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联系信箱：CRISPR-Cas9基因敲除技术了解学习
我是有多么的打酱油，才能现在才了解到这个东西。。。。。。
Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats
(CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) systems.
(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)&是细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制。CRISPR/Cas9利用一段小&RNA&来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。
在1987年的一篇论文中，日本大学的研究人员报告了一项表面上微不足道的研究发现。他们在调查一种编码碱性磷酸酶的细菌基因序列时，发现了邻近的一个不同寻常的DNA片段，这一DNA片段中间是一段短直接重复核苷酸序列，两侧为短特异片段。他们当时指出“这些序列的生物学意义尚不清楚”。在几乎过去快30年后，这一最初看起来不起眼的研究发现，现在为简易操控大量生物体的基因组打开了大门。
1.&两篇science&文章证明CRISPR/Cas9系统在哺乳动物细胞有效
2013年2月15日发表在《科学》（Science）的两篇文章，证明Cas9系统能在293T,
K562, iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，非同源重组（NHEJ）、同源重组（HR）效率在3-25%之间，与TALEN酶切效果相当。文章还证明，多个靶点可以同时进行靶向酶切。这些工作将进一步靶向基因操纵推向高潮，使得多个基因敲除、敲入变得更为简单、高效。虽然目前，大家对该技术的特异性，免疫原性还了解甚少，但是随着研究的不断深入，一定会有很大的改善。在未来的2-3年，动植物育种、干细胞定向分化、遗传疾定点修复等等都将得到迅猛的发展。
RNA指导的CRISPR/Cas9基因剪切系统
图2.&利用CRISPRCas进行基因组工程，图中不同颜色的剪刀代表着不同的Cas9酶
RNA-Guided Human Genome Engineering viaCas9 Science. 2013 Feb 15
Multiplex Genome Engineering UsingCRISPR/Cas Systems Science. 2013
Feb 15 339(.
2.&模式动物构建革命：CRISPR/Cas技术一次性构建多突变转基因鼠
曾构建第一只转基因小鼠的Rudolf
Jaenisch教授采用CRISPR/Cas技术成功构建了同时携带多个基因突变的小鼠。CRISPR/Cas技术构建基因敲出小鼠的效率非常高，且可绕开胚胎干细胞操作过程。该技术将重新定义模式动物。
Rudolf Jaenisch教授是MIT怀特黑德研究所（WhiteheadInstitute）的创始成员，在1974年，他通过将SV40&病毒的DNA注射到小鼠的囊胚中，构建了第一只转基因小鼠，从而改变了遗传学研究。而现在，Rudolf
Jaenisch教授将再一次革新基因修饰模式动物的生产技术，甚至有可能重新定义哪些物种可以作为模式物种。“我们现在可以在三到四个星期内生产一只携带5个突变的小鼠，而传统的技术要达到这一目标需要花费3到4年。并且这一技术相当简单，甚至可能比传统方法还要简便。”
通过改变与特定疾病相关的基因，科学家们可以利用小鼠建立疾病模式。利用这些疾病模式动物，研究者可以对疾病的发生及发展，以及各种干预措施（包括遗传学与化学手段）对疾病的影响进行研究。在过去的20年中，建立疾病模式动物的方法基本没什么变化：首先将特定的DNA片段插入到小鼠胚胎干细胞中，在将修饰过的干细胞植入到早期胚胎（即囊胚）中，然后将发育中的细胞移植到雌性小鼠中。通过这种方式建立单基因敲出的小鼠品系可能需要花费数年和数十万美元的成本。并且这种基因敲出的技术还仅局限于小鼠、大鼠等少数物种中应用。
Rudolf Jaenisch教授实验室采用CRISPR/Cas技术绕过了胚胎干细胞操作过程，可快速而有效地建立携带多个基因突变的小鼠。这是CRISPR/Cas技术首次被用于多细胞生物的基因操作。
Jaenisch教授的学生Chikdu
