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　　作者：解螺旋.流氓兔 解螺旋原创
　　转载请注明来源：解螺旋，医生科研助手
　　作为资深分子生物学菜鸟，qPCR一直是心中的痛。从RNA抽提到逆转录再到加样以及数据分析，好像每一步都可以让整个实验挂掉。引物设计是非常重要的一个环节，之前解螺旋也给大家分享了多种引物设计的软件以及方法。听了这么多道理，然而我依然设计不好引物……
　　那么问题来了，有没有比这些更简单粗暴的引物获取方法呢？如果你是一只懒癌患者以及只是用到那么一两次需要自己设计qPCR引物，那么本文相当地适合你。分分钟搞定qPCR引物。
　　这个神器就是primerbank。网址：
　　http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
　　这是哈佛大学的一个qPCR引物数据库，目前有超过20万条引物，涵盖了人和小鼠大部分已知的基因。根据网站上对两万多对引物的验证结果，引物有效率为82.7%。当然他们只验证了小鼠的引物。
　　我们如何从上面获取所需的qPCR引物呢？
　　回到首页，可以看到有三个可选择的框框，搜索类型，物种，以及输入框。
　　搜索类型这里，可以根据GenBank accession、NCBI protein accession、NCBI gene ID、primerbank ID、NCBI gene symbol以及keyword六个选项进行搜索。比如我们选择keyword，搜索小鼠的beta-actin。
　　出来就是酱紫的：
　　居然木有！！不是说好涵盖大部分基因的咩！居然木有！！
　　好吧，实际上是为嘛呢，是因为keyword的搜索并不准确，比如beta-actin我们可能写成β-actin，primerbank识别不了，自然就找不到引物了。这样其他的几个搜索类型就派上用场了。比如我们选择NCBI gene ID对β-actin进行搜索：
　　首先我们要到NCBI上去找出来β-actin的gene ID，如图，选择gene,输入beta-actin：
　　出来是酱紫的：
　　一堆一堆的结果。我们点击右边的分类musmusculus：
　　结果就出来了，小鼠beta-actin的NCBI gene ID是11461，而actb则是小鼠beta-actin的NCBI gene symbol。我们把11461输入到primerbank里面试试：
　　结果是酱紫的：
　　在这个结果上我们可以看到beta-actin的NCBI gene ID、GenBank accession、NCBI protein accession、coding DNA length等信息。输入beta-actin的NCBI genesymbol actb：
　　结果是酱紫的：
　　实际上跟上面的NCBI gene ID搜出来结果一样，往下拉我们还能看到经过验证的引物：
　　点进去可以看到溶解曲线、电泳结果等信息：
　　尽量选择这种验证过的引物，品质比较有保障。但是对于人来说是没有经过验证引物的，不放心的话怎么办呢？回到我们前面所讲的《如何用primer-blast设计和验证引物》进行验证一下就好啦。是不是so easy，老板再也不用担心我搞不定qPCR引物了。
　　嗯，实际上，这是授人以鱼，如果要学会捕鱼的话，还是认真学学我们前面的两篇引物设计的文章吧！
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软件下载：
&&& 闪晶公司拥有自主知识产权的一款基因合成设计软件，可以分析序列中的GC含量和序列比对，同时还可以进行序列拼接，是研究人员的理想助手。
&&& ABI格式文件、测序结果的显示与编辑软件。
&&& DNA Club是一个简单的对DNA进行与PCR有关的操作的软件。它的功能有： 1、输入DNA序列； 2、查找ORF序列； 3、把DNA翻译成蛋白序列； 4、查找酶切位点； 5、查找PCR引物序列。 功能虽然都很简单，但非常实用，一般的用户都可以很方便地使用。
&&&&DNAMAN美国Lynnon Biosoft公司开发的高度集成化的分子生物学应用软件，几乎可完成所有日常核酸和蛋白质序列分析工作，包换多重序列对齐、PCR引物设计、限制性酶切分析、蛋白质分析、质粒绘图等。该软件是所有生物信息学研究人员所必备的，强烈推荐使用!!
