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请教各位高手关于引物设计问题：
为什么我设计引物Blast的时候总是特异性不高，我用的是primer5.0，引物查找功能，依据引物设计原则筛选的，苦闷啊，有哪位高手告知一二，是怎么回事，谢谢！
提问者： [] [] []
回答者： [] [] []
一级 一星助者
欢迎对最佳答案进行评论或补充，发表您的不同见解！
找到"如何设计引物，为什么blast后特异性总是不高"相关问题约127篇，用时0.093751秒
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生物秀旗下 [Website]一步一步教你使用&NCBI&查找DNA、mRNA、cDNA、Protein、promoter、引物设计、BLAST&序
一步一步教你使用 NCBI 查找DNA、mRNA、cDNA、Protein、promoter、引物设计、BLAST
序列比对等
<img STYLE="DispLAY: none" src="/blog7style/images/common/sg_trans.gif" real_src ="http://b1./ac/b.gif" NAME="paperPicArea"
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最近看到很多战友在论坛上询问如何查询基因序列、如何进行引物设计、如何使用BLAST
进行序列比对……，这些问题在 NCBI 上都可以方便的找到答案。现在我就结合我自
己使用 NCBI的一些经历（经验）跟大家交流一下 BCBI 的使用。希望大家都能发表自己的使
用心得，让我们共同进步！
我分以下几个部分说一下 NCBI 的使用：
Part one 如何查找基因序列、mRNA、Promoter&
Part two 如何查找连续的 mRNA、cDNA、蛋白序列
Part three 运用 STS 查找已经公布的引物序列
Part four 如何运用 BLAST 进行序列比对、检验引物特异性&
特别感谢本版版主，将这个帖子置顶！
从发帖到现在，很多战友对该帖给与了积极的关注，在此向给我投票的（以及想给我
投票却暂时不能投票的）各位战友表示真诚的感谢，谢谢各位战友！
请大家对以下我发表的内容提出自己的意见。关于NCBI 其他方面的使用也请水平较高
的战友给予补充
First of all，还是让我们从查找基因序列开始。
第一部分 利用Map viewer
查找基因序列、mRNA 序列、
启动子（Promoter） &
下面以人的 IL6（白细胞介素 6）为例讲述一下具体的操作步骤
1． 打开Map viewer 页面， 网址为：
在 search 的下拉菜单里选择物种，for 后面填写你的目的基因。操作完毕如图所示：
<img STYLE="WiDTH: 670 BACKGroUnD: none transparent scroll repeat 0% 0%; HeiGHT: 157px" ALT="图片" src="/blog7style/images/common/sg_trans.gif" real_src ="http://b310.photo./psb?/V10eVufs3oak1c/etvTmTWjxjUnelKUr7oB7KsjIPNIaOgAuX3j9hNHf9k!/b/dEb80LiYJwAA"
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&2．点击“GO”出现如下页面：
<img STYLE="WiDTH: 670 BACKGroUnD: none transparent scroll repeat 0% 0%; HeiGHT: 377px" ALT="图片" src="/blog7style/images/common/sg_trans.gif" real_src ="http://b310.photo./psb?/V10eVufs3oak1c/pUbvyySt7l5yi*oSm.k0bhDJWZeqILIn4K71WvbNxAo!/b/dLLdyriDJwAA"
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&3． 在步骤二图示的右下角有一个Quick Filter,下面是让你选择的几个复选框，
前面的小方框里打勾，然后点击Filter. 出现下图：
<img STYLE="WiDTH: 670 BACKGroUnD: none transparent scroll repeat 0% 0%; HeiGHT: 453px" ALT="图片" src="/blog7style/images/common/sg_trans.gif" real_src ="http://b307.photo./psb?/V10eVufs3oak1c/gMu2gQinh2V9lwoUlCUkeIBX7pQWY7IUCv8I.Az02Nc!/b/dCmtBbcFdwAA"
