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为什么western blot结果中,蛋白质检测分子量会与计算大小不同
杨伊凡880rWm
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Western blot检测分子量的结果与理论计算值有差异是非常正常的事情Western blot检测最重要的意义在于目的蛋白在某细胞或组织中表达情况的定性.而目的蛋白检测分子量的大小取决于目的蛋白在SDS-PAGE的结果,也就是说如果目的蛋白在SDS-PAGE上检测结果是分子量偏大的,那么在Western blot转膜后也会是偏大的,这和目的蛋白的结构（糖基化修饰）,电泳迁移率,缓冲液组成等等都有关系.所以只是一个相对的分子量的结果.要精确检测目的蛋白的分子量结果需要做质谱（MS）检测
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【求助】western blot 和 RT-PCR呈相反趋势怎么回事？
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这个帖子发布于9年零230天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我做了一个基因的不同发育时期的western blot 和 RT-PCR，结果却呈相反趋势，怎么回事？要怎样去解释呢？？
不知道邀请谁？试试他们
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首先，你的实验重复了几次？如果单是一次的结果，并不能说明什么问题。就WB而讲，存在的问题就有很多，首先上样前应该严格定量准确，为什么？因为在以后的内参曝光中，存在着一个平台期，并不能显示出上样是否真的一致，给你一个图，这是我自己实验碰到的，同一张膜上的目的蛋白和内参，看样子是不是第二组表达下降了？但事实上，染了胶，第二泳道的上样量要小好多，因为蛋白浓度定量不准确导致上样量不一致，但是内参看着却是相当的。同样，你能保证你的PCR结果么？实验中很多误差是不可避免的。另外讲到，作了蛋白再做基因的问题，如果你的蛋白在体内是有好多异构体的，尤其是受体那一块，我算是吃了亏的，其实哪种异构体表达并不单和细胞组织的特异性有关，还和好多原因，比如细胞的状态，也许传一代和传几代完全不一样。比如你做了蛋白表达，刚好isoform 1表达， 而且表达增加的，然后你再养一批细胞， 作PCR，恰好占主导表达的就是另外一种isoform了，这样的问题不是不存在，要注意，所以引物什么的一定要设计好， 核酸蛋白marker一定要严格对照起来。western blot 和 RT-PCR一般结果趋势还是相一致的，当然如果存在着其他调解的情况，如转录后，或翻译后水平的， 也不排除这种可能性。对于你的情况，主要还是得多重复几次，一次的结果不一定就是正确的，如果把你的问题再具体讲讲，战友们帮上的忙会多一些。
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iris_palm 编辑于
我个人觉得您这个试验是否可以从两个方面来考虑这个结果？一个方面是理论层次另一个层次是试验结果分析由于我自己水平的限制，说的可能不完整，甚至不一定对，不过既然是分析问题，我就当作抛个砖头，期待高手们的精彩分析。理论层次：1.mRNA与蛋白量的变化不一定呈线性一致性的关系，它与转录效率，转录后降解的速度也很有关系。2.翻译水平上各种因素调节的关系，特别你是在做发育相关的试验，是否存在某种调控机制在发育的初始阶段，从翻译水平上抑制了这个蛋白的表达；发育中后期由于另外一些因子或者蛋白的表达，解除了该抑制因素的调控，蛋白表达逐渐回复？3.一些研究热点，如miRNA，也是调节翻译水平的，导致蛋白不表达或降解mRNA。4.....还有很多相关内容，你可以检索版子，大致的方向应该这样的，那可能其中涉及的因素是很多了，水平限制无法详细说明了，提供一个参考方向吧。试验层次：1.你目前所说的变化，都是基于你肉眼的观察，如wb结果？（不知道我是否理解正确？）具体的RT结果和WB结果的统计学分析不知道你进行了没？你的样本量有多少，做了标准差、p值分析？是否有统计学意义？2.你的mRNA与WB结果是否有统一的内参？如GADPH。如果没有统一的内参，你所称为的高低是不能够很具说服力的。3.......一些自己的看法，供你参考。水平限制，说的不对的地方，还请大家指教。
