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糖发酵试验
对来自云南省25个传统乳饼样品进行分离培养，得到20株酵母菌。经过糖发酵试验对上述菌株的初步鉴定结果表明：其中的10株分离株的特性接近比赤酵母（Pichia fermentans）；7株接近博伊丁假丝酵母（Candida boidinii）；另外的3株与啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae／Candida shehatae）接近；对上述分离株用Biomerieux API ID32C鉴定试剂盒进行生理生化试验，表明经糖发酵试验鉴定的10株比赤酵母、7株博伊丁假丝酵母和3株啤酒酵母分别与酵母菌资料库的相应的菌株有87％，90％和98％的相似度。
【目的】观察白假丝酵母菌临床菌株的荚膜结构并探讨其形成条件。【方法】临床标本直接涂片染色镜检和用沙保氏琼脂平板、琼脂斜面及沙保氏液体培养基培养、用涂片革兰染色和Hiss荚膜染色镜检、出芽试验、厚膜孢子形成试验、糖发酵试验、小白鼠与家兔试验、扫描电镜与透射电镜观察等进行鉴定。【结果】(1)该临床分离菌为革兰阳性、念珠状菌；能形成芽管、假菌丝、厚膜孢子；能发酵葡萄糖和麦芽糖产酸又产气；发酵蔗糖产酸不产气；不发酵乳糖。(2)人阴道分泌物涂片、感染小白鼠及家兔体内及沙保氏液体培养基培养均可形成荚膜，荚膜层的厚度可因不同环境及培养时间的长短而有差异，但均≥0．2μm，边界明显。沙保氏液体培养物经离心(1500r／min，15min，3次)荚膜层仍然可见。【结论】该菌株可被鉴定为具有荚膜的白假丝酵母菌。
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API试剂条&
细菌鉴定国际金标准 - API&
无需专用仪器，标准化手工方法完成细菌的生化鉴定，为低成本替代传统手工细菌生化鉴定的最佳产品。&
产品特点：&
1、& &完整的鉴定谱：15种试条，可鉴定的细菌多于550种。
2、& &简单方便：标准化方法。
3、& &快速结果：4-24小时。
4、& &成本低廉。
5、& &判读结果简单。
以下为API系列中应用比较广的几个产品：
API 20E 肠道菌鉴定试剂条－24小时内鉴定革兰氏阴性杆菌
1、覆盖临床常见的几乎所有细菌
2、可作为其他鉴定系统的参考标准（文献超过600篇）
3、快速，操作简便：只需一个菌落配成菌悬液，加入试剂条指定位置的小杯中，孵育后观察颜色的变化，软件辅助解释鉴定结果。
4、有效期较长
API 20 NE 非肠道菌鉴定－24-28小时内鉴定非肠道革兰氏阴性杆菌
1、本系列适合日益增加的引起院内感染的细菌的鉴定（由于这些细菌对抗生素越来越耐药，必须准确鉴定）
2、标准的生化试验与同化实验相结合，完全适合这类细菌的非发酵代谢特点：这两种实验是这些细菌的检测标准。
3、配置标准浓度的菌悬液及标准化的操作方法（0.5个麦氏单位）保证了结果的可靠性，避免了混合培养和传代。
包装（盒）
最常见G-菌
API Listeria
10条+10培养基
奈瑟氏菌，嗜血杆菌
10条+10培养基
非肠道G-菌
25条+25培养基
肠杆菌及G-菌
API 20 C AUX
酵母菌及念珠菌
25条+25培养基
25条+25培养基
葡萄球菌,微球菌
25条+25培养基
链球菌及相关菌
25条+25培养基
12条+24培养基
API Coryne
棒状杆菌属
12条+24培养基
Rapid 20 E
快速鉴定肠杆菌
代谢研究用
配合50CH鉴定肠杆菌（液体）
配合50CH鉴定乳酸菌（液体）
配合50CH鉴定芽胞菌（液体）
NIT1+ NIT2
OX 氧化酶试剂&
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国家工业和信息化部备案编号：法国梅里埃公司API20E肠道菌试剂鉴定条；上面就是API20E的鉴定试剂条，也就是用来鉴定；1）ONPG试验翻译成中文是：邻硝基苯-半乳糖苷；2）ADH精氨酸双水解酶试验:某些细菌能产生精氨；4）ODC鸟氨酸脱羧酶试验：某些细菌产生鸟氨酸脱；5）CIT柠檬酸盐（又称枸橼酸盐）利用实验：当柠；6）H2S硫化氢实验：某些细菌能分解培养基中的含；7）URE尿素酶
法国梅里埃公司 API20E 肠道菌试剂鉴定条
上面就是API20E的鉴定试剂条，也就是用来鉴定肠道细菌之用途的。一共是20种生化反应再加手工操作的氧化酶试验（ARA后面的OX）。非常赞叹梅里埃公司的厉害，能把非常复杂的生化反应做成那么小的试剂条，而且还做了细菌生化反应数据库，好庞大的工作量和好精细的工作…………下面我来分别介绍一下这20种生化反应原理以及用途：复杂但是很有趣味……
1）ONPG试验 翻译成中文是：邻硝基苯-半乳糖苷酶试验。用来检测细菌是否发酵乳糖。原理是因为乳糖发酵过程中需要乳糖通透酶和β－半乳糖苷酶才能快速分解，但是有些细菌没有乳糖通透酶，只有半乳糖苷酶，所以会导致迟缓发酵。由此可得，如果某种细菌能够发酵乳糖，那么一定会产生β－半乳糖苷酶。ONPG试验是将ONPG作为底物，如果细菌产生β－半乳糖苷酶，那么会水解ONPG为半乳糖和黄色的邻-硝基苯酚（ONP），培养液会变成黄色。因此试验结果为阳性。
2）ADH 精氨酸双水解酶试验:某些细菌能产生精氨酸水解酶，先水解精氨酸生成瓜氨酸和氨，再水解瓜氨酸生成鸟氨酸、氨和二氧化碳。因此使培养基呈碱性。用于阴沟肠杆菌（阳性）和产气肠杆菌（阴性）的鉴别。（氨基酸分解过程是在厌氧环境中进行的，所以要加盖石蜡油造成厌氧环境）。 3）LDC 赖氨酸脱羧酶试验：某些细菌能产生赖氨酸脱羧酶，可以将赖氨酸脱羧生成胺和二氧化碳，但是碱性更强，使培养基呈紫色（溴甲酚紫指示剂）。用来鉴别用于产气肠杆菌（阳性）与阴沟肠杆菌（阴性）。
4）ODC 鸟氨酸脱羧酶试验：某些细菌产生鸟氨酸脱羧酶，将鸟氨酸脱羧生成胺和二氧化碳，是培养基呈碱性。用来鉴别鸟氨酸用于阴沟肠杆菌（阳性）和克雷伯菌（阴性）。
5）CIT 柠檬酸盐（又称枸橼酸盐）利用实验：当柠檬酸盐作为唯一的碳源，某些细菌能利用此碳源而分解柠檬酸盐产生碳酸盐，而使培养基呈碱性由浅绿色变成深蓝色。肠杆菌科中：沙门菌属、克雷伯菌属、粘质和液化沙雷菌及某些变形杆菌以及枸橼酸杆菌阳性；而埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属和耶尔森菌属均为阴性。
6）H2S 硫化氢实验：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸）生成硫化氢，遇铅或亚铁离子生成黑色硫化物；或者还原培养基中含硫化合物而产生硫化氢，与二价铁生成黑色的硫化亚铁，阴性不产生黑色沉淀。肠杆菌科中沙门菌属、爱德华菌属、枸橼酸杆菌属和变形杆菌属细菌，绝大多数硫化氢阳性，其它菌属阴性。
7）URE 尿素酶实验：某些细菌能产生尿素酶分解尿素，产生大量的氨使培养基变碱。使酚红指示剂变红为阳性，不变为阴性。奇异变形杆菌和普通变形杆菌、雷极普罗威登菌和摩根摩根菌阳性，沙门菌、斯氏和产碱普罗威登菌阴性。
8）TDA 苯丙氨酸脱氨酶实验：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸和游离的氨，加入三氯化铁试剂与苯丙酮酸螯合后产生绿色反应。大量接种被检菌于苯丙氨酸琼脂斜面上，35℃培养18~24h，加入10%三氯化铁试剂出现绿色为阳性。主要用于鉴定变形杆菌属、摩根菌属和普罗威登菌属细菌，均为强阳性，肠杆菌科中其它细菌均为阴性。
9）VP 实验：测定细菌产生乙酰甲基甲醇的能力。某些细菌如产气肠杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步脱羧形成乙酰甲基甲醇。在碱性条件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，进而与培养基中的精氨酸等含胍基的物质结合形成红色化合物。即V-P试验阳性。所以附加试剂中VP1是强碱性物质（KOH溶液）。
10）GEL 明胶液化实验：某些具有明教酶（亦称类蛋白水解酶），蛋白酶的功用在使不能吸收的蛋白质变为可以透入菌体的多肽或氨基酸，这种酶主要为胞外酶，能将明胶先水解为多肽，又进一步水解为氨基酸，失去凝胶性质而液化，让反应孔内的黑色物质扩散，而呈阳性反应。变形杆菌、芽胞杆菌、梭菌等具有很强的胞外酶的活性。
11）IND 吲哚试验：某些细菌能够分解色氨酸生成吲哚，吲哚与试剂中的对二甲氨基苯甲醛生成玫瑰吲哚，变成红色，为阳性反应。用来检测细菌分解色氨酸的能力。
12）GLU 葡萄糖发酵试验：某些细菌发酵葡萄糖，产酸，变黄。
13）MAN 甘露醇发酵试验：某些细菌发酵甘露醇，产酸，变黄。
肌醇发酵试验：某些细菌发酵肌醇，产酸，变黄。