Shivalila介绍，利用CRISPR/Cas技术构建基因敲出小鼠的效率非常高，“我们可以非常高效率地在四个位点上对两个基因进行敲出，效率达到了80%左右。如果利用TALENT技术，我们进行单基因敲出的效率只有30%。”&Shivalila相信这一技术将很快在需要建立基因突变鼠的研究机构中得到应用。
在目前的模式动物生产技术中，胚胎干细胞是一个绕不开的过程。而CRISPR/Cas技术则无需胚胎干细胞，因此遗传学研究可能将不再局限于有限种类的模式生物了。“这打破了模式生物的定义。现在，任何可以进行胚胎操作的动物都可以成为基因组工程的研究目标。由于许多动物的基因组已经完成测序，因此，利用这一技术我们可以在更多的物种中进行高效的遗传操作。”
同时研究者也指出，对于利用CRISPR/Cas技术构建模式动物还需要开展更进一步的研究，看是否存在预期外的效果，是否会对基因组产生设计外的改变。
vip-2013.&利用CRISPRCas系统快速和高效地培育转基因小鼠One-Step
Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes
byCRISPRCas-Mediated Genome Engineering. Cell, Volume 153, Issue 4,
910-918, 02May 2013
3. CRISPR/Cas技术灵魂人物——Feng
Zhang（张锋）
MIT麦戈文脑研究所（McGovernInstitute
for Brain Research）助理教授Feng
Zhang获得瓦利基金青年研究家奖（Vallee
Foundation Young Investigator Award）。Feng
Zhang目前的研究方向是设计新的分子工具来操控活体大脑，他同时也是布罗德研究所（Broad
Institute）的核心成员。
这位年仅31岁（2013）CRISPR/Cas技术灵魂人物到底有多NB，话不多说，直接来他实验室主页看
（真是高产啊，这里面的论文都可以免费下载的哦！！）
作为一个学习者，Feng
Zhang的两篇最新的CRISPR-Cas论文是必需要学习的：
2013.改善CRISPRCas系统基因组编辑准确性DNAtargeting
specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.NatBiotechnol
doi:10.1038/nbt.)
2013. 8月29日Cell新论文DoubleNicking
by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity.
Cell,29 August 6/j.cell.
文献太多，这里给3篇Feng Zhang的新论文全文！
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去年在华山医院进修时接触到沃登医学，当初对于有专业公司提供SCI论文服务挺排斥，经过他们的讲解想想无非是做辅助的服务，不涉及数据的编造，这种服务到是可以尝试着合作，毕竟现在确实已经是精细化分工的时代了。将自己曾经投稿的过一篇文章发给沃登后，与沃登开展了改写与投稿服务，合作过程到非常顺利，文章在5个月后收到期刊接收函（圈子比较小，期刊名就不列出来了）。对于沃登我的评价是：专业、守信、高效，今后将再有机会合作。沃登医学
手头上一篇文章投稿后1个月被拒，审稿人提出很多问题，要求补很多实验，这让我很头疼。经师兄介绍说沃登医学不错，先将文章和审稿意见一起交给沃登评估，沃登给出了很多意见，最重要的还是从结果解释入手，沃登推荐选择改写服务，经过一个月等待终于修改完成，改写后的文章完全颠覆了我之前的版本，行文也流畅清晰得多，沃登推荐投稿journal of surgical research(IF=2.018)，经过3个月的来回修改顺利接受。这次合作的感触是，文章写作就如讲故事，同样一个事件经过不同人的口吻叙述过后其趣味性亦有着很大不同，沃登医学是个会讲故事的专业机构 沃登医学
这已经是第三次找沃登医学了，和前两次一样依然合作的很开心。与沃登合作最让我放心的是沃登医学的专业性，现在网上有很多号称可以做SCI论文服务的公司，太多将精力放在获取利益上，且鱼龙混杂，一不小心就会被骗，文章还有可能被转卖。很多国外公司也都仅仅只能做语言服务，无法从专业上给予我们建设性的意见，而文章能否被接受80%得益于文章的学术水平，这是很多国外公司都无法办到的。无论在专业上还是语言上，沃登让我都很放心，愿沃登再接再厉，为中国科研提供更多更优质服务。