TITLE="一步一步教你使用&NCBI&查找DNA、mRNA、cDNA、Protein、promoter、引物设计、BLAST&序" />
说明一下：1、染色体的红色区域即为你的目的基因所处位置。2、下面参考序列给出了
三个，是不同的部门做出来的，经我验证，序列有微小的差异，但总体来说基本相同。尽管
你分别点击后，序列代码、序列代码等有所差异，但碱基基本一致，不影响大家研究分析序
列。现在普遍采用的是最上面的那个序列，这一条是世界范围的生物科学家用计算机合成的
一个序列。我也推荐大家使用这个序列。
4．点击上述三条序列第一条序列（即 reference）对应的"Genes seq"，出现新的页面，
页面下方为：
<img STYLE="WiDTH: 670 BACKGroUnD: none transparent scroll repeat 0% 0%; HeiGHT: 148px" ALT="图片" src="/blog7style/images/common/sg_trans.gif" real_src ="http://b309.photo./psb?/V10eVufs3oak1c/i.mME95Q1Iurpyt3ZCefkbaqogaY7nRU4nayjgk.jPg!/b/dLLIMLi7NAAA"
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5．点击上图出现的“Download/View Sequence/Evidence ”，即下载查看序列等功能，
结果如图所示：
<img STYLE="WiDTH: 670 BACKGroUnD: none transparent scroll repeat 0% 0%; HeiGHT: 310px" ALT="图片" src="/blog7style/images/common/sg_trans.gif" real_src ="http://b309.photo./psb?/V10eVufs3oak1c/H9dJGpRbJPuDd0gxtV3UjNPPRdOtn8KXAgF*lYvpj2g!/b/dCBnO7giNQAA"
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先对上面这张图做点简要的说明，在 Sequence Format（序列输出格式）后面是一个下
拉式选择菜单，默认的为 FASTA 格式，还有一个是 GenBank 格式。我推荐大家选择 GenBnak
格式，因为这个格式提供了很多该基因的信息，而 FASTA格式只有基因序列。
6．在 Sequence Format 后选择 GenBank，然后点击下面的 Display，目的基因的相关
信息和序列就出现在眼前了。点击后如图所示（网页较大，只抓取一小部分以作示范） ：
<img STYLE="WiDTH: 670 BACKGroUnD: none transparent scroll repeat 0% 0%; HeiGHT: 557px" ALT="图片" src="/blog7style/images/common/sg_trans.gif" real_src ="http://b310.photo./psb?/V10eVufs3oak1c/cJKuA572zjj9zz69MWkPQkBLC6rIth99m0HKA1AiZLA!/b/dItPybheJwAA"
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在上述打开的网页中，你可以看到基因长度，基因序列，以及这个基因是如何被报道出
来的等各种信息。
你会看到:& mRNA&
join(,,,, )
这代表了从基因的 3598位开始就是转录区了， 即我们常说的 mRNA 片断， 由于内含子的存在，
所以 mRNA 在DNA 序列上分成了几段。
CDS join(,,,,
CDS 代表编码序列，即蛋白编码区是从 3660 开始的（ATG） ，由于剪接作用所以 CDS 区
也是不连续的。
说到这里，可能很多朋友都已经明白了 promoter 即启动子区域在哪里了。但我还是再
唠叨几句：转录起始位点前面是基因的调控区，启动子区没有明显的位置定义，大家也只是
猜测它的大体位置，如果你要研究 promoter 区的话，建议你选择转录起始位点前的 2000
个碱基进行研究，一般默认的是这样。当然你如果觉得长度太长不好研究的话，也可以只研
究-1000 到0这一千个碱基，因为一般情况下，启动子区的变异都在这个区域内。
这样大家就可以找到自己的目的基因序列和启动子了，这种方法可能使用的人不是很
多，但我个人比较喜欢，因为它最大的优点是可以找到启动子区域和其他调控区域。希望大
