台盼蓝染色对细胞进行计数。在四天(24、48、72和96小时)内对增殖进行观察。以辐照24小时后的计数作为参考值。常规辐照的数据从一式三份的实验中计算出，并显示为平均值±sem。最小剂量电子射线辐照的数据从三个独立的实验中计算出，并表示为平均值±sem，n＝3。
图10：常规辐照或最小剂量电子射线辐照之后khyg1的活性。对nk细胞系khyg1用常规x射线辐照(x光(剂量：10、20和40gy，仪器：sarrp，xstrahl有限公司，英国)(“x-ray”)或最小剂量电子射线辐照(“ebeam”)。在以下条件下进行电子辐照：剂量率：约300gy/秒。计算的剂量：0、10、20和40gy。细胞以一百万个细胞/毫升的密度接种在6孔(凹槽)平底平板中的nk细胞培养基中。使用bdaccuritmc6测量细胞存活情况。在四天(24、48、72和96小时)内对细胞存活情况进行观察。常规辐照的数据从一式两份的实验中计算出，并显示为平均值±sd。最小剂量电子射线辐照的数据从三个独立的实验中计算出，并表示为平均值±sd，n＝3。与传统辐照的数据相比，p值＜0.05(*)达到了统计显著性，并使用未配对的双侧t检验进行计算。
图11：常规辐照和最小剂量电子射线辐照之后khyg1的细胞毒性能力。效应细胞比靶细胞5：1。对nk细胞系khyg1用常规x射线辐照(x射线(剂量：10、20和40gy，仪器：sarrp，xstrahl有限公司，英国)(“x-ray”)或最小剂量电子射线(“ebeam”)辐照。在以下条件下进行电子辐照：剂量率：约300gy/秒。计算的剂量：0、10、20和40gy。在四天(24、48、72和96小时)内检测特异性裂解。对于铕细胞毒性测定，在nk细胞培养基中将khyg1与靶细胞系k562以5：1的e：t比例培养2小时。常规辐照的数据从一式两份的实验中计算出，并显示为平均值±sd。最小剂量电子射线辐照的数据从三个独立的一式三份的实验中计算出，并表示为平均值±sd。与传统辐照的数据相比，p值＜0.05(*)达到了统计显著性，并使用未配对的双侧t检验进行计算。简称：“e：t”是指效应细胞比靶细胞。
图12：常规辐照和最小剂量电子射线辐照之后khyg1的细胞毒性能力。效应细胞比靶细胞1：1。用(a)常规x射线辐照(剂量：10、20和40gy，仪器：sarrp，xstrahl有限公司，英国)或(b)最小剂量电子射线辐照nk细胞系khyg1。在以下条件下进行电子辐照：剂量率：约300gy/秒。计算的剂量：0、10、20和40gy。在四天(24、48、72和96小时)内检测特异性裂解。对于铕细胞毒性测定，在nk细胞培养基中将khyg1与靶细胞系k562以1：1的e：t比例培养2小时。常规辐照的数据从一式两份的实验中计算出，并显示为平均值±sd。最小剂量电子射线辐照的数据从三个独立的一式三份的实验中计算出，并表示为平均值±sd。与传统辐照的数据相比，p值<0.05(*)达到了统计显著性，并使用未配对的双侧t检验进行计算。简称：“e：t”是指效应细胞比靶细胞。
对于每个实验，辐照70μl的1×107个细胞/毫升细胞悬液。为此，在辐照前通过台盼蓝计数来确定细胞数量和存活情况。具体地，将培养基中的10μl细胞悬液(见上文)与10μl的0.5％台盼蓝溶液(0.5g台盼蓝[thomasgeyer，雷宁根]溶于100ml的dpbs缓冲液[fisherscientific，斯维尔特])混合。将混合物在37℃下孵育大约两分钟，并通过neubauer计数板(dr.ilonaschubertlaborfachhandel，莱比锡)计数。
在这种情况下，将10μl的混合物置于腔室上的盖玻片下，使其充满着色的混合物。在细胞培养透光显微镜下(axio，蔡司，耶拿)用10倍目镜观察。其中活细胞在形态上是圆形的和无色的，而死细胞同样是圆形的但被染成紫色。细胞数是四个大正方形中的细胞数的平均值乘以稀释因子(此处为：0.5)、原始细胞悬液的体积以及计数室特定因子104。
在进行实验之前，将细胞调节至所需的细胞密度，并通过300xg(fisherscientific，斯维尔特)下离心或沉淀收集，并分别纳入70μl的dpbs中。在即将辐照之前，将70μl含有1×107个细胞的细胞悬液置于培养皿的中央(primariatmeasy-grip皿，corningb.v.生命科学，荷兰阿姆斯特丹)，并覆盖3厘米直径的opp薄膜(定向聚丙烯薄膜)以便在辐照前形成合流的细胞单层(单层)。辐照生物复制物。
将无盖的培养皿放在样品架上，并用薄膜覆盖，以确保一定程度的无菌性。用约20±10gy范围内的最小剂量(以下称为“最小剂量”)以及以最小剂量的5倍、10倍、50倍和100倍辐照细胞。因此，用约20gy至2000gy(计算值)的剂量辐照。