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呵呵，即使你实验没有问题（内参、定量等等），那RT-PCR和WB的结果相反，有时也正常。1. mRNA不等于protein：举个经典的例子：CUGBP2蛋白可以结合COX-2的mRNA，抑制其翻译，但可以稳定COX-2的mRNA：以此，检测可以发现protein的量降低，但mRNA的量增加。因此，你要确认你所作的基因，是mRNA起作用，还是protein起作用，如果是protein起作用，那你就只以protein为准即可。2. RNA及protein的合成及降解速度不一致；
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1. RT是指Real Time还是Reverse Transcription?2. 两个实验都有严格的内参或对照吗？3. 相反是指什么？蛋白随mRNA的增多而减少还是随mRNA的减少而增多？！
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RT是指Real Time,都有对照的.结果是mRNA的表达在不同时期呈下降趋势，而蛋白质的表达却呈上升趋势，很纳闷，实验做的没问题！！
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首先，你的实验重复了几次？如果单是一次的结果，并不能说明什么问题。就WB而讲，存在的问题就有很多，首先上样前应该严格定量准确，为什么？因为在以后的内参曝光中，存在着一个平台期，并不能显示出上样是否真的一致，给你一个图，这是我自己实验碰到的，同一张膜上的目的蛋白和内参，看样子是不是第二组表达下降了？但事实上，染了胶，第二泳道的上样量要小好多，因为蛋白浓度定量不准确导致上样量不一致，但是内参看着却是相当的。同样，你能保证你的PCR结果么？实验中很多误差是不可避免的。另外讲到，作了蛋白再做基因的问题，如果你的蛋白在体内是有好多异构体的，尤其是受体那一块，我算是吃了亏的，其实哪种异构体表达并不单和细胞组织的特异性有关，还和好多原因，比如细胞的状态，也许传一代和传几代完全不一样。比如你做了蛋白表达，刚好isoform 1表达， 而且表达增加的，然后你再养一批细胞， 作PCR，恰好占主导表达的就是另外一种isoform了，这样的问题不是不存在，要注意，所以引物什么的一定要设计好， 核酸蛋白marker一定要严格对照起来。western blot 和 RT-PCR一般结果趋势还是相一致的，当然如果存在着其他调解的情况，如转录后，或翻译后水平的， 也不排除这种可能性。对于你的情况，主要还是得多重复几次，一次的结果不一定就是正确的，如果把你的问题再具体讲讲，战友们帮上的忙会多一些。
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iris_palm 编辑于
正如iris_palm所说，你可以把实验及结果在具体讲一讲，这样分析起来才会更有的放矢。另外我提到的严格的内参或对照，是指不管参照还有目的蛋白或mRNA都不能过饱和，正象iris_palm帖得图，下面的对照就是不合适的，要选择和目的蛋白或mRNA相似丰度的参照才能说明问题，或者如iris_palm所做的，用多种方法验证结果的可靠性。
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你好，首先感谢上面几位的回答，也感谢师弟帮我发这个帖子。下面我就把实验的具体细节说一说。
我做的是对一个基因的不同发育时期（不是细胞，是动物个体不同年龄阶段，正常发育）的表达情况的检测。先做的是RNA水平的，用Real－Time PCR检测的，以看家基因actin作为内参，得到的结果是，年龄增大，RNA水平是逐渐下降的，其中，在刚出生时水平最高。然后我想看看蛋白的表达情况，于是用了相同的个体采的样提取的蛋白做了一下WB，WB蛋白没有用看家基因，是用的总蛋白定量，用于跑2D的蛋白样，因为我是做猪的，没有猪的相应抗体，用的鼠的来代替（多抗），所以并不是很特异，（这是无赖之举）所有的样做出来杂带的亮度都差不多，只有在相应分子量大小的地方的带（基本可以确定是自己要的带）的亮度有差别。但是从初生开始，亮度是逐渐递增的，也就是说与RT检测的结果趋势是相反的。因为我是买的抗体，数量有限，而且还有很多样要做，所以没敢重复多次，但是整个做的过程我觉得应该是没有问题的，而且条带也很清晰，在同一张膜上做的。但是因为结果不好解释，就没再做，我想先找到可能的问题再做，这样对症下药，也不至于浪费东西。希望各位战友能够帮忙分析分析。
