OPAQUE-2基因在毕赤酵母中的表达与opaque2-糯玉米NILs的创制和鉴定--《中国农业科学院》2014年硕士论文
OPAQUE-2基因在毕赤酵母中的表达与opaque2-糯玉米NILs的创制和鉴定
【摘要】：巴斯德毕赤酵母表达系统是上世纪80年代发展起来的一种新型外源蛋白表达系统，它在蛋白质表达方面具有许多的优点，如操作技术简单、易于培养、成本低、外源蛋白表达量高、可以对结构复杂的外源蛋白质进行深加工等，所以越来越受到研究者们的青睐。如果利用该系统能够成功诱导出玉米OPAQUE-2（O2）蛋白，对于其结构和功能的深入研究将具有一定的意义。
Opaque-2蛋白作为一种转录因子在玉米代谢途径中具有重要的调控作用，而其opaque2（o2）突变体中赖氨酸和色氨酸等必须氨基酸的含量也大幅度提高。当前玉米已经成为我国第一大粮食作物，其中的一些优质专用型玉米特别是糯玉米市场需求量也在加大，但是糯玉米的营养价值特别是人体所必需的氨基酸-赖氨酸的含量还比较低，如果在产量提高的同时能够通过o2结合分子标记辅助育种技术改善糯玉米的营养结构，创造出一种兼具糯玉米和高赖氨酸玉米优良特性的玉米类型，有望进一步提高糯玉米的品质和商品价值。
本文章的主要研究结果如下：
(1)成功构建了pPIC9-O2酵母重组表达载体，经电转化进酵母菌株GS115后，在甲醇浓度（5%）诱导下外源O2蛋白可成功获得表达，经SDS-PAGE电泳检测在47KD处有明显的目的蛋白条带。
(2)利用分子标记辅助育种技术成功构建5套o2糯玉米近等基因系，同时利用改良的DBL法对其中种子量较多的3套o2糯玉米近等基因系中赖氨酸的含量进行了测量，这3套近等基因系中赖氨酸的含量分别较其轮回亲本QN102、QN106和QN107提高了45.7%、51.6%和33.3%，由原来的0.35%、0.31%和0.35%提高到0.51%、0.47%和0.46%。
(3)赵OP-6/o2o2的遗传分析表明该近等基因系与轮回亲本赵OP-6的遗传背景相似性可以达到88.4%，同时RT-PCR的结果表明在赵OP-6/o2o2中O2基因的表达受到抑制，而WX基因的表达与轮回亲本一致，表明这两个基因间可能没有相互作用或作用不明显。
(4)赵OP-6/o2o2虽然在水分、粗脂肪、粗蛋白质、粗淀粉等含量，以及支链淀粉/总淀粉（%）的比例与赵OP-6无明显差别，但17种氨基酸中人体所必需的赖氨酸含量比轮回亲本提高了51%，达到0.47，表明糯玉米的营养价值有了很大的提高。此外，作为商业品质的籽粒表型二者间也没差异，都为乳白色蜡质透明籽粒。
（5）SDS-PAGE电泳分析发现在OP-6/o2o2中，醇溶蛋白的α亚基和β亚基的合成较轮回亲本受到明显的抑制作用，导致蛋白体体积减小，而27KD-γ-Zein含量的提高又使得蛋白体的数量增多。此外通过蛋白质双向电泳和质谱检测技术我们发现了其它众多的受O2蛋白直接或间接调控的蛋白质，这些蛋白能够参与机体不同的代谢途径，说明O2基因具有多效性。
(6)扫描电镜下赵OP-6/o2o2淀粉颗粒多为方形或多边形的，镶嵌于基质蛋白鞘中，内部细胞排列紧密；而赵OP-6的淀粉颗粒则多为圆球形，细胞排列较为疏松。透射电镜下赵OP-6/o2o2的蛋白体的体积虽然较亲本显著减小，但是数量却明显增多，并且蛋白体的形状仍为圆球形。
【关键词】：
【学位授予单位】：中国农业科学院【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2014【分类号】：S513【目录】：
摘要6-7Abstract7-15第一章 引言15-26 1.1 玉米概述15 1.2 糯玉米概述15-16 1.3 高赖氨酸玉米的发现16-18
1.3.1 O2 基因及其作用机理的研究17-18
1.3.2 opaque-2 修饰基因的研究18 1.4 玉米 Bg-rbg 转座系统18-19 1.5 糯玉米 WX 基因及与 OPAQUE-2 基因互作的研究19-20 1.6 巴斯德毕赤酵母表达体系20-23
1.6.1 常用表达菌株及载体21-22
1.6.2 外源蛋白在毕赤酵母中的表达22-23 1.7 研究目的和内容23-26
1.7.1 研究目的23
1.7.2 研究内容23-25
1.7.3 技术路线25-26第二章 玉米 OPAQUE-2 基因在毕赤酵母中的表达26-35 2.1 材料和方法26-29
2.1.1 试验材料26-27
2.1.2 方法27-29 2.2 结果与分析29-34
2.2.1 玉米籽粒总 RNA 的提取及目的片段的获得29-30
2.2.2 表达载体 pPIC9-O2 的构建及分析30-31
2.2.3 酵母转化子菌落 PCR 鉴定31
2.2.4 重组酵母在生长培养基中的生长曲线31-32
2.2.5 目的基因在毕赤酵母中的诱导表达32-34 2.3 讨论与结论34-35第三章 含有 o2 的糯玉米近等基因系（NILs）的创制35-47 3.1 材料与方法35-40
3.1.1 实验材料35-36
3.1.2 方法36-40 3.2 结果与分析40-45
3.2.1 SSR 分子标记在供体与受体间遗传多态性分析40-41
3.2.2 利用引物 phi057 检测 QN106 回交和自交的穗行41-42
3.2.3 构建成功的 5 套 o2 糯玉米近等基因系的基因型鉴定42-43
3.2.4 受体亲本和 3 套近等基因系籽粒赖氨酸含量的测定43-45 3.3 讨论45-47
3.3.1 分子标记辅助育种在构建 o2-wx 近等基因系中的应用45-46
3.3.2 供受体材料及近等基因系间赖氨酸含量的比较分析46-47第四章 含有 o2 的糯玉米近等基因系（NILs）的鉴定47-69 4.1 材料与方法47-52
4.1.1 实验材料47-48
4.1.2 方法48-52 4.2 结果与分析52-65
4.2.1 遗传、基因型及基因表达分析52-54
4.2.2 o2-wx 近等基因系的品质和生化分析54-64
4.2.3 o2-wx 近等基因系与供受体亲本亚显微结构的比较分析64-65 4.3 讨论65-69
4.3.1 分子标记辅助育种在遗传背景选择中的应用65-66
4.3.2 opaque-2 基因的渗入对糯玉米品质及亚显微结构的影响66-67
4.3.3 opaque-2 基因的渗入对糯玉米自身蛋白质表达的影响67-69第五章 全文结论69-70参考文献70-77附录77-89致谢89-90作者简历90
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