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摘要 : GST表达融合蛋白 载体pGEX-KG 大小：5006bp，氨苄青霉素抗性(Ampr)，IPTG诱导表达酶切位点：BamHI 930、SmaI 937、EcoRI 962、XbaI 966、NcoI 974、SalI 980、XhoI 985、SacI 992、HindIII 994
大小：5006bp，氨苄青霉素抗性(Ampr)，表达
切位点：BamHI 930、SmaI 937、EcoRI 962、XbaI 966、NcoI 974、SalI 980、XhoI 985、SacI 992、HindIII 994
构建pGEX-KG-YFG重组
1、分析所感兴趣的基因(your favorite , YFG)
Primer Premier 5.0软件，分析YFG含有哪些酶切位点，注意是否与pGEX-KG载体的多克隆位点有重合
2、确定合适的双酶切位点
NEB网站() Double Digest Finder软件，查找最佳双酶切组合(下表)
NEB双酶切图谱
NEBuffer EcoRI + BSA at 37&C.
BamHI may exhibit star activity in this buffer.
NEBuffer 3 + BSA at 37&C.
At least one enzyme has & 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary.
NEBuffer 3 + BSA at 37&C.
NEBuffer 3 + BSA at 37&C
NEBuffer 3 + BSA at 37&C.
NEBuffer 4 + BSA at 25&C with SmaI, then add XbaI and raise temperature to 37&C.
At least one enzyme has & 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary.
NEBuffer 4 at 25&C with SmaI, then add NcoI and raise temperature to 37&C.
NEBuffer 4 + BSA at 25&C with SmaI, then add XhoI and raise temperature to 37&C.
NEBuffer 4 + BSA at 25&C with SmaI, then add SacI and raise temperature to 37&C.
NEBuffer 4 at 25&C with SmaI, then add HindIII and raise temperature to 37&C.
At least one enzyme has & 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary.
NEBuffer EcoRI at 37&C.
NEBuffer EcoRI + BSA at 37&C.
NEBuffer EcoRI + BSA at 37&C.
NEBuffer 1 + BSA at 37&C.
EcoRI may exhibit star activity in this buffer.
NEBuffer EcoRI at 37&C.
NEBuffer 2 + BSA at 37&C.
NEBuffer 3 + BSA at 37&C.
At least one enzyme has & 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary.
NEBuffer 2 + BSA at 37&C.
NEBuffer 4 + BSA at 37&C.
This buffer is not supplied with either enzyme.
At least one enzyme has & 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary.
NEBuffer 2 + BSA at 37&C.
NEBuffer 3 + BSA at 37&C.
NEBuffer 2 + BSA at 37&C.
NEBuffer 1 + BSA at 37&C.
NEBuffer 2 at 37&C.
NEBuffer 3 + BSA at 37&C.
NEBuffer 1 + BSA at 37&C.
At least one enzyme has & 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary.
NEBuffer 2 + BSA at 37&C.
NEBuffer 2 + BSA at 37&C.
At least one enzyme has & 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary.
对照YFG、载体多克隆位点，确定上、下游酶切位点
3、设计PCR上、下游引物
Primer Premier 5.0软件，设计PCR上、下游引物
酶切位点外最多含6个碱基
3&端不是A，最好是G或C，但是不推荐使用GC或CG结尾
3&端至少保证有10个碱基完全配对
得分(Rating)大于70
上游引物：是否添加适当碱基，确保不打乱开放阅读框
下游引物：添加终止密码子(UAA、UAG、UGA)
4、引物合成及保存
合成：上海生工生物工程技术服务有限公司(Email：，Tel：);纯化方法：柱层析or聚丙烯酰胺凝胶电泳?;价格1.30/碱基
保存：贮存浓度：100pmol/&l(100&M)，工作浓度：10pmol/&l(10&M)，-20&C保存
5、PCR扩增YFG
模板：质粒10ng/&l 稀释少量 -20&C保存
引物：10pmol/&l(10&M) -20&C保存
Taq酶：NEB Quick-Load Taq 2&Master Mix 扩增片段小于2.0kb
反应体系(配制时置于冰上)
25&l反应体系
50&l反应体系
2&Master Mix
(1) 预变性 94&C 5 min
(2) 变性 94&C 30 s
(3) 退火 待定 30 s
(4) 延伸 72&C 待定
(5) 重复2-5 25-30个循环
(6) 补平缺口 72&C 10 min
(7) 暂存 10&C
退火温度：参考4(G+C)+2(A+T)-4(互补碱基)，参考Ta Opt(Primer Premier 5.0)
