[转载]RNAi及siRNA的设计
1 RNAi的历史背景
20世纪20年代，人们发现，植物受到野生型病毒感染后，能产生对另一种亲缘关系相近的病毒的抵抗力。而真正发现双链RNA(dsRNA)能引起基因沉默现象，则在1995年。当时，Guo和Kemphues用反义RNA技术阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)中parl基因的表达时发现反义RNA具有抑制该基因表达的功能，同时正义RNA也同样出现了类似的抑制效应，实验表明正义RNA和反义RNA均能阻抑基因功能表达，而且两者的作用是相互独立的，机制也各不相同。1998年，Fire和Mello等人首次发现dsRNA能够特异地抑制C.elegans中的纹状肌细胞unc-22基因的表达，结果发现dsRNA所引起的基因沉默效应要比单单应用反义RNA或正义RNA强十几倍。而且注射入C.elegans的性腺后，在其第一子代中也诱导出了同样基因的抑制现象，说明在原核生物中，RNAi具有可遗传性。他们将这一现象称为RNAi。因为RNAi作用发生在转录后水平，所以又被称为转录后基因沉默(PTGS)或共抑制。
此后，又在果蝇、锥虫、涡虫、无脊椎动物、脊椎动物、植物、真菌、斑马鱼及哺乳动物等真核生物中发现了RNAi现象。不同领域中的发现促使人们思考它们之间的可能联系。RNAi在果蝇中得到证实的同时，发现转座子翻转移位可启动RNAi，而转座子翻转移位所造成的同源基因沉默很似植物中的共抑制；在线饱霉实验中，发现PTGS过程中所必须的蛋白QDE1与RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)同源，提示PTGS过程中可能涉及到RNA复制及调节作用。同样在植物韧皮部注射dsRNA可遍及扩散到整个植株体产生RNAi；更有趣的是，把线虫浸润到含有dsRNA液体中或喂养表达dsRNA的工程菌也可以诱发RNAi。这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。
2 RNAi的作用机理
目前对RNAi的作用机理尚不清楚，
RNAi是由dsRNA诱导的多步骤、多因素参与的过程，属于基因转录后调控，其中需要ATP的参与。通常认为dsRNA由核酸内切酶(RNA
se Ⅲ)切割成21～23bp的siRNA (在果蝇RNA se Ⅲ 被称为
dicer)，siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、螺旋酶)结合形成RNA诱导的沉默复合物RISC，然后RISC再特异性地与ｍRNA的同源区结合，通过酶的作用使ｍRNA降解，而产生基因沉默。靶ｍRNA被破坏后，
RISC还可以再作用于其它靶分子。siRNA还具有低分子质量、低浓度、沉默信号可在细胞间传递甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点。而大于30bp的dsRNA可引起机体非特异性干扰素样反应和蛋白激酶(PKP)的激活而使其被降解，从而大大减少了其对ｍRNA的抑制作用。
3 RNAi的特点
RNAi被美国科学杂志评为2001年十大科技突破之一，科学家对RNA干扰现象之所以表现出极大关注在于RNA干扰在基因功能和相关方面的研究中具有许多传统方法无法比拟的特点和优势。RNAi有7个重要特征
3.1 RNAi是dsRNA介导的PTGS机制
在此过程中，注射该基因的内含子或者启动子顺序的dsRNA都没有干涉效应。翻译抑制剂对RNAi不产生影响。
3.2高特异性
RNAi只能特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA，而其他mRNA的表达则不受影响。
无论是在体内还是体外实验中，仅需少量的dsRNA(几个数量级浓度)就能有效的抑制靶基因表达，抑制的效率在低等动物中&90%。这表明dsRNA介导的RNA干扰是一个以催化放大的方式进行的。
3.4 dsRNA长度限制性
引发有效iRNA的dsRNA需要一个最小的长度。dsRNA小片段如小于21～23nt(如10～15nt)，特异性将显著降低，不能保证不与细胞内非靶向基因相互作用，如远远大于21～23nt，互补序列可能延伸，超出抑制范围。
3.5 RNAi有浓度、时间双重依赖性
dsRNA诱发的RNAi效应的强度随着其浓度的增高而增强。高浓度的dsRNA产生较多的siRNA，不仅能增强反应体系的效应，而且还能抵消ADARs(RNA依赖的腺苷脱氨酶)的作用。实验表明，RNAi在哺乳动物细胞中只能维持一段时间，干扰效应通常出现在注射dsRNA
6h后，可持续72h以上。
3.6可传播性
基因表达的效应可以跨越细胞界限，在不同细胞甚至生物体间长距离传递和维持，并可传递给子一代。
3.7 ATP依赖性
在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能是Dicer和RISC的酶切反应是必须由ATP提供能量。
一、siRNA的设计
　　在制备siRNA
前都需要单独设计siRNA序列。研究发现对哺乳动物细胞，最有效的siRNAs是21-23个碱基大小、3‘端有两个突出碱基的双链RNA；而对非哺乳动物，比较有效的是长片段dsRNA。siRNA的序列专一性要求非常严谨，与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。
选择siRNA靶位点：
　　从转录本AUG起始密码子开始，搜寻下游AA序列，记录跟每个AA
3’端相邻的19个核苷酸作为候选的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5’和3’端的非编码区（untranslated
regions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。
序列同源性分析:
　　将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（