15）SOR 山梨醇发酵试验：某些细菌发酵山梨醇，产酸，变黄。
16）RHA 鼠李糖试验：某些细菌发酵鼠李糖，产酸，变黄。
17）SAC 蔗糖发酵试验，某些细菌发酵蔗糖，产酸，变黄。
18）MEL 密二糖发酵试验：某些细菌发酵密二糖，产酸，变黄。
19）AMY 苦杏仁苷发酵试验：某些细菌发酵苦杏仁苷，产酸，变黄。
20）ARA 阿拉伯糖试验： 某些细菌发酵阿拉伯糖，产酸，变黄。
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酸浆野生菌发酵黄浆水生产天然凝固剂的研究
山东轻工业学院 硕士学位论文 酸浆野生菌发酵黄浆水生产天然凝固剂的研究 姓名：王国良 申请学位级别：硕士 专业：发酵工程 指导教师：宋俊梅
摘要通过对豆腐黄浆水的生物转化，实现再生资源的循环利用和节水生产。利 用从豆腐酸浆中分离出的一株产酸菌ＣＡＰｌｌ７）和一株产香菌（ＣＦ６１０），通过混合 发酵黄浆水生产安全、天然的凝固剂，
可以带来一定的经济效益和社会效益。将本实验室保藏的一株产酸菌（ＡＰｌｌ７）和一株产香菌（ＣＦ６１０）（从豆腐酸浆 中分离筛选）分别鉴定为嗜酸乳杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）和弗里斯假丝酵母（ＣａｎｄｉｄａｆｒｅｙｓｃｈｕｓｓｉＯ。 通过正交试验及还原糖和产酸量随发酵进程的变化，确定了ＡＰｌｌ７利用 黄浆水单独发酵产酸的最佳工艺条件：添加４％（ｗ／ｖ）葡萄糖，接种量为 １０％（ｖ／ｖ），发酵温度为４０℃，发酵时间为６４ｈ。其产酸量可达０．５０６９Ｊｒｌ００ｍＬ。 利用水蒸汽蒸馏的方式对ＣＦ６１０发酵黄浆水产生的香味物质进行提取， 并以产酯量和产醛量为衡量标准，通过葡萄糖添加量、接种量、发酵温度和发酵时间４因子的正交试验，确定了该菌株在添加８％（ｗ／ｖ）葡萄糖，接种量为１０％（ｖ／ｖ），发酵温度为３６。Ｃ，发酵时间为７２ｈ条件下产生的香味物质最多。此 时，其发酵液中酯含量可达１０３．５８ｍｇ／１００ｍＬ，醛含量可达２１．３６ｍｇ／１００ｍＬ。 从性能和成本两方面考虑，对ＡＰｌｌ７和ＣＦ６１０采取同时接种同时发酵的 混合发酵方式，以产酸量和产酯量为衡量指标，通过正交试验确定了最优方案：添加８％（ｗ／ｖ）葡萄糖，菌种混合比（ＡＰｌｌ７：ＣＦ６１０）为３：１，发酵温度为３８℃，发酵时间为７２ｈ。此时的产酸量为０．５７３?∥１００ｍＬ，产酯量为１０２．１ｌｍｇ／ｌＯＯｍＬ。 所制得的发酵液具有怡人的酵香味。采用气一质联用技术对其进行了分析测 定。共分离了１６个色谱峰，鉴定了其中的１２个成分，占其香气成分的７５％。 采用常压蒸馏对混合发酵液进行后处理，得浓缩天然凝固剂，酸含量为 ２．２３２９／ｌＯＯｍＬ，总酯含量为４０２．３５ｍｇ／１００ｍＬ。通过感官品评和环境扫描电镜 对豆腐结构进行观察比较，利用天然凝固剂凝固的豆腐要优于盐卤豆腐和石膏 豆腐。关键词：酸浆黄浆水混合发酵天然凝固剂凝固性能ＡＢＳＴＲＡＣＴＴｈｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｙｃｌｅｄｂｙ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅＳＯｌｌｌ＇Ｃｅｓａｎｄ ｗａｔｅｒ－ｓａｖｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓｃａｌｌｂｅ ｔｒｕｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｏｆ ｔｏｆｕ ｙｅｌｌｏｗ ｓｌｕｒｒｙ．Ａ ｋ’ｍｄ ｏｆ ｓａｆｅｔｙａｌｌａｎｄｎａｔｕｒａｌｃｏａｇｕｌａｎｔｃａｎｂｅ ｍａｄｅ ｂｙ 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ａｎｄ ｇｙｐｓｕｍ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＷａＳ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｏｆｕ ｃｏａｇｕｌａｎｔ ｂｙ ｎａｔｕｒａｌ ｃｏａｇｕｌａｎｔ ｗａｓ ｐｒｉｏｒ ｔＯ ｇｙｐｓｕｍｏｎｅｓｃｏａｇｕｌａｔｅｄｂｙ ｂｒｉｎｅａｎｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｓｕａｎｊｉａｎｇｙｅｌｌｏｗ ｓｌｕｒｒｙｍｉｘｅｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｎａｔｕｒａｌｃｏａｇｕｌａｎｔｃｏａｇｕｌａｔｉｖｅ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ附件三学位论文独创性声明本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中 引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人己用于其他学位申请的论文或成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。学位论文知识产权权属声明本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名 单位仍然为山东轻工业学院。论文作者签名日期：――年――月――日 日期：塑￡年上月皿日导师签名：譬公迫山东轻工业学院硕士学位论文第一章绪论１．１大豆蛋白凝固剂中国是大豆．（ｓｏｙｂｅａｎ）的故乡和豆腐（ｔｏｆｕ）的发源地，不仅我国的消费量大，而且早已传遍全世界，成为数以亿计的超级市场、食品商店、餐馆的经常性商品。到２０００年，世界大豆产量的一半被加工成豆制品。欧美地区豆制品的产 量以４０％的速度递增，法国人称豆腐为“大豆乳酪”，是最佳的健康食品之一。自２０世纪九十年代以来，在日本、美国及欧洲等国家对大豆食品的研究、 开发和消费热情不断升温［１１。日本人均豆腐的年消费量近２０ｋｇ，而我国目前的 豆腐工业与发达国家相比明显不足，如花色品种单一、保鲜期过短、包装落后、便携性差等，故在国际市场缺乏竞争力。因此，开发新型凝固剂（ｃｏａｇｕｌａｎｔ）及豆腐新品种，并改进制作工艺以适应工业化连续生产，已越来越成为当前所面临的迫切问题。食用大豆及其制品在我国已有悠久历史。大豆中的蛋白质含量高达４０％左右，是大豆加工利用的主要成分之一。除少量结构蛋白和生理活性蛋白外， 大豆中主要是储存蛋ｆｌ（ｓｔｏｒａｇｅｐｒｏｔｅｉｎ）。储存蛋白主要是球蛋［刍（ｇｌｏｂｕｌｉｎ），约 占大豆总蛋白的６０～７０％，还有一定数量（约２０％）的白蛋ｆｌ（ａｌｂｕｍｉｎ）圆。在豆腐加工中，起主要作用的是大豆球蛋白，此外还含有大量的不饱和脂肪酸（ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄ）。因此具有较高的营养价值和医疗保健价值，对它的进一步开发利用越来越受到重视。１９９２～１９９９年间，国际市场上豆制品销售额 年平均增长２０％以上，特别是大豆蛋ｆｌ（ｓｏｙｂｅａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）的保健作用得到认定后，大豆食品发展更加迅速。有专家预言，到２０２０年世界大豆产量的一半将 用于制作大豆食品，东方的豆腐和豆制品将风靡全球。目前，豆腐仍然是消费 的主要豆制品，日常生活中传统的豆腐仍占总消费量的６ｌ％，豆干占２２％，其他特色品种十分单调。大豆中９０％的蛋白质可以溶解在水中。上世纪五十年代中期，将大豆水溶性蛋白超离心分离，得Ｎ２ｓ、７Ｓ、ｌｌＳ和１５Ｓ四种蛋白组分。后来的研究表明，所谓的１５Ｓ大豆蛋白在大豆籽粒中并不存在，只是在加工或分析过程中，少量 的ｌｌＳ蛋白分子非共价聚合为１５Ｓ蛋白脚。六十年代末期，根据免疫反应不同， 将大豆主要球蛋白分为ｄ一伴大豆球蛋白（ｎ－ｃｏｎｇｌｙｃｉｎｉｎ）、Ｂ．伴大豆球蛋白、 Ｙ―伴大豆球蛋白及大豆豆球蛋自毽ｌｙｃｉｎｉａ）。后来的研究表明，大豆豆球蛋自 与ｌｌＳ蛋白组分相对应，Ｂ、Ｙ一伴大豆球蛋白属于７ｓ球蛋白，ｄ．伴大豆球蛋 白属于２ｓ球蛋白。八十年代中期，从大豆中提取出一种只溶于盐水的７ｓ球蛋白，由于其等电点在碱性范围，称为碱性７ｓ球蛋白【４】。第一章绪论豆腐的凝固就是太豆蛋白在热变性（ｍｅｌｔｉｎｇ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）的基础上，在凝固剂的作用下，由溶胶（ｓ０１）状态变为凝胶（ｇｅｌ）状态的过程【５】。