延伸时间：Taq酶：1kb/min
循环数小于30，减少错配
琼脂糖电泳检测PCR产物
0.8%有效分离范围：10~0.81.0%有效分离浓度7~0.5kb
50ml TAE加入5&l EB母液(5mg/ml)
100V，30-45min
拍照或者紫外灯下切胶回收
6、构建pGEX-KG-YFG
酶切：双酶切PCR产物、pGEX-KG
回收：PCR产物直接回收、pGEX-KG电泳之后切胶回收
连接：pGEX-KG 50ng、插入片段150ng
转化铺平板：Ampr
挑单克隆：Ampr(四个菌落足够了)
鉴定：小提质粒酶切 or菌体 PCR
7、转化BL21(DE3)pLysS菌株检测GST融合蛋白的表达
(1)冰上融化BL21(DE3)pLysS感受态细胞(天根)
(2)2 ml离心管中，加入25&l BL21+ 3&l质粒(300-500ng)，混匀(质粒&感受态1/10)
(3)冰上放置30min
(4)42&C，90s
(5)冰上放置2-3min
(6)加入300&l LB(无抗生素)(相当于菌体10倍体积的LB)，37&C，250rpm，1 h
(7)4000rpm，2min，弃上清，其余混匀以后涂平板(Ampr)，37&C，过夜(16 h)
(8)挑单克隆菌落，5ml LB(Ampr)，37&C，250rpm，过夜(16 h)
()稀释10倍、20倍、50倍测定OD600
()选择合适的稀释倍数，5ml菌液，37&C，250 rpm，1 h，测定OD600
(7)取100&l菌液加入5ml LB(Ampr)(50倍稀释)，37&C，250rpm，过夜(16 h)
(8)取500&l菌液加入5ml LB(Ampr)(10倍稀释)(其余菌液4&C保存)，测OD600
(9)37&C，250 rpm，2 h(OD600：0.6-0.8)，测OD600
(10)室温放置20 min(摇床降温，30&C)
(11)取100&l作为诱导前对照，冰上放置
(12)菌液中加入IPTG，终浓度0.5-1 mM
(13)30&C，250 rpm，2 -4h(可做时间梯度)，测OD600
(14)取100&l作为诱导后对照，连同诱导前菌液，12000rpm，离心2min，加入50&l 1&SDS上样缓冲液
(15)取4ml菌液，12000rpm，离心2min，收集到2ml离心管中
(16)加入1ml GST裂解缓冲液重悬菌体
(17)超声破碎细胞：超声20s，间隔10s，共3-5次，超声强度200-300W(冰浴)
(18)超声后菌液换入一个新1.5ml离心管，4&C，12000rpm，离心5min
(19)超声后上清：取25&l上清，加入25&l 2&SDS上样缓冲液(其余上清-80&C保存)
(20)超声后沉淀：沉淀加入1ml GST裂解缓冲液重悬，取25&l，加入25&l 2&SDS上样缓冲液(其余沉淀-80&C保存)
(21)将四个样品煮沸3min，12000rpm，离心5min
(22)8-10%SDS-PAGE，30&l上样，顺序：诱导前菌体、诱导后菌体、超声后上清、超声后沉淀
(23)考马斯亮蓝染色
(1)菌液OD值小于1即可
(2)诱导时间最好做一个梯度，2-6h
(3)诱导温度适当摸索，24&C、30&C
(4)IPTG浓度可做梯度，1mM
(5)超声条件可视实际情况改变，只要使细菌裂解充分即可，即菌液清亮不粘稠
8、测序确认
上海生工生物工程技术服务有限公司(Tel：)
测序引物：pGEX-3通用引物
测序样品：过夜菌1质粒(浓度大于50ng/&l，10&l)
9、中提质粒(Promega)
10、表达纯化GST融合蛋白
(1)已经转化的菌液，或者重新转化BL21(DE3)pLysS
(2)活化：取20&l菌液加入11ml LB(Ampr)(500倍稀释)，37&C，250rpm，过夜(16 h)
(3)取10ml菌液加入100ml LB(Ampr)(10倍稀释)(剩余菌液4&C保存)
(4)37&C，250 rpm，1 h 10 min-1 h 20 min，OD600 0.6-0.8(OD600小于1.0即可)
(5)取1ml菌液作为诱导前对照，冰上放置
(6)加入IPTG，终浓度1 mM
(7)30&C，250rpm，诱导适当时间(预实验确定)
(8)取1ml菌液作为诱导后对照，连同诱导前菌液，12000rpm，离心2min，收集菌体，加入100&l 1&SDS上样缓冲液
(9)其余菌液，分为两份，倒入50ml离心管，5000rpm，离心20 min，收集细胞
(10)每管加入8-10ml GST裂解缓冲液重悬菌体，转移小烧杯中(无气泡)
(11)超声破碎细胞：超声3s，间隔10s，40次左右，超声强度200-300W(冰浴)
(12)将超声后菌液转移到50ml离心管中，4&C，13000rpm，离心20-30min
(13)将上清转移到1个50ml离心管中，取出50&l，加入50&l 2&SDS上样缓冲液(其余上清-80&C保存)
(14)将沉淀加入16-20ml GST裂解缓冲液(或PBS)重悬，取出50&l，加入50&l 2&SDS上样缓冲液(其余沉淀-80&C保存)
(15)将四个样品煮沸3min，12000rpm，离心5min
(16)8-10%SDS-PAGE检测诱导、超声是否合适，30&l上样，顺序：诱导前菌体、诱导后菌体、超声后上清、超声后沉淀
(17)考马斯亮蓝染色
(18)混匀glutathione sepharose beads(4B)(mixed slurry)，取200&l加入15ml离心管中(2份)
(19)加入10ml PBS，混匀，3000rpm，离心3min，弃上清
(20)加入超声后上清液，4&C轻柔摇荡60分钟(或过夜)(横放)
(21)4&C，3000rpm，离心3min
(22)10ml GST裂解缓冲液洗涤2次(冰上)
(23)10ml TBS(含5mM MgCl2、1mM DTT)洗涤2次(冰上)
(24)弃上清，加入1倍柱床体积的TBS(含5mM MgCl2、1mM DTT、50%甘油)，混匀
(25)取悬液测定蛋白浓度或SDS-PAGE
(26)-20&C保存beads
11、GST-Pull-down
(1)10cm培养皿中，未处理的细胞或者转染的细胞(3-5&g质粒转染10cm培养皿，Cos-7、293T或者其他细胞，转染24h)
(2)加入1ml 细胞裂解缓冲液，细胞铲刮下细胞(冰上)
(3)将裂解液收集到1.5ml离心管中，振荡30s，冰上放置5min，重复2-3次，充分裂解细胞
(4)4&C，12000rpm，离心15min，收集上清
(5)测定蛋白浓度，取1mg总蛋白做GST-Pull-down?
