甲醛染毒对人支气管上皮细胞16HBE细胞因子水平的影响论文_图文_百度文库
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甲醛染毒对人支气管上皮细胞16HBE细胞因子水平的影响论文
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验证码输入错误，请重新输入伐昔洛韦对猪伪狂犬病病毒复制的抑制作用
本研究确定伐昔洛韦的体外和体内抗猪伪狂犬病病毒作用，确定伐昔洛韦对Vero细胞的最大无毒质量浓度为4g L，抑制PRV野毒在Vero细胞中复制的最低有效质量浓度为3g L。
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杨盼盼，万文妍，高冬生，郑关民，常洪涛，杨霞，陈陆，赵军，王川庆河南农业大学牧医工程学院　　猪伪狂犬病（porcine pseudorabies，PR）是由猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）引起的一种以仔猪发热，脑脊髓炎及妊娠母猪流产为主要特征的急性传染病。本病广泛分布于世界各地，猪群一旦发生该病，将很难根除，给养猪业造成了巨大的经济损失［1］。2000年前，我国养猪业因对PRV认识不足，也未很好进行PRV预防接种，一些大型集约化猪场母猪流产、死胎率高，新生仔猪大规模死亡。之后，由于灭活苗、自然基因缺失弱毒苗及人工基因缺失活疫苗的广泛使用，PRV所引起的直接危害得以控制。但近年来，特别是2011年底以来，我国多个省份相继出现伪狂犬疫情明显增加的情况［2-3］，不少猪场伪狂犬野毒感染率显著上升。目前，国内兽医科研人员正对PRV野毒株的变异情况、现有PR疫苗对PRV野毒株的免疫效力等方面进行集中和深入研究［4-6］。但有关PRV的化学药物防治方面的研究报道不多。　　PRV属于疱疹病毒科的α-疱疹病毒亚科，只有1个血清型。其毒力由几种基因衆-同控制，主要有糖蛋白gE、gD和gI，以及胸苷激酶（thymidine kinase，TK）基因，其中TK基因是主要的毒力基因。对PRV增殖、复制、潜伏感染及激活有重要作用［７］。因此，TK基因常被作为疱疹病毒化学治疗和构建疱疹病毒基因缺失疫苗的首选靶基因。伐昔洛韦（Valacyclovir）是鸟嘌呤类似物类抗病毒药物，在医学临床上广泛用于I型、II型单纯疱疹病毒感染和水痘带状疱疹感染的治疗［８］。　　本试验对伐昔洛韦的体外和体内抗PRV作用进行了研究，以期为药物控制PRV临床急性感染和降低猪群PRV野毒阳性率提供参考。　　1　材料与方法　　1.1　材料与试剂　　非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）购自美国标准生物品收藏中心（ATCC）；PRV QYY株由本实验室分离鉴定和保存；BALB/c小鼠购自河南省实验动物中心；DMEM培养基、胎牛血清、胰酶、青霉素和链霉素购自Gibco公司；盐酸伐昔洛韦购自Sigma公司；细胞增殖与活性检测试剂盒（CCK-8）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；病毒基因组提取试剂盒（QIAamp DNA Blood MiniKit）购自Qiagen公司；抗鼠CD3-FITC、CD4-PE、CD8-PercP、IFN-γ-APC、IL-2-APC单克隆抗体、BDCytofix/CytopermTM溶液和BD Perm/WashTM缓冲液购自BD Biosciences。　　1.2　伐昔洛韦对Vero细胞毒性试验　　Vero细胞在96孔细胞培养板中用含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素，100g/mL链霉素的DMEM培养基于5％CO2，37℃条件下培养至长满单层，弃去培养基，PBS洗2遍，每孔加入100μL含有不同伐昔洛韦（0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L、1.6g/L、2.0g/L、2.5g/L、3.0g/L、4.0g/L、5.0g/L、6.0g/L）的DMEM培养基，每个浓度设6个重复，并设立不加药物空白对照组，5％CO2培养箱内37℃继续培养48h，培养期间显微镜下观察细胞形态的变化；弃去药物，PBS洗3遍，每孔加入100μL DMEM基础培养基与1％CCK-8试剂，37℃避光作用1h，Multiskan Go全波长酶标仪（Thermo）检测各细胞孔的D490值，根据下述公式评估伐昔洛韦对细胞的毒性，伐昔洛韦对细胞的生长抑制率＝（空白对照组D490值?