热变性是大豆和大豆制品加工中最常见的一种变性形式，在蛋白质溶胶中，蛋白质分子呈一种卷 曲的紧密结构，表面被水化膜（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｆｉｈｎ）包围着，具有相对的稳定性。通 过加热，大豆蛋白质的肽链（ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｈａｉｎ）受过分的热振荡（ｍｅｒＩＩｌａｌ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ），保持蛋白质空间结构的次级键（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｂｏｎｄ）受到破坏，这其中主要是氢键（ｈｙｄｒｏｇｅｎｂｏｎｄ）。蛋白质分子内部的有序排列被解除，蛋白质分子就从卷睦状 态舒展开来，原来在卷曲结构内部的疏水基团（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ）就暴 露出来，而原来在蛋臼质分子卷曲结构外的亲水基团０ａｙ＆－ｏ＃“Ｕｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ） 都相对减少。同时蛋白质分子吸收热能，运动加剧，所以蛋白质分子间的接触 （ｃｏｎｔａｃ０、交联（ｅｒｏｓｓｌｉｎｋ）机会增加。随着加热过程的继续，蛋白质分子通过疏 水键０ａｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｂｏｎｄ）、二硫键（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）的结合，形成中间留有空隙的立体网络结构，这就是凝胶态，也是大豆蛋白质包水的一种胶体形式。这种结 构的形成使大豆蛋白质的一些物化性质及生物活性发生了改变。凝胶能否形成受到许多因素的影响，其中，豆浆（ｓｏｙｂｅａｎ．ｍｉ墩）的浓度即大豆蛋白的浓度是 主要因素。浓度较小时，加热以后难以发生大范围的交联，只有通过调节ＰＨ 值或改变离子强度才能进一步形成凝胶。因此在豆腐的生产中，必须添加凝固 剂才能达到形成凝胶的目的网。凝固剂的种类不同，豆腐的风味（ｆｌａｖｏｒ）、口感 （ｔａｓｔｅ）和质构（ｔｅｘｔｕｒｅ）都不同。目前，常用的凝固剂有盐类、酸类、酶类等们。 １．１．１盐类凝固剂盐类凝固剂一般都是一些碱土金属盐类，有盐卤（ｂｒｉｎｅ）、石膏（ｇｙｐｓｕｍ）、 氯化钙、山矾汁［Ａ１２（ＣＳ０３）３岛ｓ０４ ２Ｈ２０］、醋酸钙、乳酸钙、硫酸钙、磷酸钙 等二价盐。在我国使用最广泛的盐类凝固剂是盐卤和石膏。（１）盐卤 盐卤又名卤块，是我国数千年来做豆腐的传统凝固剂。其主要成分氯化镁 ０讧ｇｃｌ２ ９Ｈ２０）含量约４６％；硫酸镁（ＭｇＳ０４）３％；氯化钠（ＮａＣｌ）２％：水分约５０％。 盐卤点浆的特点是凝固的速度快，口味好，但出品率（．ｐｒｏｄｕｃｔｙｉｅｌｄ）低。卤水的 浓度要根据豆浆的浓度进行调节。 （２）石膏 石膏的主要成分是硫酸钙。有生石膏（ｃａＳ０４盈－１２０）和熟石膏（ＣａＳ０４）之分。做豆腐多用熟石膏，它是生石膏经过锻烧脱水后粉碎制成的。石膏点浆的特点 是凝固的速度慢，属迟效性凝固剂，其优点是出品率高、保水性强、适用幅度 宽，自＆适应于不同的豆浆浓度。（３）作用机理２山东轻工业学院硕士学位论文关于盐类凝固剂的作用机理，目前有不同的看法。一种是离子桥学说［８】， 认为豆浆凝固时，盐类凝固剂的二价阳离子（如Ｃａ２＋、Ｍ９２＋）与蛋白分子结合， 充当“桥”的作用。事实上，ｃａ２＋的确可与大豆蛋白结合，但研究发现，在ｐＨ４．０Ｈ ９．０范围内，随着ｐＨ降低，大豆蛋白对钙离子的亲和性降低【９】，这与豆浆中加 入钙盐，使其凝固的情况明显不符，故这种学说的正确性值得怀疑。第二种看法认为豆浆凝固无非是一种蛋白质盐析现象【１０】，这种看法忽视了这样一个事 实，即盐析需要相当高浓度的盐（如饱和或半饱和）口”，而豆浆凝固时盐凝 固剂的浓度相当低。况且这种看法不能解释蛋白质胶凝（ｇｅｌａｆｉｏｎ）与蛋白质沉淀 （ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）的区别。第三种看法是基于Ｌｕ【１２ｌ的发现，即：豆浆中加入中性盐后，豆浆的ｐＨ下降，宅ＥｐＨ６．０左右，豆浆凝固成豆腐。因此杨方琪等人【１３，１４１认为，盐凝固剂与酸凝固剂一样，都是使豆浆的ｐＨ接近等电点，引起蛋白荷电 薰降低而凝固。这种理论不能解释酸凝固豆腐与盐凝固豆腐在质构上的差异［１５１。总之，以上三种看法具有各自的合理性和局限性。１．１．２酸类凝固荆酸类凝固剂主要有醋酸（ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、乳酸０ａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）、葡萄糖酸（ｇｌｕｅｏｎｉｃａｃｉｄ）和柠檬酸（ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ）等有机酸，生产中采用较少ｃｌ司。（１）葡萄糖酸内酯（ｇｌｎｃｏｎｏ．６－ｌａｃｔｏｎｅ，ＧＤＬ） 这是开发较晚的新型凝固剂，为白色结晶体，易溶于水。它溶在水中会渐渐被分解为葡萄糖酸，在加热的条件下，则分解速度加快。葡萄糖酸可使大豆蛋白质凝固，在８０～９０。Ｃ时被凝固的大豆蛋白持水性（ｗａｔｅｒ．ｈｏｌｄｉｎｇｃａｐａｃｉｔｙ，ｗｓｃ）好，制成的豆腐质地细腻，弹性好。２０世纪七十年代，日本报道了以葡 萄糖酸内酯为主体的凝固剂【１７］，葡萄糖酸内酯适合做原浆袋装豆腐，便于机 械化生产。在低温的豆浆中加入葡萄糖酸内酯，然后把豆浆滋入袋内封口，再 加热，使袋内豆浆中的葡萄糖酸内酯转变成葡萄酸，与蛋白质形成酸凝固。（２）丙交酯０ａｅｔｉａｅ）丙交酯是乳酸的聚合物，也可作为凝固剂丙交酯溶于水后，经加热可分解 成乳酸，从而使蛋白质凝固。 （３）作用枫理酸产生Ⅳ，使溶液ｐＨ下降，ｐＨ接近大豆蛋白等电点（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ）时，引起蛋白质表面层带电量下降，破坏胶体的稳定性，产生沉淀凝结。 １．１．３酶类凝固剂 酶类凝固剂指能使大豆蛋白凝固的酶，这些酶能促使蛋白质分子间或分子内形成共价键（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｂｏｎｄ），增加各种蛋白质小片断浓度。它广泛存在于动植物组织及微生物中，包括酸性蛋白酶（ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ）、中性蛋白酶（ｎｅｕｔｒａｌ山东轻工业学院砸士学位论文关于盐类凝固剂的作用机理，目前有不同的看法。一种是离子桥学说Ⅸ】， 认为豆浆凝固时，盐类凝固剂的二价阳离子（如Ｃａ“、Ｍｇ“）与蛋白分子结合， 充当“桥”的作用。事实上，ｃａ２＋的确可与大豆蛋白结台，但研究发现，在ｐＨ４．０～ ９．０范围内，随着ｐＨ降低，大豆蛋白对钙离子的亲和性降低口Ｊ，这与豆浆中加 入钙盐，使其凝固的情况明显不符，故这种学说的正确性值得怀疑。第二种看 法认为豆浆凝固无非是一种蛋白质盐析现象【ｌｏＩ，这种看法忽视了这样一个事 实，即盐析需要相当高浓度的盐（如饱和或半饱和）””，而豆浆凝固时盐凝 固剂的浓度相当低。况且这种看法不能解释蛋白质胶凝（ｇｅｌａｔｉｏｎ）与蛋白质沉淀 （ｐｒｅｃｉｐｉｌａｆｉｏｎ）的区别。第三种看法是基于Ｌｕ【１≈的发现，即：豆浆中加入中性盐 后，豆浆的口Ｈ下降，在ｐｎ６．０左右，豆浆凝固成豆腐。因此杨方琪等人［１＾Ⅷ认 为，盐凝固剂与酸凝固剂一样，都是使豆浆的ｐＨ接近等电点，｝ｌ起蛋白荷电 量降低而凝固。这种理论不能解释酸凝固豆腐与盐凝固豆腐在质构上的差异 ““。总之，以上三种看法具有各自的合理性和局限性。 １．１．２酸类凝固剂 酸类凝固剂主要有醋酸（ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、乳酸０ａｃｆｉｃ ａｃｉｄ）、葡萄糖酸（ｇｌｕｃｏｎｉｃ ａｃｉｄ）和柠檬酸（ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ）等有机酸，生产中采用较少ｎｑ。 （１）葡萄糖酸内酯（ｇｌｕｅｏｎｏ．６一ｌａｃｔｏｎｅ，ＧＤＬ） 这是开发较晚的新型凝固翔，为白色结晶体，易溶于水。它溶在水中会渐 渐被分解为葡萄糖酸。在加热的条件下，则分解速度加快。葡萄糖酸可使大豆 蛋白质凝固，在８０～９０℃时被凝固的大豆蛋白持水性（ｗａｔｅｒ－ｈｏｌｄｉｎｇｃａｐａｃｉｔｙ，ｗＨｃ）好，制成的豆腐质地细腻，弹性好。２０世纪七十年代。日本报道了以葡 萄糖酸内酯为主体的凝固剂［１”，葡萄糖酸内酯适合做原浆袋装豆腐，便于机 械化生产。