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上面说的isoform的问题或者是变异体（variant）的问题，应该是一个值得考虑的问题，我会好好的检查一下的，谢谢。
另外，我对蛋白质这一块做得不是很多，对于蛋白和RNA表达水平是否会出现不一样的趋势不是很清楚，我想知道的是这种情况是否存在？
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多谢jnuxz，分析得很有条理，也给了我很多启发。
关于理论的1，我也想过，理论上应该有，但具体来说，一个蛋白的降解速率是多少，大概范围是多少？怎么知道它的降解速度或者是半衰期？有参考的网站吗？
关于理论的2，3我会考虑并查阅文献，谢谢。
关于试验层次的，wb是用的蛋白总量定的量，RT是做了real-Time,用看家基因actin矫正的结果，均为四个样本，蛋白，RNA的来源个体都一样。wb是肉眼观察的结果，RT是数据处理的结果。jnuxz分析得很对，可能内参不太一样，会影响结果的判断。但是因为我的结果中RT的两个阶段差别很大，是几百的差别，所以即使是误差，也不会这么离谱，而且RT我做过好几次，不同批次的样品也做过，RT应该是不会有错的，wb做过一个预试验，效果还是可以的
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wb是用的蛋白总量定的量 ？ 你几个wb样品是在同一个标准曲线下定的量还是不同批次定的量希望你是所有样品一批定的量
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kuaizaifeng 正如iris_palm所说，你可以把实验及结果在具体讲一讲，这样分析起来才会更有的放矢。另外我提到的严格的内参或对照，是指不管参照还有目的蛋白或mRNA都不能过饱和，正象iris_palm帖得图，下面的对照就是不合适的，要选择和目的蛋白或mRNA相似丰度的参照才能说明问题，或者如iris_palm所做的，用多种方法验证结果的可靠性。我想请教一下kuaizaifeng战友，如何防止WB时的过饱和现象？先谢谢了
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ianm, 理想状况是选择和目的蛋白相似丰度的参照， 当然抗原抗体反应强度也要类似。另外可以通过梯度稀释样品找到合适曝光的WB，防止过饱和。
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如何选择与目的蛋白相似丰度的内参啊?"另外可以通过梯度稀释样品找到合适曝光的WB，防止过饱和。"什么是合适曝光的WB?能否说的详细一些啊?
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我看过类似结果的paper的.RNA水平和蛋白质水平不一致是很正常的现象.很有可能原因是你的目的蛋白受到另一个蛋白的调空:稳定这个蛋白或介导泛素化降解.
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dxb77, 选择与目的蛋白相似丰度的内参只能是查目的蛋白相关文献，看它大致的表达量，然后从相关文献中查找类似表达量的蛋白作参照。合适曝光而非过饱和的WB用肉眼很难判断，一定要用类似Bio-Rad ChemiDoc等测量灰度的仪器，总之把梯度稀释参照获得的信号作图来判断什么时候达到平台期，在那之外的定量是不准确的。
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kuaizaifeng dxb77, 选择与目的蛋白相似丰度的内参只能是查目的蛋白相关文献，看它大致的表达量，然后从相关文献中查找类似表达量的蛋白作参照。合适曝光而非过饱和的WB用肉眼很难判断，一定要用类似Bio-Rad ChemiDoc等测量灰度的仪器，总之把梯度稀释参照获得的信号作图来判断什么时候达到平台期，在那之外的定量是不准确的。我还是不知如何去找到平台期???比如我的目的蛋白是某种细胞中的蛋白A,你的意思是说找这个蛋白在细胞中的常规表达量吗?一般做参照的不是都 ACTIN或者GAPDH吗?如果这个蛋白A的表达量和这些内参的不一致,那怎么办? 另外"总之把梯度稀释参照获得的信号作图来判断什么时候达到平台期"
怎么操作呢? 看不懂,不好意思&