-试验组D490值）/空白对照组D490值。　　1.3　PRV QYY株TCID50的测定　　将Vero细胞在96孔细胞培养板中培养至长满单层，将病毒液进行10倍倍比稀释，接种稀释度分别为10?-1～10?-8的病毒液，0.1mL/孔，每个稀释度6个重复，于5％CO237℃继续培养72h，每天观察细胞病变效应（CPE）。按Reed-Muench公式计算：TCID50＝lg［CPE＞50％病毒稀释度＋（CPE＞50％的百分数?-50）/（CPE＞50％的百分数?-＜50％的百分数）］。　　1.4　伐昔洛韦完全抑制PRV产生细胞病变的最小有效浓度　　将Vero细胞在12孔细胞培养板中培养至长满单层，每孔细胞感染100TCID50PRV，37℃作用1h，弃去病毒液，PBS洗3遍，然后覆盖含有不同浓度伐昔洛韦的1％羟甲基纤维素钠的营养层，每个药物浓度设3个重复，细胞于5％CO237℃继续培养72h，轻轻弃去营养层，PBS洗3遍，每孔加入4％甲醛，室温静置30min，弃去甲醛，每孔加入1mL 1％结晶紫，避光作用20min，洗去染液后观察不同浓度药物对PRV的抑制作用，并计数各试验组的空斑，利用如下公式计算药物对PRV抑制率：蚀斑抑制率（%）＝（病毒对照组蚀斑均数—药物处理组蚀斑均数）/病毒对照组蚀斑均数×100％。　　1.5　伐昔洛韦对PRV在Vero细胞中复制的抑制效果　　为了验证伐昔洛韦对PRV在Vero细胞中复制的抑制作用，本研究利用PRV gD基因特异性引物进行PCR，检测不同浓度药物处理过的PRV感染细胞中的病毒载量。Vero细胞在12孔细胞培养板中培养至长满单层，每孔细胞感染100×TCID50PRV，37℃作用1h，弃去病毒液，PBS洗3遍，每孔加入含有不同浓度伐昔洛韦的维持液继续培养，每个药物药物浓度设3个重复；当不加药孔细胞90％出现CPE时，收集各组细胞，病毒基因组提取试剂盒提取病毒基因组，根据Genebank已公布PRV gD基因（GenBank No.AJ271966）序列设计上游引物5′-AACGACGAGAGCTTCAG-3′和下游引物5′-CGACGCCGGTACTC-3′扩增802bp大小的gD基因。扩增体系为100ng DNA模板，25μL2×GC PCR Buffer，上、下游引物各1μL，1μLdNTP Mix，0.25μL rTaq聚合酶，，加双蒸水至50μL。反应条件：95℃预变性1min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个裓-环，72℃延伸10min。　　同时，利用猴甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因作为PCR反应的内参，利用引物5′-ATCACCATCTTCCAGGAGCGAGA-3′和5′-GCTTCACCACCTTCTTGATGTCA-3′扩增273bp的GAPDH基因片段。反应采用与扩增gD基因反应等量的模板。反应条件如下：95℃预变性1min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃40s，进行30个裓-环，72℃延伸10min。　　1.6　PRV对小鼠半数致死量（LD50）的测定　　取64只20g左右BALB／c小鼠，随机平均分成8组，第1组～7组小鼠分别每只肌注100×TCID50、200×TCID50、300×TCID50、400×TCID50、500×TCID50、600×TCID50、700×TCID50，第8组小鼠肌注等体积DMEM基础培养基。每天观察并记录小鼠死亡状况，Reed-Muench法计算PRV对小鼠的LD50。　　