在低温的豆浆中加入葡萄糖酸内酯，然后把豆浆灌入袋内封口，再 加热，使袋内豆浆中的葡萄糖酸内酯转变成葡萄酸，与蛋白质形成酸凝固。 （２）丙交酯０ａｃｔｉｄｅ） 丙交酯是乳酸的聚台物，也可作为凝固剂丙交酯溶于水后，经加热可分解 成乳酸．从而使蛋白质凝固。 （３）作用机理 酸产生Ｉｎ使溶液ｐＨ下降，ｐＨ接近大豆蛋白等电点０ｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉⅡｔ）时， 引起蛋白质表面层带电量下降，破坏胶体的稳定性，产生沉淀凝结。 １．１．３酶类凝固剂 酶类凝固剂指能使大豆蛋白凝固的酶，这些酶能促使蛋白质分子问或分子 内形成共价键（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｂｏｎｄ），增加各种蛋白质小片断浓度。它广泛存在于动 植物组织及微生物中，包括酸性蛋白酶（ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ）、中性蛋白酶（ｎｅｕｔｒａｌ 植物组织及微生物中，包括酸性蛋白酶（ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ）、中性蛋白酶（ｎｅｕｔｒａｌ３第一章绪论ｐｒｏｔｅａｓｅ）和碱性蛋白酶（ａｔｋａＵｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ）ｕ…。 （１）来自动植物组织中的凝固酶 动植物中能凝固大豆蛋白的酶有胰蛋白酶（ｔｒｙｐｓｉｎ）、无花果蛋白酶（ｆｉｃｉｎ）、 菠萝蛋白酶（ｂｒｏｍｅｌａｉｎ）和木瓜蛋白酶（ｐａｐａｉｎ）等，其中菠萝蛋白酶凝固效果最 好‘１９１。 （２）来自微生物的凝固酶 大豆蛋白凝固酶（ｃｏａｇｕｔａｓｅ）产酶菌种广泛分布于细菌、霉菌和酵母菌中， 如液解化淀粉杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、枯草杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ６１括）、青 霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ）、毛霉（Ｍｕｃｏｒａｃｅａｅ）、多粘芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｏｌｙｍｉｘａ）、少孢根霉（Ｐｈｉｚｏｐｕｓ口妇Ｄ印Ｄ埘ｓ．，ｔ２０］，。‘ｔｒ。其筛选通常遵循一个模式，即平板初筛，豆浆管复筛，最后摇瓶产酶伫”。１９８５年Ｙａｎｇ ｗ锄利用该方法首次从土壤中分离到 一株豆乳凝固酶的产生菌Ｋ－２９５Ｇ一７１２２］，国内也筛选到两株产豆乳凝固酶的芽 孢杆菌ＬＹ一３６５５及ＵＶ－１０。 此外日本学者还开发出一株大豆蛋白凝固酶产生菌，其活力为０．１６ ｕ／ｍＬ。 江南大学采用转谷氨酰胺酶（ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ，ＴＧＳ）采ｌ木瓜蛋白酶为凝固剂来 凝固大豆蛋白。 （３）酶学特性 关于凝固酶酶学特性的研究报道很少。尤其国内只有在发酵液和粗酶的酶 学性质方面有所探讨。国外则侧重于商品蛋白酶制荆的研究【２３】。 日本学者从豆腐中分离筛选出一株短小芽孢杆菌（Ｂｉｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓ）ＴＹＯ一 ６７，它产生一种可以凝固大豆蛋白的酶。该酶为一单体，其分子量约为３０ＫＤａ， 等电点为ｐｎ９．７５，氨基酸组成富含丙氨酸（Ａｌａ）、天冬氨酸（Ａｓｐ）、甘氨酸（０１ｙ）、丝氨酸（ｓｅｒ）和缬氨酸Ⅳ由等。其结构中的ｏ．螺旋约占２８．２％，最适ｐＨ和温度 分别为ｐＨ６．Ｏ～６．１和６５。Ｃ。添力ｎｌｒｎＭ的Ｍｎ２＋、ｃａ“、Ｍｇ“和ｓＰ可以激活酶的活性，而ｃａ２＋可以提高其热稳定性‘矧。Ｋｏｏ采用硫酸铵沉淀、葡聚糖凝胶、Ｇ．２５、Ｇ－１００、ＣＭ－凝胶、ｐｈｅｎｙｌ―Ｔｏｙｏｐｃａｒｌ等纯化手段，证实青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ够）产生的豆乳凝固酶是由两个极相似的部分组成，分子量分别为２４∞ａ和４０ｋＤａ【２５】。豆乳凝固酶随来源的不同其最适作用温度也有所不同。目前所知的豆乳凝 固酶最适作用温度通常在５５～８５。Ｃ之间，但稳定温度通常在４５～５０℃之间，原因可能是酶的交性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）不仅与温度的高低，还与时间的长短有关［２６１。豆乳凝固酶在其变性温度短时间表现较高的凝乳活力（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ），长时间则变 性失活，这一特点对其应用十分有利。因为在较高温度下制备豆凝乳ｆｂｅａＩｌ ｃｕｒｄ） 时，酶在凝固豆乳（ｓｏｙ ｍｉｌｋ）后迅速失活，能够避免凝块过度水解（ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）。 ｐＨ是影响豆乳凝固酶活力的重要因素。酶活随ｐＨ降低而增加，由于豆浆在４山东轻工业学院硕士学位论文ｐＨ５．８以下发生酸凝固，因此豆乳凝固酶通常具有相同的最适作用ｐＨ值即 ｐＨ５．８。其稳定ｐＨ范围偏窄，中性条件较为稳定。国内外研究的一些微生物来源的豆乳凝固酶的酶学特性如表１．１所示∞１。衰１．１豆乳凝周蘸的爵学特性Ｔａｂｌｅ １．１ Ｔｈｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｒｓｏｙｍｉｌｋ ｄｏｔｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ产酶最适作用条件酶的稳定性堕堡芽孢杆菌ＬＹ－－３６５５望堕！里！７０里坚５．８ ５．８ ５．８ ５．８ ５．８塑壁！旦！４５ ５０ ５０ ５０ ５０鲤５．８～８．０ ６．０～７．Ｏ ３，０～５．Ｏ ５．Ｏ～７．０ ６．０～７．０芽孢杆菌ｕ一３青霉ＳＰＬ一１５１Ｋ一２９５Ｇ一７ ＵＶ一１０６５～７５６０ ７５ ７０（４）作用机理目前，有关豆乳凝固酶作用机制的报道仅局限于菠萝蛋白酶对豆乳的凝固 上‘１９１，不同的酶对豆乳的凝固是通过相同的机制发生的［２Ｓｌ。菠萝蛋白酶是通过水解大豆蛋白完成其凝固的。用菠萝蛋白酶凝固豆乳首先需经热处理，使所有的蛋白（包括２Ｓ、７ｓ和１ｉｓ）变成可溶的聚集物。其中２ｓ蛋白很快被降解（ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ），７Ｓ蛋白（由甘露糖和Ｎ．乙酰葡萄糖胺组成的糖蛋白）释放 到上层也被酶水解。余下的ｌＩＳ球蛋白是形成凝乳的主要成分。若无该加热过 程，豆乳无法凝固，只会产生沉淀，可能是７Ｓ蛋白对凝乳的形成有抑制作用。 Ｉ．ｉ．４其他凝固剂除上述各种大豆蛋白凝固剂以外，用微生物直接凝固豆乳生产食品的方法也屡见报道【２９】，如Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ曾经用一种酿酒酵母在３０℃下制备无豆腥味的凝 乳。日本的山中茂用曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、红曲霉（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）、青霉（Ｐｅｎｆｃｉｌｌｉｕｍ）、 根霉（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、脉孢菌（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、毛霉（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ ｅｌｅｇａｎｓ）微生物凝固各 种蛋白质溶液【３０】，作为培养基和作用底物（ｓｕｂｓｌａ＇ａｔｅ）的蛋白可以是：各种大豆 蛋白（分离蛋白、浓缩蛋白、抽提的蛋白、脱脂蛋白、７Ｓ蛋白、１１Ｓ球蛋白）， 玉米蛋白（ｚｅｉｎ），小麦蛋白（ｗｈｅａｔｐｒｏｔｅｉｎ），大米蛋ｌ刍（ｄｃｅｐｒｏｔｅｉｎ）等植物性蛋白 及酪蛋白（ｃａｓｅｉｎ），骨胶原（ｏｓｓｅｉｎ），各种鱼、鸡、鸭、猪的动物性蛋白。 将大豆中丰富的优质蛋白与蔬菜汁中丰富的维生素、有机态Ｃａ、Ｍｇ等矿 物质强化、融为一体，是一种营养价值极高的天然食品ｎｑ，茶叶中的单宁也可 充当凝固剂来凝固大豆蛋白印。刘翊中等人利用微生物发酵技术，以蔬菜汁为第一章绪论原料生产豆腐凝固剂，并利用该凝固剂制作彩色豆腐曙”。