家可以发帖交流，让我们把 NCBI 用的更好！
如何查找连续的mRNA、cDNA、蛋白序列（依
然以人类的 IL6 为例） 1．进入NCBI 主页：
在 search 后面选择 Gene，在 for 后面填写需要查找的基因的名字。如图所示：
<img STYLE="WiDTH: 670 BACKGroUnD: none transparent scroll repeat 0% 0%; HeiGHT: 561px" ALT="图片" src="/blog7style/images/common/sg_trans.gif" real_src ="http://b308.photo./psb?/V10eVufs3oak1c/ds.VizNq3EJDn0jsiRL8yUMWrLWBs64L0fao8AcZvRQ!/b/dGgrmLe6NQAA"
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出现了很多基因序列，在每个序列的右边还有“Order cDNA clone” 的链接，这些序
列中有些序列是跟你的目的基因同名的，有些是别名（Other Aliases）与你的目的基因一
致，根据每个序列的介绍认真选择你的目的基因。上图中我需要的 IL6 是标号为2的序列。&
2.1& 查找 cDNA 序列
2.1.1& 点击Order cDNA clone, 出现目的页面如图所示：
<img STYLE="WiDTH: 670 BACKGroUnD: none transparent scroll repeat 0% 0%; HeiGHT: 469px" ALT="图片" src="/blog7style/images/common/sg_trans.gif" real_src ="http://b309.photo./psb?/V10eVufs3oak1c/Lm1nF6E1titMGJtF6mJb9VohGAHGegMmc*6vxnbAU0I!/b/dP00L7jwNQAA"
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2.1.2& 点击Clone Sequence 后面的链接即可得到cDNA
序列。点击后如图所示（只抓
取其中一部分）
<img STYLE="WiDTH: 670 BACKGroUnD: none transparent scroll repeat 0% 0%; HeiGHT: 471px" ALT="图片" src="/blog7style/images/common/sg_trans.gif" real_src ="http://b311.photo./psb?/V10eVufs3oak1c/.XO3S7VcoUMhvKAOI5aeqi0nmQ8HqhU0O*FsDRSoFaM!/b/dOZ2Y7kEJwAA"
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2.2& 查找 mRNA、蛋白序列
回到步骤 1
点击“Go”之后出现的页面，点击目的基因的名字，出现以下页面&(只抓取相关部分)：
<img STYLE="BACKGroUnD: none transparent scroll repeat 0% 0%" ALT="图片" src="/blog7style/images/common/sg_trans.gif" real_src ="http://b309.photo./psb?/V10eVufs3oak1c/Lk9ps*.TTi.jkvA3lIV7U3A1lE0BemVb3oTlDnd5LZM!/b/dOnPM7gINgAA"
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页面的下半部分，即可以获取 mRNA和蛋白序列的部分：
<img STYLE="WiDTH: 670 BACKGroUnD: none transparent scroll repeat 0% 0%; HeiGHT: 455px" ALT="图片" src="/blog7style/images/common/sg_trans.gif" real_src ="http://b306.photo./psb?/V10eVufs3oak1c/O*z2KmMMfrVjsMpqOZMYmuHWJ7Wmk4z6AoD8NE3bDto!/b/dEAhcLZidwAA"
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找到“NCBI Reference Sequences (RefSeq)”，它分为几个板块，第一个“mRNA and
Protein ”区可以让我们找到连续的编码 mRNA 序列和蛋白序列。在 mRNA and
Protein下面有两个序列代码（中间划有一个箭头） ，这代表了 mRNA序列和蛋白序列。分别点击就可