1.7　伐昔洛韦能够为小鼠提供完全保护的最低剂量　　取54只20g左右BALB/c小鼠随机平均分成10组，1组～9组每只小鼠肌注1个LD50的PRV，在攻毒后48h分别灌入0.5mg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg、4mg伐昔洛韦及等体积无菌双蒸水，10组肌注与1个LD50的PRV等量的DMEM培养基及无菌双蒸水，连续观察7d，每天记录小鼠死亡状况，确定了伐昔洛韦能够为小鼠提供完全保护的最低剂量。　　1.8　伐昔洛韦在小鼠体内抗PRV效果　　取45只20g左右BALB/c小鼠，随机平均分成3组，A、B组每只小鼠肌注1个LD50的PRV，C组肌注等量DMEM培养基；48h后A组和C组小鼠口服最低有效保护剂量的伐昔洛韦，B组小鼠口服等量无菌双蒸水，每天观察并记录小鼠健康状况，并在攻毒后48h、60h、72h、90h、114h每组剖杀3只小鼠，取其脑、肺、淋巴组织进行PRV病毒载量分析，组织病理学检查和淋巴细胞表达细胞因子情况分析。　　1.8.1　Real-time PCR检测脑、肺组织中PRV载量　　根据Genbank已公布PRV IE180基因（AF）和小鼠GAPDH基因序列（NG_）分别设计实时荧光定量PCR引物。PRV IE180基因上、下游引物分别为：5′-CCATTGGTCCGCTTACCTGG-3′和5′-GTCTCCAGGCCCAGACAAA-3′，小鼠管家基因GAPDH上、下游引物分别为：5′-CAATGTGTCCGTCGTGGATCT-3′和5′-TTGAAGTCGCAGGAGACAACC-3′。使用Qiagen基因组试剂盒提取不同时间点剖杀小鼠的脑、肺组织总DNA，分别用上述IE180和GAPDH引物进行RT-PCR反应，反应体积为20μL，反应体系含样本DNA2μL，SYBR GREEN 16.4μL，10pmol/Ｌ引物各0.8μL。反应条件为：42℃5min，95℃10s，95℃5s，60℃34s，共40个裓-环。反应结束后进行熔解曲线分析，以鉴定PCR产物的特异性。使用Sequence Detection System 软件分析PCR过程各检测样本的Ct（threshold of cycle）值，选择攻毒后48h检测样品作为基准值，按照如下公式进行数据分析：Con△Ct=Con Ct?-Con GAPDH Ct；样本△Ct=样本Ct?-样本GAPDH Ct；样本△△Ct=样本△Ct?-Con△Ct；2-△△Ct法计算攻毒后不同时间点小鼠脑、肺部PRV DNA含量相对于48h的基因组拷贝数。　　1.8.2　小鼠脑、肺组织病理变化　　将不同时间点剖杀小鼠脑、肺组织用10％福尔马林固定，按照常规方法制备组织切片，进行HE染色，并显微镜观察组织病理变化。　　1.8.3　小鼠Ｔ淋巴细胞分泌细胞因子动态分析　　从不同时间点剖杀小鼠的脾脏分离淋巴细胞，调整106cell/管，热灭活PRV刺激1h，加入终质量浓度为10mg/L的蛋白转运抑制剂BFA；继续培养4h后分别加入0.25μg不同荧光标记的抗鼠CD3、CD4、CD8单克隆抗体，室温避光孵育20min。1500r/min离心5min，弃上清，细胞用2mL含有3％BSA的PBS洗涤1次，加入0.5mL BD Cytofix/CytopermTM溶液，固定20min，1500r/min离心5min，弃上清，每管再加入2mL 1×BD Perm/WashTM缓冲液，4℃避光孵育15min，1500r/min离心5min，弃上清，每管加入0.25μg APC标记的抗鼠IFNγ或IL-2单抗，混匀，4℃避光孵育30min，2mL 1×BD Perm/WashTM缓冲液洗1次，最后加入0.5mL 1％多聚甲醛固定液固定，BDFACS AriaIII流式细胞仪检测样品，运用FCS Express 4软件进行数据分析。　　2　结果　　2.1　伐昔洛韦对Vero细胞的最大无毒质量浓度　　为了确定伐昔洛韦对Vero细胞的活力和增殖的影响，本研究检测了不同浓度伐昔洛韦作用下的Vero细胞的形态和增殖情况，随着伐昔洛韦质量浓度的增大，Vero细胞的增殖逐渐受到抑制，最终确定伐昔洛韦对Vero细胞的最大无毒质量浓度为4g/L（图1）。