郑立红运用回归正交方案设计，确定了以内酯为主的豆腐复合凝固剂向豆浆中添加量的最佳配方为：内酯０．３％、石膏０．０６９％、磷酸氢二钠０．０４７％，单甘酯０．０１９％（以豆浆计）ｆ３２１。近年来，采用包埋法（ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ）生产出复合凝固剂。在凝固剂表面涂上一层难溶性的包裹层，使其溶解速度受到控制，与豆乳的反应速度减慢，同时 颗粒均匀分散，减少沉淀，一般被包裹物为盐类、酸类；包埋剂（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ ａｇｅｎｔ）使用冷时不融化，受热时才融化的油脂，通常用硬化油、酪朊酸钠、变性淀粉、明胶等。此外，在豆乳中加入粘性多糖（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ），有黄原胶（ｘａｎｔｈａｎ ｇｕｍ）、普鲁兰（ｐｕＵｕｌａｎ）、卡拉胶（ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ）等口】。还有一种复合型凝固剂是通过向葡萄糖酸内酯中添加胡萝ｈ汁和番茄汁来增加豆腐硬度和营养口”。此外，将钙盐和与钙能形成凝胶的海藻酸或海藻酸钠作为凝固剂，采用可溶性钙盐含量较高的蔬菜汁作为豆腐凝固剂。１．２豆腐酸浆及其微生物菌群１．２．１豆腐酸浆 酸浆是一种传统的天然大豆蛋白凝固剂，是豆腐黄浆水（ｙｅＨｏｗ ｓｌｕｒｒｙ）经多 种微生物混合发酵的产物。酸浆在我国作为豆制品的点浆剂已有４００多年的历 史。与其他点浆剂相比，它除了沉降蛋白质外，还赋予豆制品特有的质构和酵 香。同时，还含有其他的生物活性成分，如大豆低聚糖（ｓｏｙｂｅａｎ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、大豆异黄酮（ｓｏｙｂｅａｎ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ）、大豆皂苷（ｓｏｙｂｅａｎ ｓａｐｏｎｉｎ） 等。由于酸浆所处地域的不同，其中的微生物种类也不尽完全相同。孟克毕力格等在２０００年曾对一种酸浆中的乳酸菌进行了分离鉴定，得到了四株杆菌：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｏａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｌｇａｒｄｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、ｃｏｒｙｎｉｆｏ硎缸和一株球菌：Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ．Ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ，并认为该酸浆中的主要产酸菌是乳酸菌删。章丘市是山东省济南市的一个郊县。在该地区，通常利用当地特有的一种酸浆作为点浆剂制作一种具有地方特色的豆制品―脆豆腐。这种豆制品蛋白质含量（１３．６９％）较嫩豆腐（５．３％）高，且香脆可口，口感独特，完全不同于其他豆 制品，受到广大消费者的欢迎。因此，分析该酸浆中的微生物组成，了解其各 方面性能就显得尤为重要。１．２．２豆腐酸浆中的微生物菌群 本实验室已经对该豆腐酸浆中的微生物进行了分离纯化，共得到３株细菌６山东轻工业学院硕士学位论文（其中２株杆菌，ｌ株链球菌）和３株酵母菌（其中１株假丝酵母、１株红酵母、１株白地霉）。经过试验，编号为ＡＰｌｌ７的细菌单独发酵，其产酸量为最高；编号为ＣＦ６１０的假丝酵母单独发酵，可以产生香味物质９”。 （１）细菌的鉴定瞄州 细菌的鉴定主要是以生理生化指标为主，辅之以形态学观察。生理生化指 标包括微生物对碳源的利用实验、过氧化氢酶的测定实验、Ｍ．Ｒ试验、Ｖ．Ｐ试验、明胶水解试验、硝酸盐还原试验、吲哚试验、产Ｈ２ｓ试验、柠檬酸盐的利用实验等；形态学观察试验包括形态观察、革兰氏染色（ｇｒａｍ ｓｔａｉｎ）、芽孢 染色（ｓｐｏｒｅ ｓｔａｉｎ）等。鉴定必须以比较简单的方法所获得的描述特征为基础。从实用的目的出发，鉴定一种细菌所应用的实验项目应保持最少，这一点是很重 要的，因为现在已经提出了几百个特征描述试验。在研究工作中为了迅速而简单地鉴定一个有机体，就必须选择一套实验项目。 （２）酵母菌的鉴定口１酵母菌的鉴定主要以形态学观察及少量的生理生化指标为主，辅之以其他生理生化指标。在属的区分上，以形态学观察为主，生理生化指标为辅。形态 学特征可包括细胞形态、培养特征、能否产生子囊孢子（ａｓｃｏｓｐｏｒｅ），以及假菌 丝（ｐｓｅｕｄｏｈｙｐｈａ）和掷孢子（ｂａｌｌｉｓｔｏｓｐｏｒｅ）等；少量生理特征主要是少数糖类（葡萄糖等）的发酵和硝酸盐的利用等。种的划分主要依靠生理生化特征，其中尤 以糖的发酵和同化为最重要，其次就是硝酸盐的同化。其他生理特征要在区分某些属的种时再根据具体情况而定。１．３混合发酵（ｍｉｘｅｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ） 目前，很多研究人员将菌种混合发酵（尤其是乳酸菌和酵母菌）应用于食 品生产当中。郑州工程学院的马智刚等人研究了馒头面团发酵过程中的微生物变化。在开始阶段，乳酸菌利用面团中的营养物（和酵母不同的碳源）发酵，乳酸菌生长代谢产生的乳酸等有机酸，能为酵母提供有益的酸度，乳酸菌中的 酶，在酸化面团过程中也能强有力地降解面团中的戊聚糖ｐｅｎｔｏｓｅ），使面团的粘度下降，为酵母生长提供有利条件。酵母也能使乳杆菌的增代时间（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｔｉｍｅ）缩短。酵母和乳酸菌共同生长时，两者存在某种互生关系（ｃｏｍｍｅｎｓａｌｉｓｍ ｒｅｌａｔｉｏｎｓ／ｔｉｐ）。整个过程中，大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌＯ都不超标渊。 刘文宗等人在鲜乳中添加６％的糖，以酵母菌和乳酸菌按２：３的比例接种，３７＂Ｃ，４３℃的分段发酵（ｔｗｏ．ｓｅｃｔｉｏｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）２．５ｈ，酸度为８４～８８。Ｔ的发酵奶最为理想（３靶。酵母菌和乳酸菌将乳蛋白质和乳糖降解生成氨基酸（ａｍｉｎｏ 粒ｉｄ）、乳酸等有机酸和其他风味成分［４０ｌ。７第一章绪论利用酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）和一种苹果酸乳酸细菌分别在１５ ℃和２２＊（３下对苹果汁进行发酵制取苹果酒【４“。如果二者同时接种，尽管苹果汁中的乙醇（ｅｔｈａｎ０１）含量低而糖含量高，但会抑制细菌的生长和苹果酸（ｍａＵｃａｅｉｄ）的降解嘲，并会有大量的乙酸（ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）生成［４３１。如果酵母先进行酒精发酵，然后接入细菌，这样就会避免将糖转化为Ｄ～乳酸和乙酸，而且酵母可 以分泌或通过自溶（ａｕｔ０１ｙｓｉｓ）的方式向细菌提供一些必需的营养成分㈣。 １。４黄浆水及其废用现状１．４．１黄浆水 在我国，自汉代以来豆腐是最主要的传统大豆加工产品，几乎每个集镇都有豆腐作坊，足见豆腐及其次级加工品在我国膳食结构中的重要地位。传统生产豆腐的方法需在豆腐加工过程中加入约ｌＯ倍于大豆干重的水来研磨成浆，其中约有１／２―１／３的水将在随后的加工过程中被沥出，形成豆腐沥水，俗称黄 浆水湖。若需制成其次级加工品如豆腐干，则需加压沥去更多的黄浆水［４６１。黄浆水的比重大约为１．０１２，ｐ８ ６．Ｏ～６．５，固形物含量１．６５％，水分为９８．３５％［４７］，黄浆水营养丰富ｆ４８ｌ，如表１．２所示，其中大部分的所谓有机污染 物是很值得回收利用的物质，将之排放不仅污染环境，还造成了浪费，实为可 惜。衰１．２黄浆水的基本化学成分Ｔａｂｌｅ １．２ Ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｎａｌｙｓ担ｏｆｙｅＨｏｗ ｓｌｕｒｒｙｌ－４．２黄浆水的综合应用现状从减少豆腐黄浆水的污染出发，根据表１．２，无机污染（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ） 并不存在，主要是有机污染（ｏｒｇａｎｉｃ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ）。从黄浆水的合理利用的角度出发，用醋酸调节黄浆水的ｐＨ至４．