(6)留30&l作为input对照(input与Pull-down蛋白量约为1/10)
(7)其余溶液，加入20&l glutathione sepharose beads(PBS洗涤过)，4&C，轻柔振荡20min
(8)12000rpm，离心3min
(9)收集上清，分为两份，一份加入1-15&g GST结合的beads，另一份加入等量 GST-融合蛋白结合的beads，4&C，轻柔振荡60min
(10)3000rpm，离心3min，回收上清
(11)1ml 细胞裂解缓冲液洗涤3次
(12)弃尽上清，加入25&l 2&SDS上样缓冲液
(13)煮沸3min，12000rpm，离心3min
(14)SDS-PAGE，上样顺序：细胞裂解液input、x、GST、x、GST-融合蛋白(x：LSB)
(15)考马斯亮蓝染色或免疫印迹
GST裂解缓冲液(前四个组分配好之后4&C保存，DTT和蛋白酶抑制剂现用现加)
500ml贮存液
10ml工作液
150mM NaCl
15 ml 5M NaCl
10ml贮存液
20mM HEPES pH7.5
20ml 0.5M Hepes pH7.5
10ml 1M MgCl2
1% TritonX-100
5ml 100% Triton-X 100
10&l 1M DTT
34&l 0.3M PMSF
inhibitor cocktail
10&l inhibitor cocktail
500ml贮存液
10ml工作液
200mM NaCl
10ml贮存液
25mM HEPES pH7.5
20&l 1M DTT
10&l 1M PMSF
inhibitor cocktail
10&l inhibitor cocktail
TBS(含5mM MgCl2、1mM DTT)
500ml 贮存液
150mM NaCl
15ml 5M NaCl
20mM Tris pH7.6
10ml 1M Tris pH7.6
0.5M MgCl2
常用IP细胞裂解液
500ml贮存液
10ml 工作液
50mM Tris-HCl, pH7.5
25ml 1M Tris-HCl, pH7.5
150mM NaCl
15ml 5M NaCl
2ml 0.5M EDTA
25ml 10% NP40
0.5% Triton X-100
25ml 10% Triton X-100
2.5ml 1M DTT
100&l 100mM PMSF
1ml 0.5M NaF
20&l 0.5M NaF
complete protease inhibitors
cleared lysates were incubated for 1.5 h with 3 &g immobilized GST or GST-32
作者：青岚 点击：次
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【求助】GST融合蛋白纯化
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这个帖子发布于4年零271天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
大家好，我最近纯化GST融合蛋白，可纯化后融合蛋白很少，杂蛋白却很浓，详见下图。使用的树脂是Pierce Glutathione Agarose，纯化方法是batch method 。采用超声破菌，超声裂解液是50mM Tris, 150mM NaCl, pH 8.0，同时含有1%甘油、0.1%Triton X-100、1mM DTT和1mM PMSF，超声参数是功率500W，超声2S、间歇2S，循环100次，其中超声破碎仪最大功率为1000W。请高手帮忙分析原因，在下感激不尽！
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1.对比L和FT，你的蛋白应该挂柱成功了，建议跑个Beads看看是不是没洗脱下来。2.你标记的杂蛋白从分子量看像GST，貌似有GST tag掉落的现象
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树脂已经再生了，只能下次做纯化时留些跑电泳看看。如果是GST标签掉落，是融合蛋白降解所致吗，有什么方法可以避免吗？
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会不会是大部分只表达了GST标签后就终止了呢？你的目的蛋白有无什么难表达的序列或是稀有密码子过多？
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钢铁苍穹 会不会是大部分只表达了GST标签后就终止了呢？你的目的蛋白有无什么难表达的序列或是稀有密码子过多？ 编码序列中有稀有密码子，用的表达菌就是Rosetta
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编码序列中有稀有密码子，用的表达菌就是RosettaRosetta也不是万能的，我遇到过一些蛋白稀有密码子过多，连Rosetta也无法表达。
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诱导后在融合蛋白处相对于诱导前多出一条带，另外我做western blot 也证实确有融合蛋白表达，所以应该不是蛋白不表达。我现在的问题是为什么洗脱后杂蛋白比融合蛋白还浓，另外杂蛋白看上去也像GST标签，不知是如何脱落的？
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三楼的猫 诱导后在融合蛋白处相对于诱导前多出一条带，另外我做western blot 也证实确有融合蛋白表达，所以应该不是蛋白不表达。我现在的问题是为什么洗脱后杂蛋白比融合蛋白还浓，另外杂蛋白看上去也像GST标签，不知是如何脱落的？降解了，破菌时加5mM EDTA应该有改善。大肠杆菌里金属蛋白酶较多，PMSF没用的
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laforet 降解了，破菌时加5mM EDTA应该有改善。大肠杆菌里金属蛋白酶较多，PMSF没用的多谢啦，我试试看
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laforet 降解了，破菌时加5mM EDTA应该有改善。大肠杆菌里金属蛋白酶较多，PMSF没用的你的意思是在在超声液里加EDTA?
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心情一杯 你的意思是在在超声液里加EDTA?如果过镍柱的话不能加EDTA, 柱子会直接脱镍失效这也是GST, MBP之类层析的优点
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GST标签蛋白大概27kD左右，你可以用GST的抗体做一下 western blot鉴别一下再到是不是GST标签，如果是就说明是在表达或者破菌过程出现降解。可以在破军的时候就加入EDTA，看是否是在破菌以后降解。