图1　伐昔洛韦对Vero细胞增殖的影响　　2.2　PRV TCID50　　培养72h后，测得PRV的TCID50为10?-7/0.1mL。　　2.3　伐昔洛韦完全抑制PRV的最低有效质量浓度　　所测得PRV QXX株的利用100×TCID50PRV感染Vero细胞，通过检测不同质量浓度伐昔洛韦对病毒形成蚀斑的抑制作用，计算药物对PRV抑制率，确定伐昔洛韦完全抑制PRV的最低有效质量浓度为3g/L（图2）。图2　伐昔洛韦对PRV在Vero细胞中复制的抑制效果　　2.4　伐昔洛韦对PRV在Vero中复制的抑制效果　　对不同质量浓度的伐昔洛韦抑制PRV复制进行转录水平上的检测，结构基因gD及管家基因GAPDH扩增后经琼脂糖凝胶电泳，结果表明：随着药物质量浓度的增加，PRV gD基因的扩增受到抑制程度增加，当使用完全抑制PRV的最低有效质量浓度时，PRV的gD基因的扩增几乎受到完全抑制。但管家基因GAPDH的扩增始终未受到影响（图3）。这说明药物对PRV复制抑制具有特异性。图3　从伐昔洛韦处理的PRV感染Vero中PCR扩增PRVgD基因M.DL2000DNA Marker；1～8：0.2g、0.4g、0.6g、0.8g、1.6g、2.0g、2.5g、3.0g/L伐昔洛韦2.5　PRV肌肉注射小鼠LD50与伐昔洛韦对小鼠提供完全保护最低给药量确定通过给不同组小鼠分别肌肉注射100×TCID50、200×TCID50、300×TCID50、400×TCID50、500×TCID50、600×TCID50、700×TCID50PRV，每天观察并记录小鼠死亡情况，Reed?-Muench法计算出PRV肌肉注射小鼠LD50为500×TCID50。每只小鼠按照分组分别肌肉注射1个LD50的PRV，在攻毒后48h口服0.5mg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg和4mg伐昔洛韦，7d内连续记录每组小鼠发病和死亡情况。结果显示，7d内伐昔洛韦能够为小鼠提供完全保护的最低剂量为3mg/只（表1）。　　2.6　Real-time PCR检测脑、肺组织病毒载量　　利用荧光定量实时PCR对不同时间点所取小鼠脑、肺组织中的PRV病毒载量进行检测。计算出攻毒后不同时间点小鼠脑、肺部PRV DNA含量相对于攻毒后48h的相对基因拷贝数。结果显示，接毒未给药组小鼠在攻毒后60h、72h、90h、114h小鼠脑、肺部PRV DNA含量相对于48h均在不断增加，而接毒给药组小鼠在攻毒后脑、肺部PRV DNA含量相对虽然有少量增加，但在72h之后迅速降低，且在攻毒后90h和114h时小鼠脑、肺部PRV DNA含量显著低于48h相应组织中的PRV DNA含量（图4）。表1　伐昔洛韦在小鼠体内完全抑制PRV复制的最小有效浓度图4　脑、肺组织中PRV病毒载量动态变化2.7　脑、肺组织病理变化　　在攻毒后114h剖杀接毒未给药组小鼠，组织切片显示脑部血管周围有淋巴细胞浸润，呈现明显的“袖套”现象，且神经胶质细胞增生（图5C）；肺部肺脏充血，肺泡腔水肿（图5F）。而正常对照组和PRV接毒后伐昔洛韦给药组小鼠相应组织未出现上述病理变化。图5　试验小鼠脑和肺组织病理学变化（HE 200×）注：A.未接毒给药组小鼠脑组织；B.接毒给药组小鼠脑组织；　　C.接毒未给药组小鼠脑组织；D.未接毒给药组小鼠肺组织；E.接毒给药组小鼠脑组织；F.接毒未给药组小鼠脑组织　　2.8　小鼠Ｔ淋巴细胞分泌细胞因子动态分析　　为了评估小鼠攻毒和伐昔洛韦给药后体内淋巴细胞PRV抗原的免疫反应，采用细胞流式技术检测了攻毒和给药后不同时间点所取小鼠淋巴细胞对PRV抗原体外刺激产生的细胞因子。结果显示，给药组和未给药组小鼠脾淋巴细胞在PRV感染后72h内诱生Th1型淋巴因子IFN-γ和IL-2的水平均逐渐增高；但在72h后，伐昔洛韦给药组小鼠CD4和CD8T淋巴细胞分泌PRV特异性IFN-γ及IL-2的水平却逐渐下降，未给药组小鼠CD4和CD8T淋巴细胞分泌PRV特异性IFN-γ及IL-2的水平一直维持增高状态（图6A～图6D）。图6　PRV特异性T淋巴细胞反应　　3　讨论　　PR是危害我国养猪业重要传染病之一，本世纪初曾在我国大面积暴发。