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dxb77, 拿蛋白定量举个例子，每个蛋白在UV Spec都有上限与下限灵敏度，在该范围之外的蛋白定量是不准确的，这样说是不是更能帮你理解，20mg/ml和100mg/ml的蛋白如果不稀释直接测定浓度，你觉得结果会可靠吗？
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lz的定量看样子应该没有问题的我现在做的与lz的相识但是趋势好象是一样的有机会交流交流啊
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呵呵，即使你实验没有问题（内参、定量等等），那RT-PCR和WB的结果相反，有时也正常。1. mRNA不等于protein：举个经典的例子：CUGBP2蛋白可以结合COX-2的mRNA，抑制其翻译，但可以稳定COX-2的mRNA：以此，检测可以发现protein的量降低，但mRNA的量增加。因此，你要确认你所作的基因，是mRNA起作用，还是protein起作用，如果是protein起作用，那你就只以protein为准即可。2. RNA及protein的合成及降解速度不一致；
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是不是可以这么解释：楼主是做的不同发育时期的的一个基因的表达水平。我们知道在受精卵胚胎阶段，很多基因都是开放的，转录大量的mRNA.这是因为机体需要在一个相对短的时间内合成足量的蛋白以行使功能。随着个体的不断发育，蛋白量的不断积累。到达一定的阶段时，机体不再需要这么多的mRNA来翻译这么多的蛋白了，以一种低水平的mRNA就能满足细胞的需要。注意在这里，蛋白不同于mRNA，蛋白特别是结构蛋白相对来说是稳定的，因此在发育早期，高水平的mRNA高速度的翻译蛋白，蛋白质不会降解掉，而是在为细胞成熟做积累。随着机体的发育，蛋白水平也是在不断积累的，因此细胞自身的调节导致mRNA水平的下降。所以出现了楼主所说的实验现象，完全符合客观事实。打个比方，幼猪时期的体重是绝对比一个成年出栏猪的小吧。为什么肉少啊，肉是什么？蛋白！！！但是幼猪这个时期的mRNA肯定比成年猪的要高啊。mRNA翻译出来的蛋白也就是肉都长到了猪身上，没有掉呢。一个是才几周的积累，一个是几个月长得肉，你说那个的蛋白多。。。。。当然，会有人说是细胞数目的增多，但是我们也可以把一个细胞看成一个个体，这种道理也是存在的。总的来说细胞在发育阶段很多蛋白也是要积累的，当到达一定量的时候mRNA水平下降，我们检测蛋白时发现蛋白高，是因为前期的积累。蛋白并没有降解而是积累起来了。
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diudouble 编辑于
楼上的说的都很对，我只想说一点就是启动子多样性（所谓的个体差异），不知楼主考虑没有，你的猪是不是近亲繁殖的呢？！！！个人愚见，如有错误，请指正1
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感谢各位的支持参与讨论！！
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diudouble的解释很有意思，似乎也比较合理，请问有相关的文献吗？
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mRNA水平的表达,可与蛋白水平一致,也可高,可低.
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MmpRS 楼上的说的都很对，我只想说一点就是启动子多样性（所谓的个体差异），不知楼主考虑没有，你的猪是不是近亲繁殖的呢？！！！个人愚见，如有错误，请指正1这跟近亲繁殖有关系吗？不明白，可以说得详细点吗？
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zebrafishtom 我看过类似结果的paper的.RNA水平和蛋白质水平不一致是很正常的现象.很有可能原因是你的目的蛋白受到另一个蛋白的调空:稳定这个蛋白或介导泛素化降解.请问可以推荐这方面的文献吗？
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mRNA水平和蛋白质水平不一致非常正常。相反，假如非常一致，我倒怀疑其有造假的可能。
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关于丁香园Western与RT-PCR的区别？ - 实验交流 - 生物秀
