nest pcr做一个反应好还是分开做好？(引物|复性|一次性) - PCR实验 - 生物秀
标题: nest pcr做一个反应好还是分开做好？(引物|复性|一次性)
摘要: [nest pcr做一个反应好还是分开做好？(引物|复性|一次性)] 就是nestpcr是做一次反应（引物的复性温度相差5度），先做30个循环大片断，再做30个小片段，是一次性做完好，还是第一个p后取出产物稀释后的效果好？ 关键词:[引物 复性 一次性]……
就是nestpcr是做一次反应（引物的复性温度相差5度），先做30个循环大片断，再做30个小片段，是一次性做完好，还是第一个p后取出产物稀释后的效果好？
回复:就是说nestpcr将引物一起加入做一个反应好，还是做两次分开加的好？大侠们，给个回答吧！！！回复:这位同学，你好像对nestpcr的概念还不太清楚。
巢式PCR是指用一对半(三条)或两对引物实现对目的片段的特异性扩增.更精确的来讲,用一对半引物的应该叫做半巢式PCR.
其步骤就是,先用一对外侧引物,扩增模板得到包含你想要的目的片段,比你想要的片段更大的区域.然后用另一对内侧引物(即该对引物在第一轮所用的引物的序列内侧),将你第一轮扩增得到的PCR 产物为模板,再进行扩增.为了节约引物,可以使用一对半引物.即以第一轮扩增中用到的引物中的一个作为第二轮中的一个引物,与第三条引物分别作为上游和下游引物进行半巢式PCR扩增.进行两轮PCR 的目的在于提高扩增的灵敏性.根据文献报道,经巢式PCR扩增后,产物扩增灵敏度较之第一轮能提高10的3次方倍.
所以想做巢式，就要先将一对外测引物加入扩增体系，扩增完成后，建立第一轮产物为模板，以另一对内侧引物为引物的扩增体系，该体系中仅加很少量的第一轮产物，一般约1/20，或1/100，要根据第一轮产物的浓度而定。
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电话：021-求助TAIL-PCR的随机兼并引物（AD PRIMER）如何设计！ - 实验交流 - 生物秀
标题: 求助TAIL-PCR的随机兼并引物（AD PRIMER）如何设计！
摘要: 求助TAIL-PCR的随机兼并引物（AD PRIMER）如何设计！打算用TAIL-PCR克隆一个水稻(Rice)(Rice)突变体的基因，但不知随机兼并引物（AD PRIMER）如何设计，请高手赐教！ 关键词:[兼并引物 突变体]……
打算用TAIL-PCR克隆一个水稻(Rice)突变体的基因，但不知随机兼并引物（AD PRIMER）如何设计，请高手赐教！回复:
可以利用已经发表的引物！回复:
其实我也看不明白AD引物设计的原理.看了几对成功的AD引物,除了论文说的3`端3个碱基不能简并外,其他都不明白.如果要扩增的细菌没人做过Tail-PCR,又怎么办呢?回复:
sr zhou ，我顶！回复:
you can use the ad primers in published papers.(same as hebinqi"s idea)
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电话：021-tail-pcr产物测序问题tail-pcr第三轮产物如果较大,比如3个KB,我想分两段测序,怎么设计中间的引物啊,
erdyacoxyj
你可以直接送到测序公司,在填写测序单时,填写为测通,测序公司就会直接帮你直接设计引物的.太羡慕你了,我做tail PCR第二轮就只扩出700bp,老板都不给我设计第三对引物...
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什么是TAIL-PCR（thermal asymmetric interlaced PCR)
什么是TAIL-PCR（thermal asymmetric interlaced PCR)
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在分子生物学研究中,基因克隆和分子杂交的探针制备等操作常需分离与已知DNA序列邻近的未知序列，TAIL-PCR又叫热不对称交错PCR，能够较好地解决上述难题。该技术通过3个嵌套的特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR循环，利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段，所获得的片段可以直接用做探针标记和测序模板。TAIL-PCR技术简单易行，反应高效灵敏，产物的特异性高，重复性好，能够在较短的时间内获得目标片段，已经成为分子生物学研究中的一种实用技术。经改良过的TAIL-PCR成功地从突变体中克隆到外源插入基因的旁侧序列，从而为启动子的克隆提供了有效的新方法。 在利用特异引物和随机引物进行PCR中一般有3种产物生成：　　①由特异性引物和简并引物扩增出的产物；　　②由同一特异性引物扩增出的产物；　　③由同一简并引物扩增出的产物。在TAIL-PCR反应中，其中后2种目标产物可以通过以嵌套的特异性引物进行的后续反应来消除。TAIL-PCR的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物（special primer，简称sp1，sp2，sp3，约20bp），用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物（arbitrary degenerate prime，AD，约14bp）相组合，以基因组DNA为模板，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物。TAIL-PCR共分3次反应。第一次反应包括5次高特异性、1次低特异、10次较低特异性反应和12个热不对称的超级循环。5次高特异性反应，使sp1与已知的序列退火并延伸，增加了目标序列的浓度；1次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上；10次较低特异性反应使2种引物均与模板退火，随后进行12次超级循环。经上述反应得到了不同浓度的3种类型产物：特异性产物①型和非特异性产物（②型和③型）。第二次反应则将第一级反应的产物稀释1000倍作为模板，通过10次热不对称的超级循环，使特异性产物被选择地扩增，而非特异产物含量极低。第三次反应又将第二次反应的产物稀释作模板，再设置普通的PCR反应或热不对称超级循环，通过上述3次PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列。