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个人觉得你可以改善的地方：诱导时的温度可以降低到15度；过夜诱导；菌的重悬液可以不加tritonX100；破碎的功率可以降低到300W，超声4S、间歇8S，循环100次；祝好运！
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1.你的蛋白在上清中表达情况看不太清，但GST空标签表达也很好，纯化时也吸附。如果你目的蛋白在上清表达很好，过柱流出也很少，但解离很少，可能目的蛋白已经沉淀在柱子上。按我的经验看，你的蛋白在上清中表达量不高。2.应该是你的GST融合蛋白比较大，GST标签暴露不好。3.你的破碎的时候换PBS缓冲液 PH7.4或是Tris 不加150mM氯化钠。4.对于空标签的去除你可以考虑用其他的离子色谱法，如DEAE。
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楼上的你好：请问换PBS缓冲液 PH7.4或是Tris 不加150mM氯化钠，为什么呢？PH或氯化钠能使其断裂吗？
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关于丁香园重组蛋白纯化SOP
&&&&大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化一 可溶性蛋白的纯化 （一）菌体的破碎 1. 仪器与材料： -80℃ 冰箱； 超声波细胞破碎仪； 50mm pbs 或 50mm tris-hcl ph 7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机 2. 方法 2.1 反复冻融 2.1.1 收集菌液 500ml，等分 10 份，4000 r/min 白稳定的缓冲液和 ph）重悬洗涤一次&&&&。 2.1.3 然后按原菌液体积的 1/4 加入缓冲液重悬菌体， 并加入蛋白酶抑制剂 pmsf 和 edta(带 his 标签不加)， pmsf 终浓度为 100μg/ml, edta 的终浓度为 0.2mm （约为 58μg/ml） 。取 20μl 重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表 达，是可溶性表达还是包涵体表达） 。 2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80 度冰冻，室温融解，反复冻融三次，由于细 胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 2.2 超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用) 2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入 1mg/ml 溶菌酶，缓冲液 ph＞8.0，加入 后需静置 20min） ，进行超声破碎，超声条件：400w，工作 5 秒，间隔 5 秒，重 复一定次数，直至菌体溶液变清澈为止。 2.2.2 取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm 离心 10 分钟，分别对上清和沉淀 进行检测， 并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含 量。 注意事项： （1） 超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间， 降低蛋白被降解的可能。 （2） 功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在 4 度左右， 超声时保持冰浴。 （3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用 bradford 法或者紫外吸收法。 （4）可通过 sds-page 电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。 2.3 gst 融合蛋白的纯化 以 pgex 融合表达载体表达的 gst 融合蛋白， 可用谷胱甘肽－亲和层析介质 纯化。 ge 公司的谷胱甘肽亲和介质是用 10 个碳原子连接臂和谷胱甘肽作为配体 连接到 4%交联的琼脂糖凝胶上，专门用于纯化谷胱甘肽 s-转移酶（gst）融合蛋 4℃ 离心 15min，弃上清。 2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的 50mm pbs 或 50mm tris-hcl（选择使蛋白、其它的谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白的亲和色谱填料。 1．ge 公司谷胱甘肽填料的性质： 基质 吸附载量 亲和填料的颗粒大 小 最大流速 ph 范围 使用温度 保存温度 保存液体 化学稳定性 4%的交联琼脂糖凝胶 10mg gst 融合蛋白/ml 90μm 450cm/h 3-12 常温 +4~30℃ 20%乙醇 室温 1m 乙酸盐，6 m 盐酸胍条件下稳定 1h实验过程中， 可根据填料的吸附容量决定上样量，根据填料的其他特性保存填料 2 缓冲液及样品准备 2.1 缓冲液 binding buffer ：pbs elution 2.2 样品 样品上柱前要于 10000rpm 下离心 10 分钟或经 0.45μm 的滤膜过滤后才能上 样。如果进行批量纯化时可不必过滤。若样品黏度较大，可用结合缓冲液适当稀 释。 3 批量纯化 3.1 介质的准备 (1) 取 1mlgst 琼脂糖凝胶制成 50%混悬液 (2) 用移液管转移到离心管里 500× g 离心 5min，小心倾去上清。 (3) 加入 5ml pbs 混匀介质进行洗涤。 (4) 500× g 离心 5min 沉淀介质，小心倾去上清。 (5) 重复洗涤一次。 3.2 批量纯化 (1) 向 gst 琼脂糖凝胶里加入细胞裂解液 （根据目的蛋白表达量和介质的吸附容 量决定上样量） ，轻轻混匀，使 gst 融合蛋白与还原型谷胱甘肽的充分结合，4 度旋转孵育 3 小时（可进行实验确定） 。 ph 7.3 ( 140mm nacl, 2.7 mm kcl, 10 mm na2hpo4, 1.8 mm kh2po4) buffer：50 mm tris-hcl ,10 mm 还原型谷胱甘肽，ph 8.0 注：如有需要，结合及洗脱液中可加入 1-10 mm dtt(2) 用吸管将混合物转移到另一离心管中， (3) 500× g 离心 5min 沉淀介质，小心倾去上清，取 20μl 上清液（即流穿液）进 行 sds-page 以分析介质的结合效率。 (4) 加入 5ml pbs 混匀，洗涤。 (5) 500× g 离心 5min 沉淀介质，小心倾去上清（洗涤液） ，取 20μl 上清液 sds-page 分析。 (6) 重复步骤 4、5 两次。 (7) 加入 0.5ml elution buffer，轻轻混匀，室温孵育 20min。 (8) 500× g 离心 5min 沉淀介质，小心收集上清（洗脱液） 。 (9) 重复步骤 4、5 两次，分别检测三次洗脱上清中目的蛋白的含量，根据结果 合并含量较多的上清液。 