标题: Western与RT-PCR的区别？
摘要: Western与RT-PCR的区别？Western与RT-PCR的区别？我做的这个指标是个蛋白，有的文献做的是Western，有的做的是RT-PCR，我知道一个是测它蛋白的表达，一个是测它mRNA的表达，我就不清楚为什么都只做一种方法，我觉得两种都要做，做一种有意义吗？ RT-PCR 蛋白水平……
Western与RT-PCR的区别？
我做的这个指标是个蛋白，有的文献做的是Western，有的做的是RT-PCR，我知道一个是测它蛋白的表达，一个是测它mRNA的表达，我就不清楚为什么都只做一种方法，我觉得两种都要做，做一种有意义吗？回复:Western blot 检测的是蛋白水平，而RT-PCR检测的是mRNA，即基因水平的变化，一般来说，二者是平行关系，即基因水平的变化会引起蛋白水平相应的变化，但是从基因到蛋白也存在修饰等因素存在而出现基因水平升高而蛋白水平没有变化的情况，所以二者反应的是不同层次的变化。回复:这只是从不同的角度来分析，Western研究的是蛋白表达水平，RT研究的是转录水平，尽管二者都是研究基因表达的。但有一定差别，转录水平不完全等同于蛋白表达，因为它没有考虑到转录后调节的问题。但RT有一个好处，只有有序列就可以做，不象Western必须有抗体。并且RT可以研究同一基因不同亚型的表达，而同一蛋白亚型通常有多种基因型。选择哪一种须根据你的目的而言，能两种都做当然好，但有时候也会出现不相一致的结果，就看你如何解释。
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电话：021-western blot 和 RT-PCR呈相反趋势怎么回事？ - 实验交流 - 生物秀
标题: western blot 和 RT-PCR呈相反趋势怎么回事？
摘要: [western blot 和 RT-PCR呈相反趋势怎么回事？] 我做了一个基因的不同发育时期的western blot 和 RT-PCR，结果却呈相反趋势，怎么回事？要怎样去解释呢？？ 关键词:[RT-PCR 基因]……
我做了一个基因的不同发育时期的western blot 和 RT-PCR，结果却呈相反趋势，怎么回事？要怎样去解释呢？？
1. RT是指Real Time还是Reverse Transcription?2. 两个实验都有严格的内参或对照吗？3. 相反是指什么？蛋白随mRNA的增多而减少还是随mRNA的减少而增多？！
RT是指Real Time,都有对照的.结果是mRNA的表达在不同时期呈下降趋势，而蛋白质的表达却呈上升趋势，很纳闷，实验做的没问题！！
首先，你的实验重复了几次？如果单是一次的结果，并不能说明什么问题。就WB而讲，存在的问题就有很多，首先上样前应该严格定量准确，为什么？因为在以后的内参曝光中，存在着一个平台期，并不能显示出上样是否真的一致，给你一个图，这是我自己实验碰到的，同一张膜上的目的蛋白和内参，看样子是不是第二组表达下降了？但事实上，染了胶，第二泳道的上样量要小好多，因为蛋白浓度定量不准确导致上样量不一致，但是内参看着却是相当的。同样，你能保证你的PCR结果么？实验中很多误差是不可避免的。另外讲到，作了蛋白再做基因的问题，如果你的蛋白在体内是有好多异构体的，尤其是受体那一块，我算是吃了亏的，其实哪种异构体表达并不单和细胞组织的特异性有关，还和好多原因，比如细胞的状态，也许传一代和传几代完全不一样。比如你做了蛋白表达，刚好isoform 1表达， 而且表达增加的，然后你再养一批细胞， 作PCR，恰好占主导表达的就是另外一种isoform了，这样的问题不是不存在，要注意，所以引物什么的一定要设计好， 核酸蛋白marker一定要严格对照起来。western blot 和 RT-PCR一般结果趋势还是相一致的，当然如果存在着其他调解的情况，如转录后，或翻译后水平的， 也不排除这种可能性。对于你的情况，主要还是得多重复几次，一次的结果不一定就是正确的，如果把你的问题再具体讲讲，朋友们帮上的忙会多一些。
正如iris_palm所说，你可以把实验及结果在具体讲一讲，这样分析起来才会更有的放矢。另外我提到的严格的内参或对照，是指不管参照还有目的蛋白或mRNA都不能过饱和，正象iris_palm帖得图，下面的对照就是不合适的，要选择和目的蛋白或mRNA相似丰度的参照才能说明问题，或者如iris_palm所做的，用多种方法验证结果的可靠性。
