细胞提取蛋白后放在冰箱里为什么会有防冻液出现絮状沉淀物?

离心以后,分泌蛋白为什么会出现在上清液中?细胞自产自销的蛋白叫什么蛋白?为什么不会出现在上清液中?
同位素标记P32的DNA进入了细菌的细胞内,而未标记的蛋白质衣壳则留在了外面.离心的时候比重大的菌体沉淀在离心管底部,比重小的蛋白质衣壳留在了上清液里.
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RIPA裂解后离心提取蛋白液时出现絮状物
各位,我使用CST RIPA裂解液裂解悬浮细胞,每10的6次方个细胞加20-30ul裂解液,14000g离心后时常出现絮状沉淀,无法将蛋白液顺利吸出。裂解步骤:细胞离心后加入30ul RIPA,使用移液器混匀,立即冻存于-80℃,次日或一周后取出,冰上融化,每隔十分钟 涡 旋 振 荡一次,共进行三次,之后4度14000g离心15min。请大家提出宝贵意见,问题到底出在了哪里,谢谢。
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随时随地聊科研[请教]蛋白质透析为何会出现絮状沉淀!? - 实验交流 - 生物秀
标题: [请教]蛋白质透析为何会出现絮状沉淀!?
摘要: [[请教]蛋白质透析为何会出现絮状沉淀!?] 我的蛋白用PBS(PH7 4)透析两天就出现很严重的沉淀,不知道为什么,有人建议我用TE(PH8 0)透析,这可行吗? 关键词:[透析 蛋白质 絮状沉淀]……
我的蛋白用PBS(PH7.4)透析两天就出现很严重的沉淀,不知道为什么,有人建议我用TE(PH8.0)透析,这可行吗?
出现絮状沉淀是很正常的现象,因为透析本身就是一个复性的过程,那么出现絮状的沉淀就是一些不能够复性成为天然结构的一些目的蛋白和一些杂蛋白,而这些都是我们所不需要的。所以说出现絮状沉淀是正常的也是我们希望看到的。至于出现沉淀的原因不外乎条件变化太剧烈了,建议不要让透析的条件变化太剧烈了,主要是PH的浓度的变化和样品中一些其他东西如尿素的浓度变化。如果楼主透析样品中出现太多的沉淀,甚至于跑胶中基本没有带了,那么建议楼主换一种透析液来用,如用TGE也就是传说中的万金油来试试,我一直用的是这种透析液,效果很不错。TGE配法如下:50mM Tris0.5mM EDTA50mM Nacl5%或10%甘油如果有条件加入1%的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽会更好些。
我用万金油buffer效果很不错,甘油很有用的哦
我有问题要问,那沉淀的蛋白如何处理呢?还用尿素溶么?蛋白经过这么一番折腾还有活性么?
我就扔掉了,呵呵再作我也不知道那样还能不能用活性就更难说了
蛋白本来就不多,再扔调的话还有蛋白么?我要拿来做单抗的,这怎么办呢?
to 楼上的:沉淀没什么可惜的,也没有什么价值了。因为透析本身是个复性的过程,而且我们要的就是那些透析后可溶的蛋白质,因为只有这些蛋白质才更接近天然构象,这样做起单抗来才更有成功的希望,才更有价值嘛。你是怕可溶性的蛋白不够你用是吧?我觉得这不太可能,因为你的蛋白的表达量不会小到这种程度吧?而且透析之后你可以用PEG包埋来浓缩蛋白,毕竟做单抗的免疫量只需要50ug/只,50ug基本上所有的重组蛋白都能达到这个水平的,所以不要担心。再说了,行不行的你也要做了之后才知道啊,做了之后如果不行再想别的办法呗。祝好!
谢谢“艳过刘痕“, 我 以前的沉淀是由于透析时没加尿素才导致沉淀的,后来我就用8M尿素重新融解蛋白沉淀,然后再在PBS缓冲液中依次加入6M,4M,2M尿素透析,接下来我还要蛋白酶切的,试试看吧!我怕蛋白不够,因为以后做单抗时用于包被的蛋白必须要多量,所以看到沉淀我心痛啊 !