3.3 注意事项 (1) gst 融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓慢，为了获得最大的结合量， 很重要的一点就是保证足够作用时间。不同的 gst 融合蛋白结合效率会有很大 不同。 (2) 对不同 gst 融合蛋白， 洗脱体积和洗脱时间会有所不同， 可能会需要更高浓 度的还原型谷胱甘肽。如果需要的话，需要对流穿液、洗涤液及洗脱液进行 sds-page 以及 western blot 分析。 (3) gst 融合蛋白的浓度可以通过 bradford 法或紫外分光光度法来确定。如果用 lowry 或者 bca 分析，样品需要先利用脱盐柱或超滤进行缓冲液交换处理或透 析处理。 以除去其中的还原型谷胱甘肽， 因为还原型谷胱甘肽的存在会干扰 bca 和 lowry 测定。 (4) gst 琼脂糖凝胶能否重复利用要根据样品来定，而且只能用来处理同一种样 品，以防止交叉污染。 4 柱纯化 4.1 装柱 (1) 所有试剂耗材的温度应调整到纯化时的温度。 (2) pbs 脱气后从柱底下出口管朝柱内注入，使柱底全部充满水而不留气泡，柱 底预留 10%柱体积的缓冲液，关闭柱下端出口。 (3) 将洗好的介质用 pbs 重悬成 60%的混悬液， 轻轻搅动凝胶溶液， 使形成均一 的薄胶浆，并立即倒入层析管内，让加入的凝胶在柱内自然沉降。 (4) 立刻将层析柱用 pbs 缓冲液充满，装好柱上端接口并连接上蠕动泵。 (5) 打 开 柱 子 下 端 出 口 ， 并 调 高 泵 的 流 速 为 15ml/min ， 让 介 质 在 不 高 于 1bar(0.1mpa)的恒定压力下压紧。 (6) 当柱床体积恒定不变后继续以相同流速至少平衡 3 个柱床体积，并标记柱床高度（纯化过程中流速不得超过压紧介质流速的 75%） 。 (7) 停止蠕动泵，柱内液面缓慢下降，直到稍高于凝胶界面，关闭柱下端出口。 柱下端出口连接上细塑管。 4.2 柱纯化 (1) 介质平衡：用 10 倍柱床体积的 binding buffer 平衡柱子，流速 1ml/min。或 一直平衡直到紫外检测仪基线走平。 (2) 上样：关紧螺旋夹，用毛细吸管小心吸去凝胶层面上的缓冲液至凝胶层面与 缓冲液液面齐平。将样品离心或过滤后，用吸管小心沿柱壁缓缓加入柱内。轻开 螺旋夹，使柱中缓冲液缓缓流出，让样品溶液进入凝胶，至与凝胶层面齐平。柱 壁用少量 pbs 缓冲液小心洗涤 2-3 次，重复至使缓冲液液面与凝胶层面齐平。 (3) 洗杂：上样后用 8 倍柱床体积的 binding buffer 冲洗层析柱，流速 1ml/min 或用 binding buffer 一直冲洗到流出液中无杂蛋白流出，取 20μl 流穿液进行 sds-page 分析介质的结合效率。 (5) 洗脱用 5-10 倍柱床体积的 elution buffer 洗脱 gst 融合蛋白， 流速 1ml/min， 收集洗脱峰。取 20μl 洗脱液进行 sds-page 分析其纯度。 (6) 成功的纯化洗脱液中蛋白纯度应该 96％，蛋白浓度应该在 2mg/ml 以上。 4.3 注意事项 (1) gst 融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓慢，为了获得最大的结合量， 很重要的一点就是保证足够作用时间，而流速是影响 gst 融合蛋白与色谱填料 结合的关键因素之一，所以必须在上样时维持较低的流速。蛋白的特性、结合 ph 及温度也是影响结合容量的因素。 (2) 对不同的 gst 融合蛋白， 洗脱体积和洗脱时间会有所不同， 可能会需要更高 浓度的还原型谷胱甘肽。如果需要的话，需要对流穿液、洗脱液进行 sds-page 以及 western 杂交分析。 (3) gst 融合蛋白的浓度可以通过其在 280nm 下的吸光度测定， 0.5mg/ml 的 gst 融合蛋白 a280 约为 1。 (4) gst 融合蛋白的浓度也可以通过标准色谱法来确定。 如果用 lowry 或者 bca 分析，样品需要先利用 hitrap 脱盐柱进行缓冲液交换处理或者是透析处理。以 除去其中的还原型谷胱甘肽， 因为还原型谷胱甘肽的存在会干扰测定。此时可用 bradford 法。 (5) gst 琼脂糖凝胶能否重复利用要根据样品来定，而且只能用来处理同一种样 品，以防止交叉污染。 5 再生、清洗 5.1 清洗(1)除去因离子交换作用吸附的蛋白，用 2-3 倍柱床体积 2m 的 nacl 溶液清洗柱 子，然后用 5 倍柱床体积的 pbs 缓冲液清洗。 (2)除去蛋白沉淀、变性蛋白，用 2 倍柱体积的 6 m 盐酸胍清洗，然后用 5 倍柱 床体积的 pbs 缓冲液清洗。 (3)除去强的疏水性蛋白和脂质等，用 4 倍柱床体积的 70%的乙醇或者 2 倍柱体 积 1% triton x-100 洗柱子，然后用 5 倍柱床体积的 pbs 缓冲液洗涤。 2.4 his 标签融合蛋白的纯化（ni－金属亲和层析法） 1．简介 其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子 cu ，zn2+，ni2+，co2+，fe3+发生特殊的相互作用，偶联这些金属离子的琼脂糖 凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附 作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合，但结 合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。 基质 配基 吸附载量 填料的颗粒大小 推荐流速 化学温度性 ph 范围 保存温度 保存液体 2 缓冲液及样品准备 2.1 缓冲液 binding buffer：20mm pbs，0.5m nacl，20-40mm 咪唑 elution buffer： 20mm pbs，0.5m nacl，250-500mm 咪唑 注：1 所用试剂及水要高纯度，用前 0.45μm 滤膜过滤。 2 结合缓冲液中加入咪唑可以提高 his-tagged 蛋白的纯度。 但是要小心不要 在洗涤时把目的蛋白洗脱下来。 3 结合及洗脱液中咪唑浓度因分离蛋白的不同而不同，要获得高纯度，咪唑 浓度应优化。 2.2 样品处理 ph 7.4 ph 7.4 2%sds 1h 6%的交联琼脂糖凝胶 ni2+ 40mg his-标签 蛋白/ml 90μm &150 cm/h 0.01m hcl 0.1m naoh 40℃ 一周 30% 异丙醇 30min 3-12 4- 30℃ 20% 乙醇2+1）样品上柱前要离心并过滤后才能上样。样品要完全溶解，避免阻塞柱子。 2）如果样品不是用结合缓冲液溶解的，就要调整到相应的盐浓度及 ph，或用脱 盐柱更换缓冲液并且样品中要加入和结合缓冲液中同浓度的咪唑。 3 批量纯化 3.1 介质的准备 (1) 轻轻颠倒盛有 ni-琼脂糖凝胶的容器，量取 2ml 匀浆到离心管中。 (2) 500× g 离心 5min，沉淀介质。 (3) 小心吸去上清后向介质中加入蒸馏水洗涤。 (4) 轻轻摇动 3min，500× g 离心 5min 沉淀介质。 (5) 用结合缓冲液重复洗涤一次。 (6) 将介质转移到量筒中，加入适量结合缓冲液制成 50%混悬液，混合均匀。 