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缓存文件写入失败！:./APP/Runtime/Cache/Index/9cd4ea1ca2a8f5e45afbe2.php正相高效液相色谱法制备银杏内酯A和银杏内酯B-技术前沿-新闻中心-国家标准物质网
>> 正文阅读
正相高效液相色谱法制备银杏内酯A和银杏内酯B
【关键词】 国家标准物质 标准物质网 国家标准物质中心
摘要:以实验室自制的银杏浸膏精制物为原料，采用正相高效液相色谱法分离制备得到银杏内酯A、银杏内酯B单体．采用Ф40mm×300mm正相色谱柱、蒸发光散射检测器等组成的制备色谱系统，以乙酸乙酯、石油醚和甲醇混合溶剂作为流动相，通过考察流动相中溶剂配比、流速和上样量等因素对分离效果的影响，确定了适宜的色谱条件：流动相中乙酸乙酯、石油醚和甲醇的体积比为55：40：5、流速26mL／min、上样量120mg．经过一次分离即可得到银杏内酯A、B单体，纯度可达99．7％和98．4％，收率分别为73．8％和74．2％．采用IR、^13C—NMR、^1H—NMR及质谱进行结构鉴定，结构数据与文献值相符. 关键词:高效液相制备色谱 银杏内酯A 银杏内酯B
Preparation of Ginkgolides A and B by Normal-Phase High Performance Liquid Chromatography
Abstract:This research explores methods to biloba extract （GBE, EGb 761 ） by means separate individual ginkgolides A and B from the enriched ginkgo of normal-phase high-performance liquid chromatography （NPHPLC）. The chromatographic system consisted mainly of a Ф 40 mm × 300 mm column packed with silica gel and an evaporative light scattering detector. The influence of factors, such as the solvent composition, the flow rate of mobile phase and the sample load, on separation efficiency was studied to determine the suitable eluting condition. The results were as follows ： the mobile phase was the mixed solvent of ethyl acetate-petroleum ethermethanol with volumetric ratio of 55： 40： 5. 120 mg sample was eluted at the flow rate of 26 mL/min. With one separation process ginkgolides A and B monomer with the purity of 99.7% and 98.4% and yields of 73.8% and 74.2% were obtained respectively. The structure identification results by IR, ^13 C-NMR, ^1H-NMR and MS showed good agreement with those in literature .
Key words:preparative high-performance l ginkgolide A; ginkgolide B
银杏内酯(ginkgolide)是银杏叶提取物中的一类 重要活性成分，即二萜内酯化合物，包括银杏内酯A、 B、C、J和M(简称GA、GB、GC、GJ和GM)等．药理研 究⋯表明银杏内酯为强血小板活化因子拮抗剂(PAF) 和抗氧化剂，具有扩张血管、增加血流量、改善微循环及清除自由基的作用，其中GB的生理活性最强，具有 更高的药用价值．目前国外已经制得以银杏内酯单体 为主要成分的药剂，如BN52021(银杏内酯B)和 BN52063(银杏内酯A、B和c的混合物，摩尔比为 2：2：1)，它们已经进入临床Ⅲ期实验 ．但由于技术保密和经济竞争等因素，关于制备银杏内酯单体的文 献报道较少．目前采用的制备方法有反复柱色谱 法 ]、反相高效液相色谱法 及梯度洗脱中压液相色 谱法 ]，这些方法存在操作程序繁琐或设备昂贵等缺 陷；余佳红等人 采用高效的高速逆流色谱法，但只 分离得到白果内酯单体，未制备出银杏内酯A、B单 体；正相高效液相色谱法是纯化难分离混合物的主要 手段之一，载体填料价格便宜．研究和开发经济、高效 的银杏内酯单体制备工艺是充分利用我国银杏资源， 获得更高经济效益和社会效益的有效途径.