在以下条件下进行辐照：
剂量率：约300gy/秒(计算值)。
辐照时间：0.066和6.6秒之间。
辐照后紧接着用约100μl胰蛋白酶/0.5％的edta溶液(fisherscientific，斯维尔特)溶解opp膜下的细胞，用dpbs洗涤，并通过台盼蓝细胞计数确定其存活情况。此后，将细胞与培养基混合并将其转移至新孔(凹槽)中以进一步培养，并按照培养条件进行处理(参见上文)。以6小时、24小时、48小时、72小时、96小时和144小时的间隔测定存活情况和细胞数。
对于图5的实验，在常规的低剂量率辐照或高剂量率的最小剂量电子射线辐照之后测定nk92的增殖。用常规x射线辐照(剂量：10、20和40gy，仪器：sarrp，xstrahl有限公司，英国)(“x-ray”)或最小剂量电子射线(“ebeam”)辐照nk细胞系nk92。在以下条件下进行电子辐照：剂量率：约300gy/秒(计算值)。辐照时间：0.033至6.6秒。计算剂量：0、10、20和40gy。辐射后直接将细胞以一百万个细胞/毫升的密度接种在6孔(凹槽)平底平板中的nk细胞培养基中。通过台盼蓝染色对细胞进行计数。在四天(24、48、72和96小时)内对增殖进行观察。以辐照24小时后的计数作为参考值。常规辐照的数据从一式三份的实验中计算出，并显示为平均值±sem。最小剂量电子射线辐照的数据从三个独立的实验中计算出，并表示为平均值±sem，n＝3。
对于图6的实验，在常规的低剂量率辐照或高剂量率的最小剂量电子射线辐照之后，测定nk92的存活情况。用(a)常规x射线辐照(剂量：10、20和40gy，仪器：sarrp，xstrahl有限公司，英国)nk细胞系nk92，或(b)最小剂量电子射线辐照nk细胞系nk92。在以下条件下进行电子辐照：剂量率：约300gy/秒(计算值)。辐照时间：0.033至6.6秒。计算剂量：0、10、20和40gy。细胞以一百万个细胞/毫升的密度接种在6孔(凹槽)平底平板中的nk细胞培养基中。使用bdaccuritmc6测量细胞活性。在四天(24、48、72和96小时)内对细胞存活情况进行观察。常规辐照的数据从一式两份的实验中计算出，并显示为平均值±sd。最小剂量电子射线辐照的数据从三个独立的实验中计算出，并表示为平均值±sem，n＝3。与传统辐照的数据相比，p值＜0.05(*)达到了显着性差异，并使用未配对的双侧t检验进行了计算。
对于图7的实验，在常规的低剂量率辐照和高剂量率的最小剂量电子射线辐照后，在效应子与靶细胞的比例为5：1时，确定nk92的细胞毒性能力。用(a)常规x射线辐照(剂量：10、20和40gy，仪器：sarrp，xstrahl有限公司，英国)nk细胞系nk92或(b)最小剂量电子射线辐照nk细胞系nk92。在以下条件下进行电子辐照：剂量率：约300gy/秒(计算值)。辐照时间：0.033至6.6秒。计算的剂量：0、10、20和40gy。在四天(24、48、72和96小时)内检测特异性裂解。对于铕细胞毒性测定，在nk细胞培养基中将nk92与靶细胞系k562以5：1的e：t比例培养2小时。常规辐照的数据从一式两份的实验中计算出，并显示为平均值±sd。最小剂量电子射线辐照的数据从三个独立的一式三份的实验中计算出，并表示为平均值±sd。与传统辐照的数据相比，p值＜0.05(*)达到了统计显著性，并使用未配对的双边t检测进行计算。简称：e：t：效应细胞比靶细胞。
对于图8的实验，在常规的低剂量率辐照和高剂量率的最小剂量电子射线辐照后，在效应子与靶细胞的比例为1：1时，确定nk92的细胞毒性能力。用(a)常规x射线辐照(剂量：10、20和40gy，仪器：sarrp，xstrahl有限公司，英国)nk细胞系nk92，或(b)最小剂量电子射线辐照nk细胞系nk92。在以下条件下进行电子辐照：剂量率：约300gy/秒(计算值)。辐照时间：0.033至6.6秒。计算的剂量：0、10、20和40gy。在四天(24、48、72和96小时)内检测特异性裂解。对于铕细胞毒性测定，在nk细胞培养基中将nk92与靶细胞系k562以1：1的e：t比例培养2小时。常规辐照的数据从一式两份的实验中计算出，并显示为平均值±sd。最小剂量电子射线辐照的数据从三个独立的一式三份的实验中计算出，并表示为平均值±sd。与传统辐照的数据相比，p值＜0.05(*)达到了统计显著性，并使用未配对的双边t检测进行计算。