3.2 批量纯化 (1) 每 1ml 混悬液中加入 4ml 样品， 每 1ml 50%混悬液可以结合 20mg his-标签蛋 白。室温轻摇 1h。 (2) 用吸管将混合物转移到一离心管中， (3) 500× g 离心 5min 沉淀介质，小心倾去上清，取 20μl 上清液（流穿液） sds-page 分析介质的结合效率。 (4) 加入 5ml 结合缓冲液混匀，洗涤。 (5) 500× g 离心 5min 沉淀介质，小心倾去上清（洗涤液） ，取 20μl 上清液 sds-page 分析。 (6) 重复步骤 4、5 两次。 (7) 加入 0.5ml elution buffer，轻轻混匀，室温孵育 5-10min。 (8) 500× g 离心 5min 沉淀介质，小心收集上清（洗脱液） 。 (9) 重复步骤 4、5 两次，分别检测三次洗脱上清中目的蛋白的含量，根据结果 合并含量较多的上清液。 4 柱纯化 4.1 装柱 (1) ni 琼脂糖凝胶在 20%乙醇中预溶胀，小心倾去乙醇，加入蒸馏水制成 50%匀 浆。所有试剂耗材的温度应调整到纯化时的温度。 (2) 连接好柱子，有必要的话柱子上可连接储液槽。 (3) 用蒸馏水冲洗柱下端，柱底预留 10%柱体积的蒸馏水，关闭柱下端出口。 (4) 用玻璃棒引流连续不断将匀浆注入层析管，静置 30min，让加入的凝胶在柱 内自然沉降。打开柱下端出口，当液面降到稍高于柱床时，关闭出口。 (5) 将上液流接头充满结合缓冲液，与蠕动泵连接后另一端放到柱床顶部（小心 气泡） 。(6) 打开柱下端出口同时以 1ml/min 冲压柱子，再以 4.5ml/min 冲压柱子。随着 柱床顶部的下降，下调上液流接头。 (7) 当柱床高度恒定后，持续以相同流速冲压 3 个柱床体积，标记柱床高度。 (8) 停止蠕动泵，关闭柱出口，连接层析系统开始平衡柱子。 4.2 柱纯化 (1) 用 5-10 倍柱床体积的 binding buffer 平衡柱子，流速 1ml/min。或一直平衡 直到紫外检测仪基线走平。 (2) 关紧螺旋夹，用毛细吸管小心吸去凝胶层面上的缓冲液至凝胶层面与缓冲液 液面齐平。 将样品离心或过滤后， 用吸管小心沿柱壁缓缓加入柱内。 轻开螺旋夹， 使柱中缓冲液缓缓流出，让样品溶液进入凝胶，至与凝胶层面齐平。 (3) 柱壁用少量 binding buffer 小心洗涤 2-3 次， 重复至使缓冲液液面与凝胶层面 齐平。 (4) 上样后用 5-10 倍柱床体积的 binding buffer 冲洗层析柱，流速 1ml/min 或用 binding buffer 一直冲洗到流出液中无杂蛋白流出， 取 20μl 流出液 sds-page 分 析介质的结合效率。 (5) 用 elution buffer 洗脱，流速 1ml/min，收集洗脱峰。可进行线性洗脱或分步 洗脱。 分步洗脱时 binding buffer 需要 5 倍柱床体积， 线性洗脱时则需要 20 倍柱 床体积。取 20μl 洗脱液 sds-page 分析其纯度。 4.3 注意事项 (1) 结合条件为中性或偏碱性 ph(ph7-8)、0.5-1m nacl、pbs 缓冲液。tris-hcl 也经常用到，但是当目的蛋白与镍柱亲和作用弱时，应避免使用。 (2) 结合缓冲液中应避免有螯合剂 edta、柠檬酸等存在。有必要时可在样品溶 液中添加少量。 (3) 如果重组 his-tagged 蛋白为包涵体，可用 6m 盐酸胍、8m 脲溶解，缓冲液中 也可加入变性剂，样品中含脲时，可直接 sds-page 分析，含盐酸胍时则不能。 (4) 洗脱时可用咪唑，也可用其他方法或方法组合来洗脱：降低 ph 和提高离子 强度。 (5) 如果蛋白对低 ph 敏感， 可将低 ph 洗脱的蛋白溶液每 1ml 收集到含 60-200μl 1m tris-hcl ph 9.0 的管里，洗脱蛋白将以中性条件保存。 (6) edta、egta 也可洗脱，但是会把金属离子从介质上剥落。 (7) 氯化铵和组氨酸也可用于洗脱。 (8) 当需手动测量蛋白吸光值时，可用洗脱缓冲液作空白。 (9) 洗脱蛋白液中咪唑需除去时，可用脱盐柱。 (10) 通常条件下 ni2+的脱落很低， 在极端条件下使用时， 可在上样前先 blank run 来降低 ni2+的脱落。空白循环 :结合和洗脱缓冲液中不含还原剂。 a 用 5 倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子。 b 用 5 倍柱体积的洗脱缓冲液冲洗柱子。 c 用 10 倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。 5 再生、清洗 5.1 凝胶的再生 (1)一般进行过 5-7 次纯化后必须将胶再生。 用 5 倍体积的 20mm pbs， 0.5m nacl， 50mm edta ph 7.4 淋洗柱子， 再用至少 5 倍体积的结合缓冲液洗掉残留的 edta， 随后用 5 倍体积的蒸馏水淋洗。 (2)将0.5体积的0.1m niso4上柱，然后用5倍体积的蒸馏水淋洗，随后用5倍体积 结合缓冲液淋洗。 5.2 在位清洁 1、除去因离子交换作用吸附的蛋白，用2-3倍柱床体积1.5m 的nacl溶液淋洗柱 子，再用几倍体积的蒸馏水淋洗。 2、除去蛋白沉淀、疏水性蛋白、脂蛋白，用1m的naoh 以100cm/h的速度淋洗 柱子1-2h。再用10倍体积的结合缓冲液淋洗，随后用10倍体积的蒸馏水淋洗。 3、 除去强的疏水性蛋白和脂质等，用5-10倍柱床体积的70%的乙醇或者30%的异 丙醇洗柱子15-20min，再用10倍体积的蒸馏水淋洗。二 包涵体蛋白的纯化 1 菌体的破碎 1.1 仪器与材料：超声波细胞破碎仪；20mm pbs 或 20mm tris-hcl ph 7.5；裂 解液 buffera；溶菌酶 10mg/ml；50ml ，15ml 离心管；冷冻离心机 1.2 方法 (1) 收集菌液 500ml，等分 10 份，4000 r/min 4℃ 离心 15min，弃上清。 （2）菌体沉淀中加入相同菌液体积的 20mm pbs 或 20mm tris-hcl（选择使蛋 白稳定的缓冲液和 ph，一般为 7.5-8.0） ，重悬洗涤 2-3 次，弃掉上清。 （3） 然后沉淀按原菌液体积每 500ml 以 15ml 预冷的裂解液 buffera 重悬。 (有的 文献为每克湿菌加 4ml -10ml 裂解液) （4）每毫升悬液中加入 100μl 10mg/ml 溶菌酶（即溶菌酶终浓度 1mg/ml） 。在冰 上孵育 15min （5）对 15ml 悬液进行超声破碎，超声条件：400w，工作 5 秒，间隔 5 秒，重 复一定次数。超声破碎时保持冰浴。具体条件可根据实验情况而定。 （6） 4℃ ，4000 rpm/min 离心 20 分钟所得沉淀即为包涵体。注意事项：融合蛋白的分子量如果大于 150kd 时，用超声波破碎很容易将目标 蛋白打碎而造成降解，故可用溶菌酶先做处理. 2 包涵体的洗涤 (1) 将包涵体沉淀重悬于含有适量脲（1-4m）的 buffer a 中，每克湿重加 4-6ml 洗涤液。 (2) 超声波处理 5 秒打碎沉淀，继续用注射器吸入并挤出悬液，重复数次，4℃ 涡 旋悬液 30min。或者高速搅拌悬液 10min。 (3) 4℃ ，4000 rpm/min 离心 15 分钟。 (4) 重复上述操作 2 次至上清液透明无色。 (5) 将包涵体沉淀重悬于 buffer a，4℃ ，4000 rpm/min 离心 15 分钟，弃掉上清。 buffera 50mm 0.2mm 100mm 1% 1mm 100μg/ml 溶菌酶 注意事项： (1) 包涵体洗涤时增加 nacl 浓度到 0.5m，有助于包涵体中杂蛋白的溶解。 (2) 经提取洗涤后得到的包涵体， 由还原 sds-page 电泳结合光密度扫描可知包 涵体中目标蛋白的含量。 (3) 包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，不同培养条件下收集的菌液经洗涤可得 到不同的纯度。 (4) 用通常的洗涤方法，如果包涵体达不到所需的纯度，可试用分级沉淀法初纯 包涵体，步骤如下： 1) 菌体破碎后将所得的包涵体悬浮于含 6mol/l 盐酸胍的 buffer a 中， 4℃ 涡旋悬 液 30min ，4000r/min 离心 20min，上清进行分级沉淀。 2) 取一小部分上清用 buffer a 稀释到盐酸胍浓度为 4 m， 然后 4℃ 涡旋悬液 15min， 静置 30min，4000r/min 离心 20min，上清继续稀释到 3m，重复上面操作一直到 2m，把每次沉淀和上清跑 sds-page 电泳分析，看目标蛋白在哪个盐酸胍浓度 下纯度最高。 3) 摸索好条件后，直接将剩余上清直接用 buffer a 稀释到所需的盐酸胍浓度， 10mg/ml tris-hcl edta, nacl, triton x-100 （或 2% 脱氧胆酸钠） dtt pmsf ph 8,然后 4℃ 涡旋悬液 15min，静置 30min，4000r/min 离心 20min，沉淀既为分级沉 淀后的包涵体。 （三）纯化蛋白的纯度分析（sds-page） 带 gst 标签可溶性蛋白纯化后的纯度应该在 96％，带 his 标签可溶性蛋白 纯化后的纯度应该在 90％左右，纯化后的包含体的纯度应该在 85％以上才可进 行动物免疫。具体 sds-page 操作步骤见 sop 文件 （四）蛋白质浓度测定 蛋白质浓度测定方法很多， 每种方法都有其自身的优点和缺点以及适用范围， 不同的实验条件下得到的蛋白测定浓度需要根据纯化蛋白缓冲体系选择合适的 测定方法。 一、考马斯亮蓝法（bradford 法） 本法主要用来检测经谷胱甘肽亲和层析柱纯化后蛋白浓度 j# +j1:9n （一）实验原理 考马斯亮蓝法（bradford 法） ，是根据蛋白质与染料相结合的原 理设计的。考马斯亮蓝 g-250 染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大 吸收峰的位置由 465nm 变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。染料主 要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在 595nm 下测定的吸光度值 a595，与蛋白质浓度成正比。 /&bie` bradford 法的突出优点是： ~g_z~ | （1）灵敏度高%w （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要 5 分钟 左右。 （3）干扰物质少。如干扰 lowry 法的 k+、na+、mg2+离子、tris 缓冲液、糖和蔗 糖、甘油、巯基乙醇、edta 等均不干扰此测定法。 za1z:+t 此 e t~（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此 bradford 法 用于不同蛋白质测定时有较大的偏差， 在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白为 标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 # 十二烷基硫酸钠（sds）和 0.1m 的 naoh。k%{n* （3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用 beer 定律进行计算，而只能用标 准曲线来测定未知蛋白质的浓度。 + b6r
o （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂 triton x-100、 法 的 缺 点 是 ：（二）试剂与器材 6 1. 试剂： q*h@:: （1） 标准蛋白质溶液， 用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(bsa)， 配制成 1.0mg/ml。 （2） 考马斯亮蓝 g—250 染料试剂： 称 100mg 考马斯亮蓝 g—250， 溶于 50ml 95% 的乙醇后，再加入 120ml 85%的磷酸，用水稀释至 1 升。 sy0;.rg 2. 器材： =a7zuj g （1）可见光分光光度计 bz!4 （2）旋涡混合器 cv|h6-# （3）试管 16 支 = hb!9 （三）操作方法 |o{!=r 1. 标准方法$t （1） 取 13 支试管， 1 支作空白， 其余试管分为两组， 分别加入样品、 水和试剂， 即用 1.0mg/ml 的标准蛋白质溶液给各试管分别加入： 0(空白)、 0.01、 0.02、 0.04、 0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到 0.1ml。最后各试管中分别加入 5.0ml 考马斯亮蓝 g—250 试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太 剧烈，以免产生大量气泡而难于消除） 。2u:x} （2）加完试剂 2-5 分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在 595nm 处的光吸收值 a595，空白对照为第 1 号试管，即 0.1ml h2o 加 5.0ml 考马 斯亮蓝 g—250 试剂。 ni s3* 注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色） ，可用塑料或玻璃比色皿，使用 后立即用少量 95%的乙醇荡洗， 以洗去染色。 塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长 时间浸泡。 h （3）另取o.1ml未知浓度的蛋白溶液同上测定。cl!3(in （4）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值a595为纵座标，作图，即得 到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的a595值，即可查出未知 样品的蛋白质含量。 nl9v@ 0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的a595约为0.50。 {8zk7 2. 微孔板法 2.1 操作步骤 (1)完全溶解蛋白标准品，取 10μl 稀释至 100μl，使用浓度为 0.5mg/ml。