以得到相应的序列页面。点击后如图所示，mRNA 序列：
<img STYLE="WiDTH: 670 BACKGroUnD: none transparent scroll repeat 0% 0%; HeiGHT: 509px" ALT="图片" src="/blog7style/images/common/sg_trans.gif" real_src ="http://b309.photo./psb?/V10eVufs3oak1c/gct6*dNztYzPp4Z3MUgMABc7QTXqoRTcBtVUKgPbsZY!/b/dJLjObi4NAAA"
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NCBI Reference Sequences (RefSeq)的第二个板块是 Reference assembly，它下面显示的是
Genomic ，点击 Genomic 下面Reference assembly 对应的 Genbank 或 FASTA
即可出现编码的 DNA 序列（注意：只是编码序列，其中包括内含子，但一般没有 5‘非编码区） 。
一步就不做贴图演示了吧，
呵呵。&这样我们就可以找到基因的 cDNA 序列、连续的编码 mRNA
序列、蛋白序列以及含有内
含子的编码DNA 序列了。相信这些操作对很多战友还是有用的。
如果大家有更好的方法，欢迎发帖交流！
友情提示：在 NCBI 里打开的每一个页面都会给我们提供大量的信息，大家不妨好好看
看，可能会有令我们惊喜的收获！
最后唠叨一句： 最近我实验比较忙， 只能在深夜发帖， 可能要过几天再发第三部分[Part
three 运用STS 查找已经公布的引物序列]，希望“期待下集”的朋友可以理解。
第三部分 运用STS
查找已经公布的引物序列&
STS，序列标签位点（Sequence Tagged
Site）：一段短的DNA 序列（200－500 个碱基
对），这种序列在染色体上只出现一次，其位置和碱基顺序都是已知的。在PCR 反应中可以
检测处STS 来，STS 适宜于作为人类基因组的一种地标，据此可以判定DNA 的方向和特定序
列的相对位置。
以上内容基本是STS 的定义，我主张活学活用，下面就介绍一下我个人用STS 数据库查
找引物的一点经验。还是使用人的IL6 基因为例，呵呵
1． 打开 NCBI 主页，在 Search 后面的下拉菜单选择 UniSTS，在 FOR 后面填写目的基
操作完毕如图所示
<img STYLE="WiDTH: 577 BACKGroUnD: none transparent scroll repeat 0% 0%; HeiGHT: 601px" ALT="图片" src="/blog7style/images/common/sg_trans.gif" real_src ="http://b310.photo./psb?/V10eVufs3oak1c/BuMnSEqqT2MUDHjYxU4Gd82fqUAb9E6Yt9crCEddA6k!/b/dDbhyrjYJwAA"
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这是你会发现 NCBI 又提供了很多序列，下面我们还是要初步筛选我们需要的序列。
2．根据物种、目的引物所在染色体的位置等选择相应序列（可能不只一个） ，点击。
下面以点击第一个进入的画面为例。&
<img STYLE="BACKGroUnD: none transparent scroll repeat 0% 0%" ALT="图片" src="/blog7style/images/common/sg_trans.gif" real_src ="http://b311.photo./psb?/V10eVufs3oak1c/Vqm4Y3Ad1iX.IZtUl2d9x8i1Dze.dXZfeSyezVn.zbg!/b/dJUabrkTJwAA"
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你会发现这个页面直接就给出了引物序列，PCR之后的片段长度也是给了的（247bp） 。
下面还有很多相关的信息……
3．点击GeneBank Accession 后面的代码，进入下一个页面。
<img STYLE="WiDTH: 487 BACKGroUnD: none transparent scroll repeat 0% 0%; HeiGHT: 430px" ALT="图片" src="/blog7style/images/common/sg_trans.gif" real_src ="http://b308.photo./psb?/V10eVufs3oak1c/8EMPhJ6ETjfbEcVWFNhxjwkn7rZAHOVv43ACqmcqKGY!/b/dGeZlrdENQAA"