５，搅拌均匀，静置使黄浆水絮凝沉淀，然后８山东轻工业学院硕士学位论文将絮凝物离心或过滤，饼块可作为蛋白质性饲料，其中含有黄浆水中原有的悬 浮物和其他固形杂质，还有少量的淀粉、磷脂（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｅ）、脂肪并混杂有异 黄酮昔元０ｓｏｆｌａｖｏｎｅ ａｇｌｙｃｏｎｅｓ）。采用Ａｍｂｅｔｌｉｔｅ ＸＡＤ－４（Ｓｉｍｍａ公司）的吸附 剂（ａｄｓｏｂｅｎｔ），充分吸附余下的有机分子。以净水洗柱后由浓至淡用不同浓度 的酒精（９５～３０％，ｖ，ｖ）洗脱。此时，植酸（ｐｈｙｔｉｅ ａｃｉｄ）、寡糖（ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｄｄｅ）、异黄酮可依次出现于洗脱液中，回收酒精，分别干燥各组分㈣。大豆低聚糖是包含在大豆中的低聚糖的总称，主要成分为水苏糖 （ｓｔａｃｈｙｏｓｅ）、棉子糖（ｒａｆｆｉｎｏｓｅ）和蔗糖（ｓｕｃｒｏｓｅ）。大豆低聚糖中的水苏糖和棉子糖能使双歧杆菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃ据ｎｕｍ）增殖。它们在人体小肠中不能被消化吸收，而在大肠中可被双歧杆菌选择性地利用，并能使肠内有害菌减少，肠内菌丛获 得改善，从而抑制肠内腐败产物的产生和有害酶的活性。只要每天摄取少量大豆低聚糖就能显示出明显的整肠作用。大豆低聚糖在国外（主要是日本）已广泛用于饮料、酸奶、果酱、糕点、洋羹、面包等食品中。国内也有关于从大豆 乳清中提取低聚糖的报道［４９，５ａ】。在豆腐生产的副产物黄浆水中，经测定发现含有０．］２９ｎ００ｍＬ的棉子糖、０．６５９／ｌＯＯｍＬ的水苏糖、０．７４９／１００ｍＬ的蔗糖，另外还含有一些低分子量的蛋白质、多肽（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）等（Ｏ．５０９／ｍＯＯｍＬ）及大豆粗 皂苷（ｓｏｙｂｅａｎ ｓｐｏｎｉｎｓ）、无机盐类、有机盐类等。采用离子交换树脂法脱盐、 脱苦、凹凸棒土脱色、酒精沉淀法去蛋白、经真空于燥可以得到黄色的大豆低 聚糖浆ｍＪ。利用白地霉混合菌种发酵黄浆水生产饲料蛋白，基本上可以解决有关淀粉厂、豆制品厂、粉丝厂等黄浆水的污染问题，其成品中水分在９％以下；灰分 在９％以下；蛋白质为３５～４０％；细菌数目为１０，０００个幢以下；细度为８０目通过９０％以上１５２］。黑龙江省大豆技术研究中心的江连洲等人对利用阿氏假囊酵母（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ ａｏｈｂｙｉＯ和薛氏丙酸杆菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉＯ混合发酵黄浆水制取Ｂ族维生素的接种量进行了研究。结果表明阿氏假囊酵母与薛氏丙酸杆菌以１：１的比例混合，接种量为８％，培养基组成：黄浆水９５％， 葡萄糖５％，口Ｈ７．０，３０＂Ｃ，４０ｒｐｍ摇床培养３～５ｄ，此时菌丝长势好【５３】。陕西科技大学的刘平等人单独以薛氏丙酸杆菌为菌种，在经过预处理的黄浆水（新 鲜黄浆水中添加２％左右的Ｃｕｓ０４调ｐＨ２．０～３．０，煮沸１５ｍｉｎ，４５００ｒｐｍ离心２０ｍｉｎ，取上清液，１２１＂Ｃ灭菌２０ｒａｉｎ唧－ｓ习。）中添加葡萄糖８％，以７％的接种 量，３２℃下发酵４ｄ，菌体干重最高可达２．３２ｍｇ／ｍＬｔ５回。陈松林等人对豆制品厂排放的黄浆水采用絮凝一微滤一离子交换工艺，并 结合碳酸饮料生产技术，小试出高营养型蛋白饮料和副产物磷脂蛋白（１ｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）。该工艺不仅使大豆蛋白工业的黄浆水利用成为现实，而且对面９第一章绪论粉厂洗麦水，淀粉废水净化和利用都有参考价值‘钢。赵素蓉，王荫福在豆腐黄浆水中添加３％凌芽糖，８％。蛋白胨，调节ｐＨ至５．０，利用白地霉Ａｓ２．４９８以此为发酵基质，２８～３２４Ｃ－Ｆ，８０ｒｐｍ摇床培养１２～１４ｈ，最终白地霉湿品为 ５～６％。湿品可以直接制成颗粒饲料，或经低温烘干制成饲料酵母粉‘５８１。１．５立题依据和研究内容 １．５．１立题依据 豆腐制造业有句俗话“手艺高低看点浆”，制作豆腐的关键技术是在豆浆 中添加凝固剂。凝固剂的种类不同，豆腐的风味、１：３感和质构都不同。目前， 常用的凝固剂有盐类、酸类、酶类等，但这些凝固剂都存在着已知或未知的缺 点和不足。 目前，对于黄浆水的应用一般都局限于提取其中的某些成分，或利用其发 酵生产动物饲料，而未见有应用于天然凝固剂中的报道。 黄浆水的生物转化利用，主要有以下优点： （１）利用废水作为主要的生产原料，节约了净水； （２）使资源再利用生产，实现再生资源的循环利用； （３）可以使废水的ＣＯＤ值降低，减少污染。在有利于生态平衡的条件下同 时解决资源短缺及环境污染问题，使其作为一种清洁产业促进农业的可持续发展。黄浆水来源广泛，但是它的有机物含量低，培养结果所得生物量有限，产 品分离需要消耗大量的能源与高额的设备投资。因此，单纯利用黄浆水作为发 酵基质在经济上是划不来的，比较成功的做法是在黄浆水中加入一定量的营养 物质以提高生物量。 现在人们在饮食方面都追求“绿色”、追求“天然”，因此，本课题拟研制 一种天然凝固剂，该凝固剂是从酸浆中分离出的产酸菌和产香菌利用黄浆水进 行发酵而成。这不仅为工业生产提供了依据，同时在豆腐黄浆水废水综合利用 和新型食品添加剂的开发上都具有重要意义。 １．５．２研究内容 本课题拟对黄浆水微生物发酵进行系统的研究，包括主要功能菌的初步鉴 定，培养基的配方组成和培养条件的优化。主要有以下几个方面的内容： （１）对从酸浆中分离出来的野生菌（产酸菌和产香菌）进行初步鉴定： （２）产酸菌和产香菌单独发酵，对其培养基组成和最佳发酵工艺条件进行优 化； （３）利用产酸菌和产香菌混合发酵生产天然凝固剂，对其培养基组成和最佳山东轻工业学院硕士学位论文发酵工艺条件进行优化； （４）将发酵液进行后处理，将其用于豆腐的生产中。并与其他凝固剂在凝固 性能及豆腐的感官品质和结构等方面进行比较。第二章酸浆中一株产酸菌的鉴定第二章酸浆中一株产酸菌的鉴定２．１引言 酸浆中的微生物种类繁多，要充分地了解和合理地应用其中的微生物，首先必须对其进行分离、纯化及鉴定。经研究发现，酸浆凝固大豆蛋白的机理是酸凝∞］，而酸则是由其中的产酸菌发酵黄浆水所产生的。因此，酸浆中产酸 菌的研究就显得格外重要。２．２材料与方法２．２．１菌种本试验待鉴菌株是从酸浆中分离出来的野生菌株，实验室保藏，编号为ＡＰｌｌ７。２．２．２试剂 草酸胺结晶紫 蓍红（ｓａｆｒａｎｉｎ）格里斯氏（Ｇｒｉｅｓｓ）试剂二苯胺试剂（ｄｉｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｅ）ｇｒｅｅｎ）孔雀石绿（ｍａｌａｃｈｉｔｅ 路哥氏碘液溴甲酚紫酒精液 溴酚蓝酒精溶液 甲酸（Ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ） 葡萄糖（Ｇｌｕｃｏｓｅ） 色氨酸（Ｔｒｙ）Ｍ．Ｒ试剂 Ｖ．Ｐ试剂 吲哚试剂（Ｅｈｒｌｉｃｈ法）分析纯 分析纯 色谱纯 化学纯 分析纯 分析纯可溶性淀粉（ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｔａｒｃｈ） （Ｎ［＇Ｌｔ）２ＨＰ０４Ｋ２ＨＰ０４ＭｇＳ０４ＫＣｌ ＮａＣｌ７１＂１２０分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯柠檬酸铁胺（Ｆｅｒｒｉｃ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ）Ｎａ２Ｓ２０３苯甲醇（Ｂｅｎｚｙｌ ａｌｃｏｈ０１） 正丁醇（Ｂｕｔｙｌ ａｌｃｏｈ０１）ＮａＯＨＣ６Ｉ－ｈＣ０２ＨＣ０２Ｋ山东轻工业学院硕士学位论文２．２．３培养基ｔ６０］ 黄浆水液体培养基：实验室自制黄浆水，添加葡萄糖２％（ｗ／ｖ）。 黄浆水固体培养基：在黄浆水液体培养基中添加水洗琼脂粉２％（ｗ／ｖ）。 糖发酵实验培养基：（ＮＨ４）２ＨＰ０４ ｌｇ，ＭｇＳ０４ ７Ｈ２００．２９，ＫＣｌＯ．２９，酵母膏０．２９，糖１０９，琼脂５～６９，蒸馏水１０００ｍＬ，０．０４％溴甲酚紫酒精溶液 ２０ｍＬ，ｐＨ７．Ｏ～７．２。（测试糖类包括葡萄糖、Ｄ一木糖、半乳糖、Ｄ．果糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、鼠李糖、甘露糖和甘露醇等。）柠檬酸盐培养基：柠檬酸钠２９，ＮａＣｌ ５９，ＭｇＳ０４ｌｇ，Ｋ２ＨＰ０４?３Ｈ２０ ７１１２００．２９，（ＮＨ４）２ＨＰ０４ｌｇ，１％溴百里酚蓝水溶液１０ｍＬ，琼脂２０９，蒸馏水１０００ｍＬ，ｐＨ６．８～７．０。葡萄糖蛋白胨水培养基：蛋白胨５９，葡萄糖５９，ＮａＣＩ ５９，蒸馏水１０００ｍＬ，ｐＨ７．