Primer Premier5.0是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计和评估的软件，和Plasmid Premier2.02一起是该公司推出的最新的软件产品。其主要界面同样也是分为序列编辑窗口（Genetank），引物设计窗口（Primer Design），酶切分析窗口（Restriction Sites）和Motif分析窗口。这里我们主要介绍其引物设计功能，顾名思义，该软件就是用来进行引物设计的。可以简单地通过手动拖动鼠标以扩增出相应片段所需的引物，而在手动的任何时候，下面显示各种参数的改变和可能的二聚体、异二聚体、发夹结构等。也可以给定条件，让软件自动搜索引物，并将引物分析结果显示出来。而且进行这些操作非常简单。其功能绝不在Oligo 5.0之下！（该软件暂时不提供下载)闪晶生物同时提供免费引物设计和有偿服务，欢迎垂询。
&&& 引物分析著名软件，主要应用于核酸序列引物分析设计软件，同时计算核酸序列的杂交温度（Tm）和理论预测序列二级结构。
&&& 实时荧光定量PCR分子信标(Molecular beacon )及TaqMan探针设计软件 (注：如需要破解，请来信告知机器号，闪晶生物可以提供激活码。闪晶生物同时提供免费分子信标设计服务和有偿合成修饰服务，欢迎垂询。
&&&&这是ABI公司销售附送的软件，可用于设计引物和探针，尤其适用于荧光PCR探针的设计，可以精确计算寡核苷酸与荧光基团鳌合后的Tm值。可以预测引物与引物之间与模板之间等的二级结构。（该软件暂时不提供下载）；闪晶生物同时提供免费TAQMAN-MGB探针设计服务和有偿TAQMAN-合成修饰服务，欢迎垂询。
&&& 做荧光定量PCR时，对Tm值的判断始终是困扰大家的一个问题，闪晶生物为大家提供一个十分精确的计算程序，操作简单方便。用户可以自己方便地输入各种盐离子浓度。
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电话/传真：021-求助:genebank里查到的多个序列怎么选择(序列,细菌,通用引物,数据库) - 微生物实验 - 生物秀
标题: 求助:genebank里查到的多个序列怎么选择(序列,细菌,通用引物,数据库)
摘要: [求助:genebank里查到的多个序列怎么选择(序列,细菌,通用引物,数据库)] 我们想基于16SrDNA设计针对多种细菌的通用引物，在genebank里面每个细菌的这个基因序列都有很多个，怎么选择呢？然后是通过BLAST找到其共有的保守序列吗？有人做过吗？请高手指教，谢谢！再想问问这些序列的结果怎么解读呢？或者还有其它更好的数据库？第一次做，不好意思。 关键词:[序列 细菌 通用引物 数据库 保守序列 基因序列]……
我们想基于16SrDNA设计针对多种细菌的通用引物，在genebank里面每个细菌的这个基因序列都有很多个，怎么选择呢？然后是通过BLAST找到其共有的保守序列吗？有人做过吗？请高手指教，谢谢！再想问问这些序列的结果怎么解读呢？或者还有其它更好的数据库？第一次做，不好意思。
回复其实就是通过Blast找出其共有的保守序列来设计的。你可以通过查阅别人做过的设计好的通过 用引物在genebank中搜一下，看是否可靠，这可能是一个捷径吧，不妨一试。祝你好运回复谢谢，可是我查了一下，好象国外的文献很少，奇怪的是国内还有一些这样的文献，可是都说还是自己设计的可靠一些，所以想试试。还没有设计出引物，直接找一个细菌的16srdna做BLAST吗？回复以16S rRNA基因为靶基因设计或比较通用引物，用blast效果不太好。因为该基因含有很多高度保守区（9-10），且在很多细菌中都是多拷贝的，文献或设计的primers往往都能扩增出几乎所有的真细菌，因此，blast时会得到很多同源序列，尽管如此，还是有更多的序列或细菌被省略了。我设计或验证该UP时，是有目的地根据实验需要，从genebank中确定一些常见细菌的属，每个属选几个菌种，每个菌种选2-3个菌株，但一定要包括标准株（可参考文献），然后用MEGLINE进行序列，并与UP进行比较。设计完成后在拿UP与随意查的其他细菌进行比较验证。尽管需要分析的序列可能达近百个，可现在的计算机内存和速度，及宽带都很大，应该是很快的。回复谢谢yanzhiyong,还是不太明白，up和MEGLINE是指的什么啊？可是如果 “因为该基因含有很多高度保守区（9-10），且在很多细菌中都是多拷贝的”，只和随意查的其他细菌进行比较验证得到的通用引物九可以了吗？“文献或设计的primers往往都能扩增出几乎所有的真细菌”，是不是说扩出来的片断太多，会影响到它的特异性，所以这样的通用引物是不可取的呢？回复UP:universal primer通用引物,Magline:对排,是 DNAStar软件中的一项,用于多个序列的同源性分析,其实很多分子学软件都有类似功能,也可选用,您可到DXY软件版去找，有很多介绍。回复可是如果 “因为该基因含有很多高度保守区（9-10），且在很多细菌中都是多拷贝的”，只和随意查的其他细菌进行比较验证得到的通用引物九可以了吗？