笔者采用的原料是将市售的银杏浸膏(EGb， ，总 内酯含量≥6％)经预处理 和活性炭脱色得到的银 杏内酯精制物(总内酯含量&／90％)，以降低杂质对制 备色谱分离过程的负荷及对色谱柱使用寿命的不利影 响．制备型高效液相色谱(high performance liquid hro— matography，HPLC)具有高效、分离条件温和的特点，成 为植物有效活性成分分离纯化的必要手段．
1 实验部分
1．1 仪器与试剂
仪器包括Gilson Lab—pre制备型高效液相色谱仪 (Gilson 306型泵，Gilson 206型馏分收集器，Rheodyne 5 mL定量进样环，Unipoint1．65工作站)、Spectra SYS— TEM分析型高效液相色谱仪(P 4000四元梯度泵， RJaeodyne 25 ixL定量进样环，ChromQuest 2．1工作 站)、Alhech 500 ELSD蒸发光散射检测器、Sz一93自动 双重纯水蒸馏器、Heidolph 4000旋转薄膜蒸发器、 BRUKER AC．P 200 MHz核磁仪、Varian Unity．TLUS 400 Hz核磁仪、VGZAB．HS型质谱仪和Nicolet-560型 红外色谱仪．
试剂有青岛海洋化工厂生产的H型薄层层析硅 胶(1O～40 m)、河北兴科化工有限公司生产的色谱 纯甲醇、天津市三达生物医学有限公司生产的色谱纯 四氢呋喃、天津市化学试剂三厂生产的分析纯石油醚、 乙酸乙酯和甲醇．
1．2 色谱条件
制备型的HPLC：4,40 mm×300 mm硅胶制备色谱 柱，流动相为甲醇、乙酸乙酯和石油醚混合溶液，流速 为l3～30 mL／min，蒸发光散射检测器漂移管温度 100 oC，载气流速为2．69 L／min，进样体积为5 mL，柱 温为室温．
分析型的HPLC：SynChropak RP—P C18柱(250 mm×4．6 mm，5 m)，流动相为水、甲醇和四氢呋喃混合溶液(体积比为75：20：10)，流速1 mL／min，蒸发 光散射检测器漂移管温度105 oC，载气流速为2．69 L／ min．进样体积为2O ，柱温为室温．
1．3 实验方法
实验室自制的银杏浸膏精制物中总内酯含量为 96．5％，其中GA、GB和GC的含量分别为12．25％、 44．35％ 和39．9％ ．
取一定量银杏浸膏精制物用甲醇、乙酸乙酯和石 油醚混合溶液超声溶解，经0．45 m滤膜抽滤后进 样，进行高效液相制备色谱分离．按制备型色谱条件洗 脱，根据蒸发光散射检测器的检测信号在线收集产品 流出液，各流出液经旋转薄膜蒸发器浓缩去除溶剂后， 将固体粉末进行重结晶．GA、GB和GC分别用体积比 为6：4、4：6、7：3的甲醇／水溶液进行重结晶纯化．最终 得到的产品采用分析型HPLC按色谱条件进行纯度检 测(面积归一化含量)．
实验中改变流动相各组分的配比，使得相邻两组 分间的分离度 增加，优化色谱柱的分离效果．通过 色谱泵调节流动相流速在13～30 mL／min范围内，以 寻求最佳的洗脱液流速，保证较高的分离效率以及较 快的操作周期．改变上样量寻求最佳的处理能力．
2 结果与讨论
2．1 流动相组成对分离效果的影响
在上样量为105 mg、流动相流速为18 mL／min的 条件下，在硅胶柱层析实验的基础上 J，将流动相确 定为乙酸乙酯、石油醚和甲醇的混合溶剂，其比例分别 取为70：25：5、65：30：5和55：40：5．实验结果表明，随 着乙酸乙酯比例的减小和石油醚比例的加大，流动相 极性减小，GB和GA的分离度加大，由无法分开到基 本上实现了基线分离，并且两峰之间的拖尾现象也有 所改善．因此，选择体积比为55：40：5的乙酸乙酯、石 油醚和甲醇的混合溶剂作为流动相，其在线检测色谱 图如图1所示．
2．2 流动相流速对分离效果的影响
以乙酸乙酯、石油醚和甲醇的混合溶剂(体积比 为55：40：5)作为流动相，保持上样量为105 mg／5 mL， 分别在流动相流速为30 mL／min和26 mL／min条件下 进行实验．实验结果表明，流速过高导致GA和GB分 离度下降，两组分的分离峰出现重叠，影响产品纯度； 流速过大造成峰型拖尾，并且基线漂移，影响分离效 率，在线检测色谱如图2所示．由此可见，采用流速为 26 mL／min作为最佳的操作流速，既保证了分离效率又使分离周期较合理，在线检测色谱图如图3所示.