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啊！前后引物都呈现在眼前了，还有反应体系和反应条件！其中 Primer A 是前引物序
列，Primer B 则是后引物序列，并且给出了他们在 DNA 序列中的位置。有兴趣的朋友可以
在序列中找一下，是可以找到的， 不过要注意，PCR 是双链扩增，在序列中可以直接找到
的是 Primer A 的原序列 和 Primer B的互补序列。
在步骤二里面我只点开了一个序列，继续打开其他的可能还会有对自己有用的引物，不
过这要你自己慢慢发掘了。
这种寻找引物的方法有点投机取巧的味道，实用程度不是很高，但如果这里面恰好有你
想 P 的片段的话，恭喜你，这些引物都是很成熟的引物，可以直接拿过来使用了。
如果想寻找引物，大家可以查阅相关论文，已经报道的引物我们为什么不用呢？！既省
时间，可靠性又强。
如果这两种方法都不能找到你需要的引物的话， 那就自己设计吧， 建议使用 Primer 5 和
Oligo。引物设计的详细内容我在这里就不多说了，推荐两个帖子给大家看一下，第一个是
本版版主 liuzeyi2002 发起的，内容很丰富，很值得学习，另一个则是我发的。
第四部分 如何运用 BLAST
进行序列比对、检验引物特异性&
提到序列比对，绝大多数战友都会想到 BLAST，但 BLAST 的使用确实又是一个很大的难
题， 因为他的功能比较强悍， 里面涉及到的知识比较多， 而且比对结束后输出的结果参数 （指
标）又很多。如果把 BLAST 的使用详细的都讲出来，我想我发帖发到明天也发不完，更何况
我自己也不是完全懂得 BLAST 的使用。 所以我在这里也就“画龙点睛”——以比对核酸序列
为例来给大家介绍一下 BLAST 的使用， 也算是 BLAST 的入门课程吧。 请看帖的战友好好体会，
如果你用心看，在看帖完毕之后 BLAST 的基本使用（包括其他序列的比对）应该没有问题
1．打开BLAST 页面， 打开后如图所示：
<img STYLE="WiDTH: 588 BACKGroUnD: none transparent scroll repeat 0% 0%; HeiGHT: 477px" ALT="图片" src="/blog7style/images/common/sg_trans.gif" real_src ="http://b307.photo./psb?/V10eVufs3oak1c/Z1yBWI8AeiYobBej9.7FELF6TlUdc4Kqc7siyj2qOXM!/b/dAu9CLeKdgAA"
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对上面这个页面进行一下必要的介绍：
BLAST 的这个页面主体部分（左面）包括了三部分：BLAST Assembled Genomes、Basic
BLAST、Specialized BLAST。相信大家可以看懂这三个短语的意思，我就不多说了；我要说
的是，可以认为这是三种序列比对的方法，或者说是 BLAST 的三条途径。
第一部分 BLAST Assembled Genomes 就是让你选择你要比对的物种，点击相应物种之后即可进入比对页面。
第二部分 Basic BLAST 包含了 5 个常用的 BLAST，每一个都附有简短的介绍。
第三部分 Specialized BLAST 是一些特殊目的的 BLAST，如 IgBLAST、SNP 等等，这个
时候你就需要在 Specialized BLAST部分做出适当的选择了。
总之， 这是一个导航页面， 它的目的是让你根据自己的比对目的选择相应的 BLAST
下面以最基本的核酸序列比对来谈一下 BLAST的使用， 期间我也会含沙射影的说一下其
他序列比对的方法。
2． 点击Basic BLAST部分的nucleotide blast 链接到一个新的页面。打开后如图所
<img STYLE="BACKGroUnD: none transparent scroll repeat 0% 0%" ALT="图片" src="/blog7style/images/common/sg_trans.gif" real_src ="http://b309.photo./psb?/V10eVufs3oak1c/wLrEh4*dj8yVBasHYEeGB9le5HtqeJ9ovoPNCPCSWvc!/b/dNfDM7jaNQAA"
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介绍一下上述页面：
Enter Query Sequence 部分是让我们输入序列的，你可以直接把序列粘贴进去，也可
以上传序列，还可以选择你要比对的序列的范围（留空就代表要比对你要输入的整个序列） 。
Job Title 部分还可以为本次工作命一个名字。