沉淀可以拿来重溶,在透析的.我做的干扰素可以重复透析一次,活性与第一次接近.不过看具体的蛋白吧,试试吧
要做单抗啊?多抗用5微克蛋白就可以了呢
我也遇到过透析沉淀的情况,因为那时是刚接触蛋白质方面,老是搞不懂什么原因。当时也将沉淀后的蛋白(因为我做的是酶)测了酶活,结果一点活性都没有。就把沉淀了的蛋白都丢了。后来折腾了好久,才发现我用的Tris已过期。真气人,从学校设备科才领的药品居然是过期的。换了药品后就没有出现沉淀现象。你也检查一下你的药品是否有问题。祝实验顺利!
沉淀是正常的现象,可能是你的蛋白含量过高的原因,也可能是在透析的过程中聚合成大分子的蛋白,一般弃去沉淀不会影响你的实验的,如果蛋白浓度不够可以浓缩,但沉淀的蛋白效果很难保证。做单抗免疫小鼠浓度在1mg/ml左右就可以了,100ul加100ul佐剂,混匀后免疫即可!
请问艳过刘痕,你说的万金油透析液的PH是多少,8.0吗?还有,如果用尿素溶的话,透析液里是否还需加尿素(梯度,逐渐降低)
PBS有一个特别的功能常常被忽视,那就是它也是一种蛋白沉淀剂,做蛋白质结晶时常常用到它(可参考《蛋白质技术手册》汪家政,范明 主编2000年8月第一版第十三章)。楼主出现的沉淀分明是析出的蛋白质,一般不会是变性蛋白。为了证明不是变性蛋白,楼主可以改用低盐溶液透析,如果沉淀消失,那就恭喜你了。从楼主目前情况看,肯定是要换透析液了。
请问艳过刘痕,你说的万金油透析液的PH是多少,8.0吗?还有,如果用尿素溶的话,透析液里是否还需加尿素(梯度,逐渐降低)我用的万金油的PH当时调的是7.9的,但是7.4的和8.0的我都用过,效果没什么区别的。用尿素溶的时候最好是用梯度,因为条件变化太剧烈的话如前所述,会很容易产生沉淀的。另建议每次透析的时候最好用新的透析带(100块买5米,不贵的),即使是用旧的透析带,也最好是用经典的处理液处理好,要不然就会影响透析效果(亲身体会过)。
谢谢楼上的各位的帮忙,因为我上次也做过这个蛋白的表达(夏天时做的),用PBS透析没有出现絮状沉淀,同时跑PAGE也只有一条目的带,不知为什么这次用PBS透析却出现沉淀,实验室的同事建议用TE透析,我重新提了一次蛋白再用TE透析,虽然没有出现沉淀,但是跑PAGE却出现多条带(包括目的带)(注:实验室条件有限,没有用过柱的方法,而是用SKL,及还原型氧化型谷胱甘肽处理),实验又陷入了僵局,.我该如何改进我的实验方案?
艳过刘痕,你能告诉我你提蛋白的步骤吗,(我提的是包涵体),谢谢.对出现沉淀的蛋白我应该如何处理,如果离心去沉淀,对转速和时间有没有要求??
艳过刘痕,你能告诉我你提蛋白的步骤吗,(我提的是包涵体),谢谢.对出现沉淀的蛋白我应该如何处理,如果离心去沉淀,对转速和时间有没有要求??这个问题回答起来就比较多了,我简单的给你说一下吧。1、重组菌与培养基按1:100的比例摇大约六七个小时,总之是达到OD值6002、加入IPTG至终浓度为1M,继续摇4小时左右。3、离心(12000/15min)取沉淀,称量湿菌体重量,每克湿菌体加8mlPBS,剧烈振荡混匀。4、反复冻融(-80度60min/37度10min)5、超声裂菌120次(10s/10s)6、离心(15000/15min)取沉淀加入溶液1洗涤后置冰上40min,离心(15000/15min)取沉淀。7、加入溶液2洗涤后置冰上40min,离心(15000/15min)取沉淀。8、加入溶解液,并加入DTT至终浓度为0.05M左右。9、4度放置过夜。10、离心(16000/15min)后取上清,或过柱纯化或直接应用。各段取样品跑PAGE胶看结果。我不太赞成沉淀重新处理,因为蛋白经过的程序越少就越好。一定要处理就用8M的尿素重新溶解就行了。大概是这样,希望对你有帮助。
呀,这里好多复性高手哟,我遇到一个问题就是:为什么在透析过程中蛋白会被降解了各位高手有什么办法吗..复性都做了好久了,就是解决不了呀可以交流吗
哦,还有个问题,我用盐酸胍容的 ,,.我看资料上说他一般是在1.5M时复性完全,,,为什么我已经将其浓度将到1.5M一下后再用不含盐酸胍的PBS做终透析还会沉淀.. 另外,出现沉淀一般都是在盐酸胍浓度为1.5--2M时,,好象怎么缓慢降低其盐浓度都会沉淀,,,如何可以避免呢急盼各位老师的回复谢谢!!!!!!