通常来说，每个目标序列设计3—4对siRNAs，选择最有效的进行后续研究。
设计阴性对照：
　　一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA中的碱基序列打乱。当然，同样要保证它和其他基因没有同源性。
此外网上提供免费的siRNA设计工具/siRNA,
二、siRNA的获得
1. 化学合成定制siRNA
　　尽管化学合成siRNA是最贵的方法，但却是最方便的——研究人员几乎不需要做什么工作就可以拿到高质量的siRNA。如QIAGEN-Xeragon公司可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA（可带标记）。它最适用于的情况是：已经找到最有效的siRNA序列，需要大量siRNA进行研究。QIAGEN还提供siRNA设计合成一体化服务“4-for
Silencing siRNA duplexes”
：针对客户给出的一个基因序列，由QIAGEN的专家设计并合成4对siRNA，HPP纯度，保证至少一对抑制效率达到70%以上，如果达不到，免费为客户另行设计合成另外4对siRNA。
Figure 1. HeLa-S3 cells were plated out in 24-well plates at a
density of 6 x 104 cells in each well, 24 hours after transfection.
Cells were transfected with lamin A/C siRNA using the transfection
reagents indicated, according to the manufacturer’s protocol. mRNA
was purified from the cells 48 hours after transfection and
quantitative RT-PCR was performed using the QuantiTect SYBR Green
RT-PCR Kit with primers targeted to lamin
2. 体外转录法合成 siRNA
长链dsRNA合成
　　如果研究对象不是哺乳动物细胞，可以采用较长的双链RNA诱导RNAi现象。我们可以DNA
Oligo为模版，通过体外转录合成dsRNAs，成本相对化学合成法而言比较低。目前市场上有很多这样的体外转录试剂盒，像NEB，EPICENTRE都提供类似的试剂盒。
特异性siRNA合成
　　多数生物尤其是哺乳动物，siRNA仍是诱导RNAi的最佳选择。以DNA
Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，一般只需化学合成的siRNA量的1/10就可以达到同等的效果。这类方法主要适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，以及化学合成的价格成为障碍时。Epicentre
MessageMuter& shRNAi Production
Kit能高效地合成特异shRNA直接用于转染细胞，详见本刊“Epicentre最新的转录专家”介绍。
非特异性siRNA合成
　　特异性制备siRNA的方法的不足，是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs
“混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。这个方法通常选择200—1000碱基的靶mRNA模板，用体外转录的方法制备长片断双链dsRN A
，然后用RNase III (或 Dicer)（大肠杆菌RNase III是一种识别双链 RNA的内切酶，产物为
3’端外悬2-3个碱基的双链短片段）在体外消化，得到siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的长链dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，转染方法和特异性siRNA一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。NEB公司的ShortCut&
RNAi Kit，就是采用此类方法的试剂盒。
　　非特异性siRNA合成，尽管特异性不强，无法确知有效靶片段，但相对经济，基因沉默效率高；可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因沉默。
3．siRNA表达载体
　　化学合成与体外转录方法都是在体外得到siRNA后再导入细胞内，但是这两种方法主要有两方面无法克服的缺点：siRNA进入细胞后容易被降解；进入细胞siRNA在细胞内的RNAi效应持续时间短。针对这种情况，出现了质粒、病毒类载体介导的siRNA体内表达。该方法的基本思路是：将siRNA对应的DNA双链模板序列克隆入载体的RNA聚合酶III的启动子后，这样就能在体内表达所需的siRNA分子。这种方法总体的优点在于不需要直接操作RNA，能达到较长时间的基因沉默效果。
　　通过质粒表达siRNAs大都是用Pol III启动子启动编码shRNA(small hairpin RNA)的序列。选用Pol
III启动子的原因在于这个启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA，遇到4—5个连续的U即终止，非常精确。当这种带有Pol
启动子和shRNA模板序列的质粒转染哺乳动物细胞时，这种能表达siRNA的质粒确实能够下调特定基因的表达，可抑制外源基因和内源基因。采用质粒的优点在于，通过siRNA表达质粒的选择标记，siRNA载体能够更长时间地抑制目的基因表达。当然还有一点，那就是由于质粒可以复制扩增，相比起其它合成方法来说，这就能够显著降低制备siRNA的成本。
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