Ｏ～７．２。淀粉培养基：蛋白胨１０９，牛肉膏５９，ＮａＣｌ ５９，可溶性淀粉２９，蒸馏水 １０００ｍＥ，琼脂１８～２０９，ｐＨ７．４～７．６。明胶培养基：蛋白胨５９，明胶１２０９，蒸馏水１０００ｍＬ，ｐＨ７．２～７．４。硝酸盐培养基：蛋白胨ｌＯｇ，牛肉膏５９，ＮａＣＩ １０００ｍＬ，琼脂１８～２０９，ｐＨ７．２。５９，ＫＮ０３ｌｇ，蒸馏水吲哚试验培养基：蛋白胨ＺＯｇ，０．１％色氨酸，ＮａＣｌ ５９，蒸馏水１０００ｍＬ，ｐＨ７．５ａＨ２Ｓ试验培养基：蛋白胨２０９，柠檬酸铁胺０．５９，ＮａＣＩ琼脂１５９，蒸馏水１０００ｍＬ，ｐＨ７．２。 ２．２．４仪器与设备 ＢＣＭ．１０００Ａ型单人超净工作台 ＦＡ２００４型上皿电子天平 ＹＸＱＧ０１塑蒸汽消毒器５９，ＮａｚＳ２０３ ０．５９，苏州安泰技术有限公司 上海天平仪器厂 山东新华医疗器械厂 上海精宏实验设备有限公司 东联电子技术开发有限公司 上海棱光技术有限公司 南京新飞达光学仪器公司ＧＮＰ－－９０８０隔水式电热恒温培养箱ＨＺＱ－Ｑ型振荡器Ｓｐｅｃｔｒｕｍｌａｂ ２２ＰＣ可见分光光度计ＮｉｋｏｎＥ２００一Ｆ型生物显微镜ＰＨＳ－２（２型ｐＨ计 ＤＺＫＷ－Ｃ型电子恒温水浴锅 ２．２．５实验方法 （１）生长曲线的测定上海精密科学仪器有限公司 黄骅市卸甲综合电器厂将菌种按５％接种量接入１００ｍ１．／２５０ｍＬ三角瓶黄浆水液体培养基中，每弟二章酸浆中一株产酸菌的鉴定隔２ｈ测一次吸光度（Ａ５４嘶。），２４ｈ后每隔４ｈ测一次，直到４８ｔｌ。以吸光度为纵坐标、时间为横坐标做出生长曲线图【６”。 （２）对氧要求的确定 将ＡＰｔ １７接入液体培养基，分别进行静置和摇床培养２４ｈ，用平板涂布法 测其菌落形成单位（Ｃｏｌｏｎｙ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔｓ，ＣＦＵ），进而确定其对氧的要求。 （３）形态学鉴定［６２，６３１ ①菌体大小测定 利用接目测微计、镜台测微计及显微镜进行测量。为了尽量减少实验误差，应在同一个标本片上测量５～１０个菌体，取其平均值。②菌落形态观察利用液体培养法和平板涂布法进行观察。③鞭毛（ｆｌａｇｅｌｌｕｍ）生长情况的观察通过黄浆水固体培养基上的菌落形态及半固体直立柱穿刺线上群体生长是否扩散来判断。 ④革兰氏染色（Ｇｒａｍ Ｓｔａｉｎ） 涂片一固定一结晶紫（１ｄ）一水洗（冲洗背面）一吸水一碘液媒染（１ｄ）一水洗（冲洗背面）一吸水一酒精脱色（２０～３０ｓ）一水洗（冲洗背面）一吸水一蕃红复 染（３－４ｒａｉｎ）－水洗（冲洗背面）一吸水一干燥一镜检（低倍镜、高倍镜、油镜）。 同时用大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌＯ和枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）作对照。若颜色同大肠杆菌为阴性，同枯草芽孢杆菌则为阳性。注：做革兰氏染色的细菌的培养不能超过２４ｈ，以免出现假阴性。 ⑤芽孢染色（Ｓｐｏｒｅ Ｓｔａｉｎ） 涂片一干燥一固定一孔雀绿（７～１０ｒａｉｎ、△）一冷却一水洗（冲洗背面）一 吸水一蕃红复染（１～３ｍｉｕ）－－水洗（冲洗背面）一干燥一镜检。 同时用枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｌｉｌｉｓ）作对照。若观察结果与枯草芽孢杆菌一致，则说明ＡＰＩｌ７有芽孢。⑥荚膜染色（Ｃａｐｓｕｌｅ Ｓｔａｉｎ） 加ｌｄ墨汁于洁净的玻片上，并挑取少量菌与其充分混合。放一清洁盖玻 片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸收多余菌液，再进行镜检。背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。 （４）菌株生长最适温度的确定将ＡＰｌｌ７接种到液体培养基中，分别置于不同温度下培养２４ｈ，然后用平板涂布法测其ＣＦＵ，进而确定其生长最适温度。山东轻工业学院硕士学位论文（５）菌株生长最适初始ｐｎ的确定 将ＡＰｌ １７接种于不同ｐＨ的液体培养基中，最适温度下培养２４ｈ，然后用 平板涂布法测其ＣＦＵ，进而确定其生长最适ｐＨ。 （６）生理生化试验鉴定 ①糖发酵试验以１８～２４ｈ的幼龄菌种，直针穿刺接种于培养基中，最适温度下分别培养ｌｄ、２ｄ、４ｄ、７ｄ和１４ｄ后观察培养基变色和气泡产生情况。指示剂由紫色变黄，表示糖类发酵产酸。琼脂柱中有气泡出现，则表示产气。②过氧化氢酶的测定 将ＡＰｌ １７接种于黄浆水固体培养基上，最适温度下培养１ ８～２４ｈ。将３～ ５％的Ｈ２０２直接加到固体培养基上，观察是否有气泡产生。 ③甲基红试验（Ｍ．Ｒ试验）将ＡＰｌｌ７接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，最适温度下分别培养４ｄ、６ｄ。 在培养液中加入甲基红试剂，如培养渡呈现红色为阳性，黄色为阴性。 ④乙酰甲基甲醇试验（Ｖ．Ｐ试验） 培养基组成、培养方式同甲基红试验。观察时取培养液（约２ｍＥ）和等量的４０％ＮａＯＨ相混合，加入等量ｄ一蔡酚溶液充分振荡２～５ｍｉｎ后。如培养液出 现红色，即为Ｖ．Ｐ阳性。⑤淀粉（ｓｔａｒｃｈ）水解试验 取菌种点种于平板上，每皿可点种３～５个菌株，最适温度下培养２～４ｄ。 在平板上演加路哥氏碘渡，若菌落周围有无色透明圈出现，则为阳性反应。⑥明胶（ｇｅｌａｔｉｎ）水解试验 将ＡＰｌｌ７用穿刺接种法接种于试管中央，最适温度下培养３０ｄ。然后取出 置于冰浴中，观察明胶是否液化。 ⑦硝酸盐还原试验 将ＡＰｌｌ７接种于硝酸盐液体培养基中（用不加硝酸盐的液体培养基作为 对照），最适温度下分别培养Ｉｄ、３ｄ、５ｄ。取少许培养液，分别滴加试剂Ａ液 和Ｂ液，在对照管中加同样试剂。当培养液变为粉红色、玫瑰红色、橙色或棕色等颜色时，为硝酸盐还原阳性。如无红色出现，则加二苯胺试剂，此时，如呈蓝色反应，为硝酸盐还原阴性，如不呈蓝色反应，则按硝酸盐还原阳性处 理。 ⑧产生吲哚（ｉｎｄｏｌｅ）试验 将ＡＰｌ １７接种于蛋白胨水培养基中，最适温度下分别培养２ｄ、４ｄ、７ｄ。沿试管壁缓缓加入吲哚试剂，在液层界面形成红色者即为阳性反应。如仍为黄第二章殴浆中一株产酸菌的鉴定色，则为阴性反应。 ⑨Ｈ２Ｓ产生试验 将ＡＰＩ １７用穿刺接种法接种于Ｈ２ｓ试验培养基中，最适温度下培养２－－ ４ｄ。如穿刺线上或试管底部变黑者为阳性反应。 ⑩产酸类型的分析 利用纸层析分析法来判断该菌的产酸类型，并用乳酸（１ａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）作标样。 展开剂：水、苯甲醇、正丁醇以１：５：５的量混合，然后加ｌ％的甲酸。 显色剂：０．０４％的溴酚蓝酒精溶液，用０．１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ调节ｐＨ到６．７。 层析上行２５ｃｍ后，取出晾干后喷显色剂，观察样品上是否出现黄色斑点， 并与对照比较，以确证是否是乳酸。２．３结果与讨论２．３．１结果 （１）生长曲线 通过比浊法测定ＡＰｌｌ７的生长曲线，如图２．１所示。，、０．２５目ｇ ００．２ ０．１５蜊０．１蠢ｏ．０５０ ０ ｌＯ ２０ ３０ ４０ ５０时间（ｈ） 图２．１ Ａｐｌｌ７ｔｔ：：．ｇ：曲线ｌＮｇｕｒｅ ２．１ Ｇｒｏｗｔｈｌａｌ＇ｖｅ ｏｆＡＰｌ １７通过图２．１可以看出，从４ｈ开始，ＡＰｌｌ７开始进入指数生长期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌｐｈａｓｅ），１ ８ｈ后开始进入稳定期（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅ）。（２）对氧的要求 经过平板涂布法测其ＣＦＵ，静置培养为１．８ｘ１０８ＣＦＵ／ｍＬ，而摇床培养为１．０ｘＩＯＳＣＦＵ／ｍＬ。因此，可确定ＡＰｌｌ７为兼性厌氧菌（‰ｕｌｔａｔｉｖｅ ａｎａｅｒｏｂｅ）。１６山东轻工业学院硕士学位论文（３）形态学鉴定 ＡＰｌｌ７单个菌体形态如图２．２所示。 ＡＰｌｌ７在固体培养基上的茵落形态如图２．３所示。图２．２ ＡＰｌｌ７单个菌体形态（ｔ０００ｘ）Ｆｉｇｕｒｅ ２．２ Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆＡＰｌｌ７图２．３ ＡＰｌｌ７在固体培养基上的菌落形态Ｆｉｇｕｒｅ ２．３ＣｏｌｏｎｙｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆＡＰｌｌ７ｏｎｓｏｌｉｄ ｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ形态学观察结果如表２．１所示。