蛋白样 品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以 用 0.9%nacl 或 pbs 稀释标准品。 (2)将标准品按 0，1，2，4，8，12，16，20μl 加到 96 孔板的标准品孔中，加标 准品稀释溶液补足到 20μl。 (3)加适当体积样品到 96 孔板的样品孔中，加标准品稀释液到 20μl。(4)各孔加入 200μl g250 染色液，室温放置 3-5 分钟。 (5)用酶标仪测定 a595，或 560-610nm 之间的其它波长的吸光度。 (6)根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。 2.2 注意事项 (1)g250 染色液使用前请颠倒 3-5 次，混匀。 (2)蛋白标准请在全部溶解后先混匀，再稀释成一系列不同浓度的蛋白标准。 (3) 将 g250 染色液回复到室温再使用，有利于提高检测的灵敏度。 (4)需可检测 560-610nm 之间波长的酶标仪一台，最佳检测波长为 595nm。并需 96 孔板。 (5) g250 染色液 4℃ 保存；蛋白标准-20℃ 保存 (6)灵敏度高，检测浓度下限达到 25μg/ml，最小检测蛋白量达到 0.5μg，待测样 品体积为 1-20μl。在 50-1000μg/ml 浓度范围内有较好的线性关系。 (7) bradford 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。样品中 β巯基乙醇的浓度可高达 1m， 二硫苏糖醇的浓度可高达 5mm， 但受略高浓度的去 垢剂影响。需确保 sds 低于 0.01%，triton x-100 低于 0.05%，tween20，60， 80 低于 0.015%。含去垢剂的样品推荐使用 bca 蛋白浓度测定试剂盒。 (8) 戴一次性手套操作。、} % 二、紫外吸收法 本法主要用于粗略的蛋白浓度的测定nhf1l}* 1. 优点： 1.1 紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。 1.2 低浓度的盐，例如生化制备中常用的（nh4）2so4等和大多数缓冲液不干扰 测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测 。 2. 缺点： 2.1 测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含 量时， 对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误 差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。 2.2 若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。 核酸的干扰虽然可以适当的校正， 但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不 相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。 fvr)ci &q9 2.3 进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因ph的改变而有变化，因此 要注意溶液的ph值，测定样品时的ph要与测定标准曲线的ph相一致. 3. 280nm和260nm的吸收差法 核酸对紫外光有很强的吸收， 在 280nm 处的吸收比蛋白质强 10 倍 （每克） ，但核酸在 260nm 处的吸收更强，其吸收高峰在 260nm 附近。核酸 260nm 处的消 光系数是 280nm 处的 2 倍，而蛋白质则相反，280nm 紫外吸收值大于 260nm 的 吸 ^*,g 纯蛋白质的光吸收比值：a280/a260= 1.8 :ds=#w 2:{ 纯核酸的光吸收比值： a280/a260 = 0.5 ;scf%t_} 测定：含有核酸的样品蛋白质溶液，可分别测定其 a280 和 a260，由此吸收差值， 用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。 'i[`+ 蛋白质浓度(mg/ml)=1.5× a280－0.75× a260 4gn 三 bca 法 本法在本实验室中主要用于细胞或组织裂解液，纯化的抗体，纯化后的包涵 体或其他无干扰的蛋白溶液的测定 1、适用范围 (1) 标准检测：10～1200ug/ml (2) 微量检测：0.5～10ug/ml 2、原理 在碱性环境下蛋白质分子的肽键结构能于 cu2+络合生成结合物，同时将 cu2+还 原成 cu+。 而 bca 试剂可敏感特异地与 cu+结合， 形成稳定的有颜色的复合物， 在 562nm 处有高的光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度呈正比，可根据吸收值 的大小来计算蛋白质的含量。 3、试剂 (1) 试剂 a, 1l 取 10g bca (二喹啉甲酸)，4g naoh，20g na2co3· h2o，9.5g nahco3 与 1.6g na2c4h4o6(· h2o) (酒石酸钠) 加水至 1l， 用 naoh 或固体 nahco3 调 ph 至 11.25。 (2) 试剂 b, 50ml 2g cuso4· 5h2o 加双蒸水至 50ml。 试剂 a 和试剂 b 在室温下至少稳定 12 个月， 并可购买商品化试剂(pierce， 货号)。 (3) 标准工作试剂 (swr) 50 份试剂 a，1 份试剂 b，可稳定一周。 4、操作步骤（pierce 公司试剂盒） (1) 标准品溶液的配制：结晶牛血清白蛋白，预先经凯氏定氮法测定蛋白含量， 配制成 2mg/ml 的母液，根据下表配制标准品。 标准品编号 bsa 的终浓度(mg/ml) a 2 b 1.5 c 1 d 0.75 e 0.5 f 0.25 g 0.125 收 值 。 通 常 ： 3xrh i0.25 0(2) 将 25μl 的标准品及样品与 200μl 的 swr 混合。 (3) 37℃孵育 30 分钟，冷至室温. (5) 在 570nm 读取光密度（od）值。 (6) 以 od570 为横坐标，标准蛋白浓度为纵坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线 计算样品的蛋白浓度。 5 注意事项 (1) 在低温条件或长期保存出现沉淀时， 可搅拌或 37oc 温育使溶解, 如发现细菌 污染则应丢弃。 (2) 样品中若含有 edta、egta、dtt、硫酸铵、脂类会影响检测结果，请试用 bradford 法测定蛋白浓度；高浓度的去垢剂也影响实验结果，可用 tca 沉淀去 除干扰物质。 (3) 要得到更为精确的蛋白浓度结果，每个蛋白梯度和样品均需做复孔 , 每次均 应做标准曲线。 (4) 当试剂 a 和 b 混合时可能会有浑浊， 但混匀后就会消失， 工作液在密闭情况 下可保存 1 周。 f7&&&&
19:12:43 23:24:33 04:58:01 06:52:41 06:52:17 01:28:13 01:06:36 23:57:00 23:38:31 23:16:40