Choose Search Set 部分是让我们选择要与目的序列比对的物种或序列种类（genome
DNA、mRNA 等等） 。如果是人或老鼠的话，就可以直接选择了如果是其他物种就要选择
“others”了，这时候网页会主动跳出一个下拉对话框和一个输入式对话框，你可以分别选择和输入要跟你的序列比对的序列种类和物种。下面的
Entrez Query 可以对比对结果进行
适当的限制。
Program Selection 部分其实是让我们选择本次比对的精确度，种内种间等等。
在 BLAST 按钮下面有一个“Algorithm parameters” ，这是参数设置选项，一般用户
使用不到此项，所以它比较隐蔽，点击，原网页下方即可增加了 Algorithm parameters 的
内容。大部分战友都用不到更改这里面的选项，我也不多说了，有兴趣的朋友可以自己研究
3．依次填写上述网页必须部分，点击 BLAST 按钮后，出现如下界面（只截取其中一部
<img STYLE="WiDTH: 588 BACKGroUnD: none transparent scroll repeat 0% 0%; HeiGHT: 179px" ALT="图片" src="/blog7style/images/common/sg_trans.gif" real_src ="http://b311.photo./psb?/V10eVufs3oak1c/5M.BZ1UhbAs0jjXhjmibF7*z1bmJQugTrBubg0cgwzc!/b/dPSibLlXJwAA"
TITLE="一步一步教你使用&NCBI&查找DNA、mRNA、cDNA、Protein、promoter、引物设计、BLAST&序" />
出现的这个结果页面信息含量非常大，如果我们用心观察，还是可以发现其中的一些主
要指标的。列举上图也是为了给大家展示一下这些评价标准。其中 Description 部分推荐大
家详细看一下，另外说一下“E value” 这个指标与其他指标不同，它的数值越小相似程度
越高，其他几个（如 Totle score）都是数值越高相似度越高。
在这个图示的表格下方就是具体的相似性的核酸序列了，还配合着各种参数的得分。
好了，各位亲爱的战友，我的 BLAST 就发到这里为止了，更具体的东西有待大家一起去
努力研究。伴随着 BLAST 的终结，我的“一步一步教你使用 NCBI”也要暂时告一段落了，
很高兴自己发第一个帖子时说的话今天终于做到了。 以后如果我有新的 NCBI 使用方法的话，
我还会添加到这里来，但我想这一阵子是不会接着发了，呵呵。
原始版本下载：&
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以上网友发言只代表其个人观点，不代表新浪网的观点或立场。小木虫 --- 500万硕博科研人员喜爱的学术科研平台
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引物特异性检验
谁会用Blast进行引物特异性检验，结果怎么样表示引物特异性好啊&&帮帮忙&&谢谢
我用-primer blast比对过了，但结果我不会分析，是只出现一个模板表示引物特异性好吗？下图是我比对的结果，帮我分析下这样引物特异性好不好？
从你这个截图看，引物的特异性还不错啊&&你要的就是447大小的片段吗？
你要扩的是Aphis gossypii nicotinic acetylcholine receptor beta 1 subunit variant 1 mRNA吗？
我主要看的是mRNA序列的241位点 ，所以只要片段包含这个位点即可
我用棉蚜的基因组DNA扩增mRNA序列中的241位点信息，因为没有DNA信息，所以只能用mRNA序列当模板序列设计引物，亲 这样能用基因组DNA扩增出来吗？我之前扩增出来比对后序列与mRNA序列相似性很高，那就说明我扩增那段序列不存在内含子，但是之后同样条件只是DNA样品不一样，就会出现好多杂带，不知道是引物的问题还是提取基因组DNA的问题？提取的基因组DNA浓度很低，而且OD260/OD280比值很高，在2.3左右。很抱歉我问这么多，实在是最近实验不顺，不知道问题出现在哪
你现在设计的引物都和你的模板都不配对啊，你找模板啊&&在NCBI上找啊
你要找棉蚜乙酰胆碱序列吗？
我要扩增棉蚜烟碱型乙酰胆碱受体beta1亚基的序列
什么意思？扩增基因组DNA是应该用DNA序列做模板，但是现在NCBI上没有其DNA序列的信息，我只能用其mRNA当模板序列设计引物啊？不知道你说的这个引物和模板不配对是什么意思呢
扩增基因组DNA是应该用DNA序列做模板，你应该以DNA为模板设计引物啊
提高扩增退火温度，可以提高特异性。 或者&&把PCR产物跑琼脂糖切胶回收& &实验不顺是很正常的，楼主加油啊
谢谢:hand:
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