我的爱人曾经在沃登医学改写过一篇文章，文章投出去后2个月就接受，因此对沃登医学印象不错。后将我手头上的一些资料整理给沃登医学，选择了沃登的保证发表服务（虽然不算便宜），在7个月后文章成功发表，一切都非常顺利，为我节省很多精力，总体来说比较值。凡事用心做就肯定能做成，能感受到沃登医学是一家负责任的用心做事的专业公司。沃登医学
由于需要申请面上项目，之前发的文章都是2分以下，想要再网上突破有点乏力。经朋友介绍找到沃登医学，沃登帮助我重新设计了研究方案并给予了很多指导，最终我们成功合作发表一篇5分的SCI文章，非常感谢沃登医学朱经理，也感谢沃登医学的资深编辑美国安德森癌症研究中心的Dr.Chen，希望今后还有更愉快的合作！沃登医学
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CRISPR/Cas9意想不到的副作用 时间：
&&&&来自弗吉尼亚大学医学院的研究人员在《自然-生物技术》杂志上报告称，他们设计出了一种方法来检测风靡科学界的CRISPR/Cas9基因编辑系统，竟发现了其中意想不到的副作用。
&&& 称为CRISPR的基因打靶系统，可让我们编辑基因组中特定靶位点的遗传信息。这种新方法揭示的系统，有可能会结合意想不到的位点，导致其中一些位点发生基因突变，这些突变可能对药物疗法的研究与开发，产生严重的后果。
&&& 然而，这种新方法也可以确定一些途径，帮助阻止那些潜在危险的“脱靶”影响，让科学家们可以改进这种重要的新基因编辑系统所得到的结果。
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&
&&& 基因突变和如何避免它们
&&& 弗吉尼亚大学生物化学和分子遗传学系的Mazhar Adli解释说，基因操作的一个主要目标是纠正有害突变，所以避免突变的意外引入，是至关重要的。
&&& 他说：“我们知道，基因突变是疾病的标志。总体目标是，改变这些明显的遗传突变——去纠正这些突变。我们想，仅在靶向空间、靶向位点改变这些信息。如果你想改变任何其他信息，从根本上说，你就会引入你不想要的突变。你纠正一个基因，可能你就会在10个其他基因和基因组中的其他许多部位引入突变。”
&&& CRISPR：“研究的圣杯”
&&& Adli的新研究，揭示了CRISPR/Cas9基因编辑系统潜在的脱靶作用。该系统非常的受欢迎，因为它可让科学家操作活体哺乳动物基因组的特定部分，成为科学研究一种极其重要的工具。它已被迅速而广泛地采用，包括用于人类细胞研究，因为它相对简单，许多实验室都有资源来使用它。
&&& Adli称：“从根本上说，你可以靶定活细胞中的任何基因组区域，并改变遗传信息，这在过去几十年里一直是研究中的圣杯。从根本上说，能够靶定和改变活细胞中的遗传信息，是一个梦想。”
&&& 这一新研究有助于解释支持CRISPR系统的机制，以及为什么它很容易受到脱靶基因突变的影响。
&&& Adli称：“我们不仅发现了它在基因组中的结合区域，还研究了为什么它定位到基因组中的这些区域。通过分析这些脱靶效应背后的特定序列，我们也找出了决定因素——为什么它靶定目标，而且也转到这些脱靶区域？我们的研究表明，它定位在那里，是因为与原始靶向区域的一些相似性。”
&&& “所以，我们的结果将有助于提高系统的特异性，以使我们能够最大限度地减少脱靶。”
&&& 主要的突变影响
&&& Adli的这项研究也表明，在CRISPR系统使用的一种关键酶的自然野生型，与其改变的、不常用的酶形式相比，可引入更多的突变。前者在基因编辑过程中，切割DNA的双链，使突变发生，而后者只切割DNA的单链，使细胞能够修复损伤，而不引入突变。
&&& 他说：“很遗憾，野生型（自然发生的酶）更容易处理。所以，该领域的每个人都使用野生型酶。现在这篇论文和其他即将发表的论文中，他们将要停止使用野生型酶。他们必须使用改变了的酶形式，来克服脱靶效应。”
&&&沃登阅读：
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电子邮件： &&公司地址：上海市徐汇区桂平路333号7号楼101-102室&&
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CRISPR/Cas9基因敲除、敲入怎么做，原理？
百马sirR083
基因工程技术
用限制性核酸内切酶（限制酶）敲除
DNA连接酶敲入
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