透析沉淀是一个大问题,问题在于往往是大量沉淀,余下可溶的几乎没有了。现在我只能放弃透析,改用最原始最简单的稀释复性法了,希望有高手全面解答一下透析沉淀的问题
溶液1溶液2溶解液怎么配啊
艳过刘痕,溶液1,溶液2,溶解液怎么配啊 ?谢谢
艳过刘痕,溶液1,溶液2,溶解液怎么配啊 ?谢谢洗涤液1:60mM EDTA4%Triton X-1001.5MNaclPH7.0洗涤液2:0.1MTris-cl20mM EDTA2M UreaPH7.0包涵体溶解液:0.1M Tris-cl8MUrea5mM DTTPH8.0
感谢艳过刘痕朋友的积极参与!
呀,这里好多复性高手哟,我遇到一个问题就是:为什么在透析过程中蛋白会被降解了各位高手有什么办法吗..复性都做了好久了,就是解决不了呀可以交流吗 哦,还有个问题,我用盐酸胍容的 ,,.我看资料上说他一般是在1.5M时复性完全,,,为什么我已经将其浓度将到1.5M一下后再用不含盐酸胍的PBS做终透析还会沉淀.. 另外,出现沉淀一般都是在盐酸胍浓度为1.5--2M时,,好象怎么缓慢降低其盐浓度都会沉淀,,,如何可以避免呢急盼各位老师的回复谢谢!!!!!! 怎么没有回话呀,,,我很着急呀
可能沉淀是不可避免的,但只要溶液中有你的蛋白不就行了
艳过刘痕xsvulture这次我用万金油透析在1M盐酸胍稳定了4小时都没有沉淀,然后再透析到1.5M时又大量沉了,,是为什么呢怎么解决呀,,,急呀!!!!!!!(我也是做干扰素)
艳过刘痕xsvulture这次我用万金油透析在1M盐酸胍稳定了4小时都没有沉淀,然后再透析到1.5M时又大量沉了,,是为什么呢怎么解决呀,,,急呀!!!!!!!(我也是做干扰素)复性的概念:通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构,同时去除还原剂使二硫键正常形成。透析是简易的复性过程,对于尿素而言,在尿素浓度4M左右时复性过程开始,到2M 左右时结束。对于盐酸胍而言,可以从4M开始,到1.5M 时复性过程已经结束。所以我不是很明白为什么朋友是从低浓度往高浓度透析呢?透析出现少量沉淀是正常的,如果没有沉淀你才应该更担心呢。如果出现大量的沉淀则可能是由于复性液浓度和PH值变化过烈,其他条件变化过快。透析时应该采取复性液浓度和PH值逐渐变化的方法,此外透析时条件要温和,使蛋白质能够正确折叠。
艳过刘痕 :哦,,sorry,,,打错了,是透析在1M盐酸胍稳定了4小时都没有沉淀,然后再透析到0.5M时又大量沉了透析出现少量沉淀是正常的,如果没有沉淀你才应该更担心呢这是为什么呢,,是怀疑被降解了吗感谢回复
甘油该没有起还原剂的作用把
艳过刘痕 :哦,,sorry,,,打错了,是透析在1M盐酸胍稳定了4小时都没有沉淀,然后再透析到0.5M时又大量沉了透析出现少量沉淀是正常的,如果没有沉淀你才应该更担心呢这是为什么呢,,是怀疑被降解了吗感谢回复怀疑降解是一个方面,另一个方面就是如果没有沉淀的话,就是说你的蛋白全是可溶的了,这好像不太可能。所以我看到有经验的人说,如果透析时没有出现沉淀的话就说明透析的效果不太好。至于为什么再1M的时候没有出现沉淀,而在0.5M的时候出现,我想大概就是由于只有在一定的条件下,蛋白才沉淀,这个一定的条件,大概就是0.5M吧,呵呵。完全是自己的理解,希望对你有点帮助。
谢谢  艳过刘痕 :还有甘油在这里起什么作用呢
谢谢  艳过刘痕 :还有甘油在这里起什么作用呢甘油的作用很简单的,你还记得在菌株保种的时候加过甘油吗?其实这里面加甘油的目的可能就是为了透析后样品能长时间的保存而已。其实万金油不一定就是只能加5%的甘油的,我有几次都是加的30%,之后样品放-60度冰箱中可以保存好长时间。甘油没有还原的作用,万金油中起还原作用的是有条件是加入的还原型的谷胱甘肽,呵呵。