你好，首先感谢上面几位的回答，也感谢师弟帮我发这个帖子。下面我就把实验的具体细节说一说。 我做的是对一个基因的不同发育时期（不是细胞，是动物个体不同年龄阶段，正常发育）的表达情况的检测。先做的是RNA水平的，用Real－Time PCR检测的，以看家基因actin作为内参，得到的结果是，年龄增大，RNA水平是逐渐下降的，其中，在刚出生时水平最高。然后我想看看蛋白的表达情况，于是用了相同的个体采的样提取的蛋白做了一下WB，WB蛋白没有用看家基因，是用的总蛋白定量，用于跑2D的蛋白样，因为我是做猪的，没有猪的相应抗体，用的鼠的来代替（多抗），所以并不是很特异，（这是无赖之举）所有的样做出来杂带的亮度都差不多，只有在相应分子量大小的地方的带（基本可以确定是自己要的带）的亮度有差别。但是从初生开始，亮度是逐渐递增的，也就是说与RT检测的结果趋势是相反的。因为我是买的抗体，数量有限，而且还有很多样要做，所以没敢重复多次，但是整个做的过程我觉得应该是没有问题的，而且条带也很清晰，在同一张膜上做的。但是因为结果不好解释，就没再做，我想先找到可能的问题再做，这样对症下药，也不至于浪费东西。希望各位朋友能够帮忙分析分析。
上面说的isoform的问题或者是变异体（variant）的问题，应该是一个值得考虑的问题，我会好好的检查一下的，谢谢。 另外，我对蛋白质这一块做得不是很多，对于蛋白和RNA表达水平是否会出现不一样的趋势不是很清楚，我想知道的是这种情况是否存在？
我个人觉得您这个试验是否可以从两个方面来考虑这个结果？一个方面是理论层次另一个层次是试验结果分析由于我自己水平的限制，说的可能不完整，甚至不一定对，不过既然是分析问题，我就当作抛个砖头，期待高手们的精彩分析。理论层次：1.mRNA与蛋白量的变化不一定呈线性一致性的关系，它与转录效率，转录后降解的速度也很有关系。2.翻译水平上各种因素调节的关系，特别你是在做发育相关的试验，是否存在某种调控机制在发育的初始阶段，从翻译水平上抑制了这个蛋白的表达；发育中后期由于另外一些因子或者蛋白的表达，解除了该抑制因素的调控，蛋白表达逐渐回复？3.一些研究热点，如miRNA，也是调节翻译水平的，导致蛋白不表达或降解mRNA。4.....还有很多相关内容，你可以检索版子，大致的方向应该这样的，那可能其中涉及的因素是很多了，水平限制无法详细说明了，提供一个参考方向吧。试验层次：1.你目前所说的变化，都是基于你肉眼的观察，如wb结果？（不知道我是否理解正确？）具体的RT结果和WB结果的统计学分析不知道你进行了没？你的样本量有多少，做了标准差、p值分析？是否有统计学意义？2.你的mRNA与WB结果是否有统一的内参？如GADPH。如果没有统一的内参，你所称为的高低是不能够很具说服力的。3.......一些自己的看法，供你参考。水平限制，说的不对的地方，还请大家指教。
多谢jnuxz，分析得很有条理，也给了我很多启发。 关于理论的1，我也想过，理论上应该有，但具体来说，一个蛋白的降解速率是多少，大概范围是多少？怎么知道它的降解速度或者是半衰期？有参考的网站吗？ 关于理论的2，3我会考虑并查阅文献，谢谢。 关于试验层次的，wb是用的蛋白总量定的量，RT是做了real-Time,用看家基因actin矫正的结果，均为四个样本，蛋白，RNA的来源个体都一样。wb是肉眼观察的结果，RT是数据处理的结果。jnuxz分析得很对，可能内参不太一样，会影响结果的判断。但是因为我的结果中RT的两个阶段差别很大，是几百的差别，所以即使是误差，也不会这么离谱，而且RT我做过好几次，不同批次的样品也做过，RT应该是不会有错的，wb做过一个预试验，效果还是可以的
wb是用的蛋白总量定的量 ？ 你几个wb样品是在同一个标准曲线下定的量还是不同批次定的量希望你是所有样品一批定的量
正如iris_palm所说，你可以把实验及结果在具体讲一讲，这样分析起来才会更有的放矢。另外我提到的严格的内参或对照，是指不管参照还有目的蛋白或mRNA都不能过饱和，正象iris_palm帖得图，下面的对照就是不合适的，要选择和目的蛋白或mRNA相似丰度的参照才能说明问题，或者如iris_palm所做的，用多种方法验证结果的可靠性。我想请教一下kuaizaifeng朋友，如何防止WB时的过饱和现象？先谢谢了
ianm, 理想状况是选择和目的蛋白相似丰度的参照， 当然抗原抗体反应强度也要类似。另外可以通过梯度稀释样品找到合适曝光的WB，防止过饱和。
如何选择与目的蛋白相似丰度的内参啊?"另外可以通过梯度稀释样品找到合适曝光的WB，防止过饱和。"什么是合适曝光的WB?能否说的详细一些啊?
我看过类似结果的paper的.RNA水平和蛋白质水平不一致是很正常的现象.很有可能原因是你的目的蛋白受到另一个蛋白的调空:稳定这个蛋白或介导泛素化降解.