图1 最佳流动相组成条件下银杏内酯的制备色谱图 Fig．1 Chromatiogram of isolating ginkgoHdes using suitable eluent
图2 高流动相流速条件下银杏内酯的制备色谱图 Fig．2 Chromatorgam of isolating ginkgolides with high flow rate of eluent
图3 最佳流动相流速条件下银杏内酯的制备色谱图 Fig．3 Chromatogram of isolating ginkgolides with suitable flow rate of eluent
2．3 上样量对分离效果的影响
为了保证一定的生产能力，制备色谱通常在超载 条件下进行分离，样品各组分在流动相和固定相中的 浓度呈非线性关系，样品中的一个或多个峰的保留时 间变小，分离度变坏．为了确定适宜的上样量，在确定 了流动相的最佳组成及流速的条件下，将上样量提高 为120 mg、140 mg和160 mg．实验结果表明，上样量为120 mg时，各物质对之间基本上实现了完全分离(在 线检测色谱图如图4所示)；而当上样量大于此值时， 由于GA和GB两峰之间出现重叠，会影响产品的纯度 (在线检测色谱图如图5所示)．因此上样量为120 mg 是适宜的，既提高了处理能力，又保证了产品的纯度．
图4 适宜上样量时银杏内酯的制备色谱图 Fig．4 Chromatogram of isolating ginkgolides with suitable sample load
图5 上样量为140 mg时银杏内酯的制备色谱图 Fig．5 Chromatogram of isolating ginkgondes wiUl 140 sam ple load
过高或过低的上样量对于内酯总收率都有不利影 响，只有上样量等于或略大于制备柱的线性容量时，才 能使色谱柱的分离效率保持较高的水平，得到较好的 结果．本研究中上样量为120 mg时，银杏内酯的总收 率达到74．4％．
由实验确定了适宜的制备色谱操作条件，即流动 相中乙酸乙酯、石油醚和甲醇的体积比为55：40：5，流 速为26 mL／min，上样量为120 mg．在此条件下得到 了纯度分别达99．7％和98．4％的银杏内酯A和银杏 内酯B，收率分别为73．8％和74．2％．
2．4 银杏内酯A和银杏内酯B结构鉴定
2．4．1 有机核磁共振谱图测定
对分离出的单体GA和GB进行核磁共振氢谱 ( H．NMR)、核磁共振碳谱( C．NMR)和DEPT 135测 定．银杏内酯A与银杏内酯B的 C．NMR信号归属如表1所示， H—NMR信号归属如表2所示.
表1 银杏内酯A和B的uC．NMR数据 Tab．1 u C．NM R data for ginkgolides A and B
表2 银杏内酯A和B的 H-NMR数据 Tab．2 H．NMR data for#nkgofides A and B
样品GA和GB的¨C—NMR和 H—NMR数据与文 献值 一致．GA的DEPT135的谱图中化学位移为36 处有两个反向峰，表明GA的分子结构中有两个仲碳 存在；GB的DEPT135的谱图中在化学位移为42的地 方有1个反向峰，表明在GB的分子结构中有1个仲 碳存在．结果均与GA与GB的分子结构一致．
2．4．2 红外光谱分析
纯化样品GA在红外光谱(KBr)中3 494 cm 处 的峰显示有一0H的伸缩振动；1 060～1 230 cm 处 的峰显示有c一0的伸缩振动；在1 760～】800 cm 处的峰显示有五元内酯环及一C00C的存在；1 454 cm 处有中等强度的吸收峰显示有t—Bu官能团存在．
纯化样品GB在红外光谱(KBr)中3 511 cm 处 的峰显示有一0H的伸缩振动；1 040～1 100 cm 处 的峰显示有c一0的伸缩振动；在1 780 cm 处有强 吸收峰，显示有五元内酯环及一c00c的存在；在 1 357 cm。。左右有峰显示16位碳上存在甲基；在 1 357 cm 处有中等强度的吸收峰，显示有t—Bu官能 团存在．
2．4．3 银杏内酯A与B的质谱谱图的波谱分析
采用电子轰击电离质谱测定GA，快速原子轰击 质谱测定GB．
纯化样品GA在El—MS测定谱图中有408．2、406 等峰，基峰57显示分子中有t—Bu．结合408．2的分子 离子峰M ，可知化合物的分子式为C如H： 0。，与GA 的相对分子质量的文献值408．4一致.
纯化样品GB在FAB测定谱图中有424．4和 139．1等峰，基峰61显示分子中有t—Bu．结合424．4的 分子离子峰M ，可知化合物的分子式为C加H 0 。，与 GB的相对分子质量的文献值424．4一致.
结合有机波谱分析表明，色谱分离出的单一内酯 组分即为银杏内酯A与银杏内酯B单体．
(1)采用 40 mm X 300 mm正相色谱柱，由银杏 浸膏精制物制备银杏内酯单体A、B的适宜条件：流动 相为乙酸乙酯、石油醚和甲醇的混合溶剂(体积比为 55：40：5)，流速为26 mL／min，上样量为120 mg．
(2)本方法制得的银杏内酯单体A和B经IR、 ”C—NMR 、 H—NMR及质谱进行结构鉴定，结构数据与 文献值一致．
【来源/作者】国家标准物质网lili；【更新日期】 14:17:36
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