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DXY All Rights Reserved.大豆TAIL-PCR条件优化与目的片段的检测--《吉林农业大学》2015年硕士论文
大豆TAIL-PCR条件优化与目的片段的检测
【摘要】：在分子生物学的研究领域中,基因克隆与分子杂交的探针制备等操作中常常需要分离与已知DNA毗邻的未知序列,热不对称交错PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR)技术是检测转基因作物目的基因插入位点的主要技术,主要负责扩增出已知序列旁的未知核苷酸序列,即侧翼序列。侧翼序列作为分子特征的重要指标之一,它的获取是分析转基因作物中T-DNA插入位点的有效方法,也是转基因作物在申请专利保护时的重要证据,鉴定外源基因插入作物基因组的位点有着重大的意义,它可以确定外源基因是否整合在植物基因组上,还可判断出外源基因对受体基因组是否有影响,最重要的是,它可掌握外源基因插入受体基因组的具体的位点,对侧翼序列的分析还有利于基因的克隆、转基因植物研究、新品种的培育等等,对转基因作物研究有着促进作用。近年来,热不对称交错PCR技术由于其在基因侧翼序列的克隆方面具有简便、高效、特异性好等优点,广泛应用于基因的全长克隆及作物基因侧翼序列克隆的研究中。虽然TAIL-PCR具有很多优点,同时也存在诸多不足之处:(1)兼并引物与目标基因的序列结合位点是有限的。(2)TAIL-PCR反应包括较多的引物组合,导致扩增出非特异性条带。(3)难以控制特异条带的大小。因此本课题研究旨在通过对经典TAIL-PCR进行条件优化建立成熟的技术体系,并运用优化的体系,确定转基因大豆中抗病基因HrpZpsg12与抗旱基因BADH在植物基因组上的插入位点,并探讨其在不同世代的稳定性。本研究采用了分子生物学检测(PCR技术和Southern blot杂交)对转基因大豆不同世代的稳定性进行了分析,并获得稳定的阳性植株。另外通过单因素试验对影响转基因大豆TAIL-PCR的退火温度、Taq酶用量、模板浓度、兼并引物、较低温特异性循环等参数进行分析,结合正交试验针对这5个因素各取4个水平,筛选最佳的水平及组合以期建立成熟的大豆TAIL-PCR技术体系。运用此优化的技术体系对高世代的单拷贝单株采用TAIL-PCR方法进行侧翼序列分析,确定其T-DNA插入大豆基因组的具体位点。本研究获得结果如下:(1)对转基因大豆植株不同世代进行了PCR检测,电泳结果表明,各世代均能扩增出目的基因,条带清晰,特异性高。Southern blot杂交结果表明,不同世代均有明显的杂交信号的出现,且杂交带的大小不一致,说明目的片段都己经整合到大豆的基因组中,从分子水平上可以证明外源基因在大豆基因组中的稳定遗传与表达。(2)单因素结果表明,退火温度、Taq酶用量、模板浓度、兼并引物和较低温特异性循环对TAIL-PCR反应结果均有影响。在第2次反应中,当退火温度为62℃、Taq酶用量是1.0U/30mL、模板浓度为35ng/μL、兼并引物为AD2时能扩增出清晰的条带;第3次反应中,当退火温度为63℃、Taq酶用量为1.5U/50mL、模板浓度为40ng/μL、兼并引物AD3时能获得理想的效果;较低温特异性循环降低4个比较适宜。(3)结合单因素的结果,利用正交试验筛选出最佳的水平及组合,最终优化的TAIL-PCR反应体系为:第二次反应为退火温度61℃,1.0U/30mL Taq酶,模板浓度为30ng/μL;第三次反应为退火温度62℃,0.5U/50mL Taq酶,模板浓度为40ng/μL,反应过程中采用降低5个较低特异性循环,兼并引物采用AD3,在此条件下扩增的条带清晰,稳定,特异性好,适合大豆TAIL-PCR反应体系。(4)对T4代转HrpZpsg12基因的3个单拷贝阳性单株进行T-DNA侧翼序列分析,结果2号样品得到预期的测序结果,测序结果表明,T-DNA插入在大豆基因组的第5号染色体上,并与大豆的第1524碱基是同源序列;同样对T6代转BADH基因的4个样品进行了T-DNA侧翼序列分析,只有3号样品扩增出较好条带,根据测序结果得知T-DNA具体插入大豆基因组的18896bp处,同时证实了所建立的大豆TAIL-PCR技术体系具有通用性和稳定性。
【关键词】：
【学位授予单位】：吉林农业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2015【分类号】：S565.1【目录】：
摘要3-5Abstract5-9第一章 文献综述9-18 1.1 P C R技 术的 研究 进展9-11 1.2 TAIL-PCR技术的研究进展11-15 1.3 侧翼序列的扩增15-17 1.4 研究目的与意义17-18第二章 材料与方法18-30 2.1 材料18-19 2.2 方法19-30第三章 结果与分析30-46 3.1 转化植株的分子生物学检测30-32 3.2 TAIL-PCR反应条件的优化32-40 3.3 不同目标基因的侧翼片段的扩增与分析40-46第四章 讨论与结论46-49 4.1 讨论46-47 4.2 结论47-49参考文献49-54作者简介54-55致谢55
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