对于图9的实验，在常规的低剂量率辐照或高剂量率的最小剂量电子射线辐照之后测定khyg1的增殖。用常规x射线辐照(剂量：10、20和40gy，仪器：sarrp，xstrahl有限公司，英国)(“x-ray”)或最小剂量子束(“ebeam”)辐照nk细胞系khyg1。在以下条件下进行电子辐照：剂量率：约300gy/秒。计算的剂量：0、10、20和40gy。辐射后直接将细胞以一百万个细胞/毫升的密度接种在6孔(凹槽)平底平板中的nk细胞培养基中。通过台盼蓝染色对细胞进行计数。在四天(24、48、72和96小时)内对增殖进行观察。以辐照24小时后的计数作为参考值。常规辐照的数据从一式三份的实验中计算出，并显示为平均值±sem。最小剂量电子射线辐照的数据从三个独立的实验中计算出，并表示为平均值±sem，n＝3。
对于图10的实验，在常规的低剂量率辐照或最小剂量高剂量率电子射线辐照之后测定khyg1的活性。用(a)常规x射线辐照(剂量：10、20和40gy，仪器：sarrp，xstrahl有限公司，英国)nk细胞系khyg1或(b)最小剂量电子射线辐照nk细胞系khyg1。在以下条件下进行电子辐照：剂量率：约300gy/秒。计算的剂量：0、10、20和40gy。细胞以一百万个细胞/毫升的密度接种在6孔(凹槽)平底平板中的nk细胞培养基中。使用bdaccuritmc6测量细胞活性。在四天(24、48、72和96小时)内对细胞活性进行观察。常规辐照的数据从一式三份的实验中计算出，并显示为平均值±sd。最小剂量电子射线辐照的数据从三个独立的实验中计算出，并表示为平均值±sem，n＝3。与传统辐照的数据相比，p值＜0.05(*)达到了统计显著性，并使用未配对的双侧t检验进行计算。
对于图11的实验，在常规的低剂量率辐照和高剂量率的最小剂量电子射线辐照后，在效应细胞与靶细胞的比例为5：1时，确定khyg1的细胞毒性能力。用(a)常规x射线辐照(剂量：10、20和40gy，仪器：sarrp，xstrahl有限公司，英国)nk细胞系khyg1或(b)最小剂量电子射线辐照nk细胞系khyg1。在以下条件下进行电子辐照：剂量率：约300gy/秒。计算的剂量：0、10、20和40gy。在四天(24、48、72和96小时)内检测特异性裂解。对于铕细胞毒性测定，在nk细胞培养基中将khyg1与靶细胞系k562以5：1的e：t比例培养2小时。常规辐照的数据从一式两份的实验中计算出，并显示为平均值±sd。最小剂量电子射线辐照的数据从三个独立的一式三份的实验中计算出，并表示为平均值±sd。与传统辐照的数据相比，p值＜0.05(*)达到了统计显著性，并使用未配对的双侧t检验进行计算。
对于图12的实验，在常规的低剂量率辐照和高剂量率的最小剂量电子射线辐照后，在效应细胞与靶细胞的比例为1：1时，确定khyg1的细胞毒性能力。用(a)常规x射线辐照(剂量：10、20和40gy，仪器：sarrp，xstrahl有限公司，英国)nk细胞系khyg1或(b)最小剂量电子射线辐照nk细胞系khyg1。在以下条件下进行电子辐照：剂量率：约300gy/秒。计算的剂量：0、10、20和40gy。在四天(24、48、72和96小时)内检测特异性裂解。对于铕细胞毒性测定，在nk细胞培养基中将khyg1与靶细胞系k562以1：1的e：t比例培养2小时。常规辐照的数据从一式两份的实验中计算出，并显示为平均值±sd。最小剂量电子射线辐照的数据从三个独立的一式三份的实验中计算出，并表示为平均值±sd。与传统辐照的数据相比，p值＜0.05(*)达到了统计显著性，并使用未配对的双侧t检验进行计算。
在现有技术已知的常规伽马射线或x射线辐照方法中，使用低剂量率；即在更长的时间内使用一定剂量。
在实验中，产生悬浮液的薄的液膜，利用高剂量率的电子射线对其进行了辐照。出乎意料的是，可以证实各细胞组分的增殖活性受限，同时很大程度上保持存活(图2和3)。
而且从图4可以看出，在相同剂量下，以高剂量率的电子射线辐照后的细胞在细胞的存活情况方面，与已公布的经常规低剂量率辐照(伽马辐照，10gy，其中nk-92细胞根据tam等1999所公开的内容进行修饰，khyg-1细胞根据suck等2006所公开的内容进行修饰)后的细胞的存活情况相比，效果更好。
另外，图5至图12表明，在细胞存活情况和所需的细胞毒性生物活性方面，在相同剂量时，根据本发明的高剂量率电子射线辐射比常规的以10gy、20gy或40gy低剂量率进行的x射线辐射的效果更好。
klingemann，h.g.；wong，e.；maki，g.(1996)：细胞毒性nk细胞系(nk-92)用于从血液中离体清除白血病。位于：血液和骨髓移植生物学：《美国血液和骨髓移植学会杂志》2(2)，见第68-75页。