2011年以来，我国突然再次暴发，此次流行突出表现在普防猪伪狂犬疫苗的猪群中，猪伪狂犬野毒的阳性率依然维持相当高或持续升高的状态，并出现免疫母猪群大比例流产和中大猪死亡情况，这给我国养猪业尤其是种猪行业造成巨大损失。国内众多研究者已经相继分离出PRV变异强毒，针对变异强毒的新型疫苗研究尚在研究之中［9-10］。鉴于现有疫苗不能对PRV感染猪群提供完全保护的现状，研究能够控制PRV急性感染和降低猪群PRV野毒阳性率的新途径显得尤为重要。伐昔洛韦是鸟嘌呤类似物类抗病毒药物，为阿昔洛韦酯化物，在体内通过首过效应被酯酶转化为阿昔洛韦。但伐昔洛韦的口服生物利用度（约55％）显著高于阿昔洛韦（10％～20％）。该品进入疱疹病毒感染的细胞后，与脱氧核苷竞争病毒胸苷激酶（TK），药物被磷酸化成活化型阿昔洛韦三磷酸酯，然后通过干扰病毒DNA多聚酶和DNA多聚酶作用下，与增长的DNA链结合，引起DNA链的延伸中断两种方式抑制疱疹病毒复制［11］。伐昔洛韦对疱疹病毒有特殊的亲和力，但对哺乳动物宿主细胞毒性低。经口服吸收后，药物能广泛分布至各组织与体液中，包括脑、肾、肺、肝、肠、脾、乳謀-、子宫、阴道粘膜与分泌物、脑脊液。药物还可通过胎盘。而这些组织和体液中也恰是PRV感染机体后的常在之处，因此伐昔洛韦的抗PRV作用也更加具有针对性和特异性。伐昔洛韦在人医临床中用于单纯疱疹和带状疱疹感染的治疗已经非常成熟，且被证明是安全和有效的［12-16］。　　尽管人医临床使用伐昔洛韦控制疱疹病毒的急性和慢性感染已经非常成功，但伐昔洛韦对于控制同属疱疹病毒科成员的PRV的感染是否具有同样的功效目前尚未见报道。　　本课题组前期研究在利用TK基因作为外源基因插入位点制备重组PRV过程中，发现伐昔洛韦能够有效抑制TK＋PRV的复制，并由此建立了快速筛选TK?-重组PRV的方法。在此基础上，本文开展了伐昔洛韦抑制PRV野毒复制的研究。研究结果表明，伐昔洛韦能够特异性抑制TK＋PRV在敏感细胞中的复制。随着细胞培养基中伐昔洛韦质量浓度增加，PRV在细胞中复制的能力逐渐降低，3g/L的伐昔洛韦能够完全抑制TK＋PRV在Vero细胞中的复制。在小鼠感染PRV野毒试验中，采用1个LD50的PRV野毒对小鼠攻毒后，伐昔洛韦给药组小鼠没有出现任何PR临床症状并全部存活，脑、肺组织中的病毒载量显著低于攻毒未给药组小鼠相应组织中的病毒载量。组织病理切片也显示，攻毒后给服伐昔洛韦组小鼠的脑、肺组织结构与正常对照小鼠没有差别，而攻毒后未给药组小鼠临床表现明显的啃咬注射部位、神经麻痹等症状，并全部死亡。发病和死亡小鼠的脑部组织脑部血管周围有淋巴细胞浸润，呈现明显的“袖套”现象，且神经胶质细胞增生；肺部组织呈现充血，肺泡腔水肿等病理变化。　　本研究还利用流式细胞技术检测了试验小鼠在攻毒与给服伐昔洛韦后脾脏淋巴细胞对PRV抗原的记忆性免疫反应。在PRV感染后的急性期内，脾脏CD4和CD8T细胞所产生的Th1型细胞因子水平逐渐增高，但随后由于伐昔洛韦在体内对病毒复制的抑制作用，使病毒抗原量大为减少，从而使PRV抗原特异性T细胞数量减少。因而伐昔洛韦给药组小鼠脾脏淋巴细胞分泌Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2的水平逐渐降低，而攻毒后未给服伐昔洛韦的小鼠脾脏中PRV特异性T淋巴细胞随着病毒不断复制和PRV抗原量的增加而增多，相应T细胞亚型分泌Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2的水平也持续升高。该结果从另一个方面说明了伐昔洛韦能够有效控制PRV急性感染。　　综上所述，伐昔洛韦无论体外或是体内，均能有效抑制PRV野毒的复制，并减轻由于病毒感染所造成的相应组织的损伤，且该药对动物机体并不产生副作用。本研究结果为兽医实践为药物控制PRV临床急性感染和降低猪群PRV野毒阳性率提供参考；同时，由于伐昔洛韦对TK-PRV，如TK基因缺失的PRV疫苗毒株没有抑制作用，因此，本研究结果也为利用TK基因缺失疫苗防控PR提供辅助措施。　　参考文献　　[1] 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