艳过刘痕高手就是高手,,,还有几个问题请教,,1.为什么PBS和TE作复性缓冲液是对复性有那么大的影响,,我用PBS时几乎没有可容蛋白,,而换了万金油后可容性很好..这和他门的化学性质到底有什么关系呢,,如果要讨论这个问题 应从那些方面考虑,,有那些资料可以参考吗?2.甘油的问题.甘油含有-OH基.在通常的反应中应表现为还原性,,如果他仅在保存时起缓冲作用的话,那么为什么在不加它时,容易沉淀的多.3.关于谷胱甘肽的问题.我门都认为氧化型谷胱甘肽起氧化二硫键的作用,而还原型的作用好象是对氧化型谷胱甘肽的氧化作用起平衡作用,然而,还原型氧化型谷胱甘肽溶液是及不稳定的易被氧化成氧化型的..那,是什么使还原型氧化型谷胱甘肽被氧化呢,,应该是氧.由此推论,,氧使还原型氧化型谷胱甘肽被氧化.氧化型谷胱甘肽起氧化二硫键,还原型平衡氧化型谷胱甘肽的氧化平作用.还原型氧化型谷胱被氧化成氧化型后.会加剧对二硫键的氧化作用,,对氧化-还原谷胱甘肽对而言这似乎有点矛盾..另外,,既然溶液中有能使还原型谷胱甘肽氧化成氧化型谷胱甘肽的物质,,按氧化还原规律那么就应该有比氧化型谷胱甘肽更强氧化能力的物质,,换句话说,,有比氧化型谷胱甘肽更易氧化二流键形成的物质,,从这个意义上讲 ,用昂贵的氧化型谷胱甘肽似乎有点说不过去..以上为笨鸟一时说想,,也不知道是否正确..希望各位高手指点..谢谢!!!!!!!!
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提蛋白遇到瓶颈了,实验没法继续,各位大侠帮帮忙,一起找一下原因
我最近在用3T3-L1做胰岛素抵抗模型,分化前脂肪细胞用这个方法是可以提出来的,但是分化后和胰岛素抵抗模型的蛋白一直提不出来,不知道具体问题出在哪了?
我具体提蛋白的基本步骤是:
1、吸去培养液,然后静置一会儿使残余培养液流到瓶底后再用移液器将其吸走。
2、用刮铲收集细胞,每个大皿加入100 μl 裂解液(RIPA强,碧云天,加10 μl PMSF(100mM)的比例),用移液枪吹悬均匀,于冰上裂解20min。
或者用胰酶消化收集细胞,PBS清洗后离心去上清液,加入同样的细胞裂解液,用移液枪吹悬均匀,于冰上裂解20min。
或者用胰酶消化收集细胞,PBS清洗后,用1mL玻璃组织匀浆器匀浆后,离心去上清,加入同样的细胞裂解液,用移液枪吹悬均匀,于冰上裂解20min。(这三种方法都尝试过,但是都没有作用,离心的转速都不超过2000rpm,不超过10min)
3、于4℃下15000rpm离心10min。(提前开离心机预冷)。
4、BCA定蛋白,蛋白量总是零点几,太低了,跑电泳更是没有条带……
求助各位大侠帮忙分析分析,找找原因。:work:
先感谢您的回复~我用了您说的500uL裂解液进行提取,结果还是没有出来,我想请问这个提取分化后的脂肪蛋白有没有什么更特别的处理呢,因为这个确实细胞中脂肪含量很高~:work:
裂解液已经换了好几种了,包括碧云天的RIPA裂解液(强),还有凯基的RIPA裂解液(强),结果都大同小异,发光出不来条带,一般提取蛋白的话这个超声破碎细胞的仪器用的很多么?效果有更明显的变化么?
这个亲和层析或者金属螯合层析一般都什么情况下用呢,平时蛋白提取的话用的很多么?
平时我们就用的不少,不光用到抗体,也用到其他的与目的蛋白质可以相互作用的其他生物大分子,比如:受体-配体、酶-底物,这有什么可奇怪的!?我已经告诉了你一种最简单的处理办法。
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