还是应该结合实验目的进行,如果可能,则每属(种)细菌都应该验证,但类似工作很多人已经做过了。“文献或设计的primers往往都能扩增出几乎所有的真细菌”，是不是说扩出来的片断太多，会影响到它的特异性，所以这样的通用引物是不可取的呢？因为您的贴子说的是细菌，我理解为只要是细菌就应该扩增出。如果是针对某种细菌，则另当别论。有的细菌在16S rRNA基因中可找到特异性probe或primer，但由于16s rRNA毕竟太小（1500bp左右），所以很难每种细菌都在16S rRNA基因中找到特异性的序列，现在有用16S-23S区间序列进行研究的，可参考。回复Normally, we used following primers to amplify bacterial 16S rRNA genes (27F and 1492R pair) and sequencing them (using other primers). The primer sequencs are all listed in the reference: - Lane DJ (S rRNA sequencing. In: Stackebrandt E, Goodfellow M (eds) Nucleic acid techniques in bacterial systematics. Wiley, Chichester, pp 115-17527F
5" AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3"
PCR and sequencing, most eubacteria357F 5" CTC CTA CGG GAG GCA GCA G 3"
Most eubacteria530F 5" GTG CCA GCM GCC GCG G 3" Most eubacteria and archaebacteria926F 5" AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG 3" Most eubacteria and archaebacteria1114F 5" GCA ACG AGC GCA ACC C 3" Most eubacteria342R 5" CTG CTG CSY CCC GTA G 3" Most eubacteria519R 5" GWA TTA CCG CGG CKG CTG 3" Most eubacteria and archaebacteria907R 5" CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT 3" Most eubacteria and archaebacteria1100R 5" GGG TTG CGC TCG TTG 3" Most eubacteria1492R 5" TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3" PCR and sequencing, most eubacteria 1525R 5" AAG GAG GTG WTC CAR CC 3" PCR and sequencing, most eubacteria M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:1Any primer"s reverse complement sequence is its revers prime. For example:519R 5" GWA TTA CCG CGG CKG CTG 3" then519F 3" CWT AAT GGC GCC GKC GAC 5"Hope this would useful to you and answered your question.
And hope this would useful to many other people. Good LUCK, guys!回复谢谢高手指点!
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请教高手，如何查询PCR引物序列
如题，如何查询SD大鼠烟碱受体α4亚基和β2亚基的PCR引物序列，多谢
感谢以上回复，麻烦请说详细一点，谢谢
我有更好的答案
如果需要克隆片段不大、利用软件或者手工根据你的需要设计对基因序列进行引物序列、到NCBI上面的genebank寻找你所需基因的序列、 Olige6等、DNAstar.0，手工设计也可以。2，也可以借助BLAST工具1。常见软件有Primer Premier5
呵呵 问这来了 上NCBI 找这个亚基的序列，然后自己设计引物。引物这东西最好自己来。
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