dxb77, 选择与目的蛋白相似丰度的内参只能是查目的蛋白相关文献，看它大致的表达量，然后从相关文献中查找类似表达量的蛋白作参照。合适曝光而非过饱和的WB用肉眼很难判断，一定要用类似Bio-Rad ChemiDoc等测量灰度的仪器，总之把梯度稀释参照获得的信号作图来判断什么时候达到平台期，在那之外的定量是不准确的。
dxb77, 选择与目的蛋白相似丰度的内参只能是查目的蛋白相关文献，看它大致的表达量，然后从相关文献中查找类似表达量的蛋白作参照。合适曝光而非过饱和的WB用肉眼很难判断，一定要用类似Bio-Rad ChemiDoc等测量灰度的仪器，总之把梯度稀释参照获得的信号作图来判断什么时候达到平台期，在那之外的定量是不准确的。我还是不知如何去找到平台期???比如我的目的蛋白是某种细胞中的蛋白A,你的意思是说找这个蛋白在细胞中的常规表达量吗?一般做参照的不是都 ACTIN或者GAPDH吗?如果这个蛋白A的表达量和这些内参的不一致,那怎么办? 另外"总之把梯度稀释参照获得的信号作图来判断什么时候达到平台期" 怎么操作呢? 看不懂,不好意思&
dxb77, 拿蛋白定量举个例子，每个蛋白在UV Spec都有上限与下限灵敏度，在该范围之外的蛋白定量是不准确的，这样说是不是更能帮你理解，20mg/ml和100mg/ml的蛋白如果不稀释直接测定浓度，你觉得结果会可靠吗？
lz的定量看样子应该没有问题的我现在做的与lz的相识但是趋势好象是一样的有机会交流交流啊
呵呵，即使你实验没有问题（内参、定量等等），那RT-PCR和WB的结果相反，有时也正常。1. mRNA不等于protein：举个经典的例子：CUGBP2蛋白可以结合COX-2的mRNA，抑制其翻译，但可以稳定COX-2的mRNA：以此，检测可以发现protein的量降低，但mRNA的量增加。因此，你要确认你所作的基因，是mRNA起作用，还是protein起作用，如果是protein起作用，那你就只以protein为准即可。2. RNA及protein的合成及降解速度不一致；
是不是可以这么解释：楼主是做的不同发育时期的的一个基因的表达水平。我们知道在受精卵胚胎阶段，很多基因都是开放的，转录大量的mRNA.这是因为机体需要在一个相对短的时间内合成足量的蛋白以行使功能。随着个体的不断发育，蛋白量的不断积累。到达一定的阶段时，机体不再需要这么多的mRNA来翻译这么多的蛋白了，以一种低水平的mRNA就能满足细胞的需要。注意在这里，蛋白不同于mRNA，蛋白特别是结构蛋白相对来说是稳定的，因此在发育早期，高水平的mRNA高速度的翻译蛋白，蛋白质不会降解掉，而是在为细胞成熟做积累。随着机体的发育，蛋白水平也是在不断积累的，因此细胞自身的调节导致mRNA水平的下降。所以出现了楼主所说的实验现象，完全符合客观事实。打个比方，幼猪时期的体重是绝对比一个成年出栏猪的小吧。为什么肉少啊，肉是什么？蛋白！！！但是幼猪这个时期的mRNA肯定比成年猪的要高啊。mRNA翻译出来的蛋白也就是肉都长到了猪身上，没有掉呢。一个是才几周的积累，一个是几个月长得肉，你说那个的蛋白多。。。。。当然，会有人说是细胞数目的增多，但是我们也可以把一个细胞看成一个个体，这种道理也是存在的。总的来说细胞在发育阶段很多蛋白也是要积累的，当到达一定量的时候mRNA水平下降，我们检测蛋白时发现蛋白高，是因为前期的积累。蛋白并没有降解而是积累起来了。
楼上的说的都很对，我只想说一点就是启动子多样性（所谓的个体差异），不知楼主考虑没有，你的猪是不是近亲繁殖的呢？！！！个人愚见，如有错误，请指正1
感谢各位的支持参与讨论！！
diudouble的解释很有意思，似乎也比较合理，请问有相关的文献吗？
mRNA水平的表达,可与蛋白水平一致,也可高,可低.
楼上的说的都很对，我只想说一点就是启动子多样性（所谓的个体差异），不知楼主考虑没有，你的猪是不是近亲繁殖的呢？！！！个人愚见，如有错误，请指正1这跟近亲繁殖有关系吗？不明白，可以说得详细点吗？
我看过类似结果的paper的.RNA水平和蛋白质水平不一致是很正常的现象.很有可能原因是你的目的蛋白受到另一个蛋白的调空:稳定这个蛋白或介导泛素化降解.请问可以推荐这方面的文献吗？
mRNA水平和蛋白质水平不一致非常正常。相反，假如非常一致，我倒怀疑其有造假的可能。
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