（４）菌株生长最适温度 不同培养温度下的活菌数（以ＣＦＵ表示）如图２．４所示。１７第二章酸浆中一株产酸菌的鉴定襄２．１ ＡＰＩｌ７的形态及培养特征Ｔａｂｌｅ ２．１ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｏｆＡＰＩｌ７形态特征 菌落特征５～６．０１１培养特征 液体培养特征ｍｘ０．６～Ｏ．９ ｕ小，质地均匀，乳白色，无菌膜、环、岛，浑浊 表现为沉淀。ｒｎ杆状，单个或链状。不透明，边缘与中央的Ｇ＋，无芽孢，无鞭毛，色泽一致，圆形，凸起， 无荚膜。边缘整齐较粘稠，易挑取。１．６ １＿４逞粤 芭１－２ １０．８ ０．６ ０．４ ０．２ ０ ０ １０ ２０ ３０ ４０ ５０Ｂ温度（℃） 图２．４ＡＰｌｌ７在不同温度下的菌落形成单位Ｆｉｇｕｒｅ ２．４ＣＦＵ ｏｆＡＰｌｌ７ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ由图２．４可以看出，ＡＰＩｌ７在２２℃下不生长，在３６。Ｃ时菌落数最多，为 １．５×１０％ｆｕ／ｍＬ。 （５）菌株生长最适ｐＨ 不同ｐＨ下的活菌数（以ＣＦＵ表示）如图２．５所示。逞。６毪【－２ 圣）．８已０．４ ｕＯＯ ２ ４ ６ ８１０ｐＨ 图２．５ ＡＰｌｌ７在不同ｐＨ下的菌落形成单位Ｆｉｇｕｒｅ ２．５ ＣＦＵ ｏｆ ＡＰＩ １７ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐＨ１８山东轻工业学院硕士学位论文表２．２ ＡＰｌｌ７生理生化特征Ｔａｂｌｅ ２．２ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ ｏｆ ＡＰｌｌ７项目 最适温度（℃） 最适ｐＨ 葡萄糖 Ｄ－木糖 半乳糖 Ｄ一果糖 乳糖 麦芽糖 碳源 蔗糖 棉子糖 鼠李糖 甘露糖 甘露醇 柠檬酸钠 过氧化氢酶 Ｍ．Ｒ试验 Ｖ．Ｐ试验 淀粉水解结果 弘如＋．＋＋＋＋＋＋．ｄ．．一．．＋明胶水解硝酸盐还原试验 吲哚试验 Ｈ２Ｓ试验 乳酸发酵类型 葡萄糖产气．＋（最终ｐＨ＞６）同型注：＋表示呈阳性，－表示呈阴性，ｄ表示８９％～１１％的菌株呈阳性。由图２．５可以看出，ＡＰＩｌ７在ｐＨ２．０左右几乎不生长，ｐＨ５．０时活菌数最 多，为１．５ｘ１０９ＣＦＵ／ｍＬ。 （６）生理生化试验鉴定ＡＰｌｌ７生理生化试验结果如表２．２所示。根据上述结果和附录１，并参照伯杰氏细菌鉴定手册（第八版）［鲫推断 ＡＰｌｌ７为嗜酸乳杆菌（Ｌｏｎｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌ淞）。１９第二章酸浆中一株产醴菌的鉴定２．３．２讨论了解菌株的来源和原始分离的条件对菌株的归属常常很有帮助。本试验待鉴菌株ＡＰＩ １７是从酸浆中分离而得到的，而酸浆又是黄浆水经过多种微生物 发酵而成。试验中各指标的测定所用菌种都是用黄浆水液体或固体培养基培养 得到。我们曾试图用其他产酸菌培养基或乳酸菌培养基进行培养，但效果都不 理想。这说明ＡＰ／１７已经适应了这种环境。 本试验选择了尽可能少而又很关键的指标进行测定，通过菌落形态特征的观察和生理生化指标检测，ＡＰｌ １７菌株生理生化指标与嗜酸乳杆菌完全吻合，表明ＡＰｌｌ７菌株即为嗜酸乳杆菌。 嗜酸乳杆菌是乳酸菌家族中被极为重视研究与开发的益生菌之一，并被视 为第三代酸孚［，（ｙｏｇｕｒｔ）发酵剂菌种，嗜酸乳杆菌是人体肠道中的重要微生物， 与人体健康息息相关。当其达到一定数量时，可以起到促进健康的效果瞄】。此外，嗜酸乳杆菌还可以抑制肠道不良微生物的增殖，增强机体的免疫能力，提高乳糖（１ａｃｔｏｓｅ）的消化性，控制血清中的胆固醇（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒ０１），并具有抗致癌 作用１６６１。 因此，ＡＰｌｌ７具有广阔的开发前景和发展空间。本试验结果为利用该菌制 备天然凝固剂提供了一定的理论依据。山东轻工业学院硕士学位论文第三章酸浆中一株产香菌的鉴定３．１弓Ｉ言 利用酸浆作为点浆剂所生产的豆腐具有独特的质构和风味，而其中的风味物质要得益于酸浆中的产香菌。因此，对其中的产香菌进行分离、纯化以及鉴 定，可以更好地了解其各方面特性，以便将其和产酸菌ＡＰｌｌ７应用于天然凝固剂的生产当中。 ３．２材料与方法３．２．１菌种本试验待鉴菌株是从酸浆中分离出来的野生菌株，实验室保藏，编号为（，６ｌＯ。３．２．２试剂ＮａＡｃ ＫＨ２Ｐ０４分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯（ＮＩ－ｈ）２Ｓ０４ ＭｇＳ０４ＣｕＳ０４ ５Ｈ２０ＭｎＳ０４?砸ｂＯＦｅＳ０４ ４１－１２０ ＣａＳ０４１，２ Ｈ２０ＫＣｌ，Ｋ２Ｈｒｌ０４，葡萄糖，Ｎａｃｌ，ＭｇＳ０４?７Ｈ２０同２．２．２。３．２．３培养基 麦芽汁液体培养基：将麦芽汁调节糖度到１０Ｂｒｉｘ，ｐＨ５．４，过滤。 麦芽汁琼脂培养基：在麦芽汁液体培养基中添加水洗琼脂粉２％（ｗ／ｖ）。 葡萄糖一酵母汁一蛋白胨液体培养基：葡萄糖２０９，蛋白胨１０９，酵母汁 ５９，蒸馏水１００ｍＬ，自然ｐＨ。 ＭｃＣｌａｒｙ培养基：葡萄糖０．１％，ＫＣｌ ０．１８％，酵母汁０．２５％，ＮａＡｃ 水洗琼脂粉２％，蒸馏水１５０ｍＬ。 Ｇｏｒｏｄｋｏｗａ培养基：葡萄糖０．１％，蛋白胨１％，ＮａＣｌ １２％，水洗琼脂粉２％，１５０ｍＬ，装管，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ，搁成斜面。 Ｋｌｅｙｎ培养基：ＫＨ２Ｐ０４０．０６２％，ＮａＣｌｕ０．８２％，０．０１２％，Ｋ：ｚＨＰ０４ ０．０２％，ＮａＡｃ０．５％，葡萄糖０．０６２％，蛋白胨０．２５％，水洗琼脂粉２％，生物索（Ｂｉｏｔｉｎ）２．０Ｙａ２００．００２％，ｇ％，每１００ｍＬ加混合盐溶液（ＭｇＳ０４０．４％，ＮａＣｌ０．４％，ＣｕＳ０４第三章酸浆中一株产香菌的鉴定ＭｎＳ０４ ４Ｈ２０ ０．２％，ＦｅＳ０４ ４Ｈ２０ ０．２％，用蒸馏水配制。）ｌｍＬ，蒸馏水１５０ｍＬ，ｐＨ６．９～７．１，装管，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ，搁成斜面。 马铃薯葡萄糖琼脂培养基：将２００９马铃薯洗净，去皮，切成小块，立即放 入水中，以免被氧化。煮沸３０ｍｉｎ，经纱布过滤，滤液加水至１Ｌ，加入葡萄糖 ２０９．水洗琼脂粉２０９，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ。 石膏块培养基：８份ＣａＳ０４１／２Ｈ２０与３份水混合，制成楔状斜面。将斜面置于试管内，管底部垫有棉花，用稀释的１．５Ｂｒｉｘ麦芽汁湿润。糖发酵用基础培养基：０．６％酵母浸汁，加６０９干酵母粉于１Ｌ蒸馏水当中，必要时加一些蛋清以澄清滤液，１２ｌ℃灭菌２０ｍｉｎ，趁热用双层滤纸过滤。（测 试糖类包括：葡萄糖、乳糖（１ａｃｔｏｓｅ）、半乳糖（ｇａｌａｃｔｏｓｅ）、麦芽糖（ｍａｌｔｏｓｅ）、蔗 糖和棉子糖等。）碳源同化用基础培养基：（ＮＩ－１４）２Ｓ０４ ０．５％，ＫＨ２Ｐ０４ ０．１％，ＭｇＳ０４７Ｈ２００．０５％，酵母膏０．０２％，碳源１％，蒸馏水适量，熔化后过滤。（测试碳源除糖发酵用糖类外，还包括Ｄ一木糖（Ｄ―ｘｙｌｏｓｅ）、山梨糖（ｓｏｒｂｏｓｅ）、乙醇、甘油（ｇｌｙｃｅｒ０１）、 山梨醇（ｓｏｒｂｉｔ０１）、甘露醇（ｍａｎｎｉｔ０１）和肌醇（ｉｎｏｓｉｔ０１）等。） 氮源同化用基础培养基：葡萄糖２％，ＫＨ２Ｐ０４０．１％，Ｍ［ｇｓ０４ 酵母膏０．０２％，氮源ｌ％，蒸馏水适量。７１－１２０ ０．０５％，产生类淀粉类化合物基础培养基：ｆＮＨ４）２Ｓ０４Ｏ．１％，ＫＨ２Ｐ０４ Ｏ．１％，ＭｇＳ０４?７Ｈ２０ ０．０５％，葡萄糖１％，蒸馏水适量，ｐＨ４．５。高渗透压培养基：葡萄糖１５９，酵母膏０。１５９，蒸馏水１５ｍＬ，最终糖浓度为５０％。 ３．２．４仪器与设备 同２．２．４。 ３．２．５实验方法 （１）生长曲线的测定同２．２．５（１）。（２）形态学鉴定①菌体大小测定同２．２．５（３）①。②菌落形态观察同２．２．５（３）②。③子囊孢子（ａｓｅｏｓｐｏｒｅ）的形成和形态 取鉴定菌株用麦芽汁琼脂斜面转接２～３代，再以生长旺盛的培养物移种至Ｇｏｒｏｄｋｏｗａ培养基，Ｋｌｅｙｎ培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基。２８＊（２培养２２山东轻工业学院硕士学位论文３～５ｄ后开始涂片观察。④假菌丝（ｐｓｅｕｄｏｈｙｐｈａｅ）的形成和形态取平底培养皿，倒一层马铃薯琼脂培养基，凝固后倒置数小时，使表面稍干，将待鉴菌种划线接种２～３条，在其上盖上灭菌盖片（盖片可用７５％的乙醇浸泡后，火焰烧去乙醇，待盖片冷却后盖上），２５～２８℃培养３～５ｄ后，用低倍镜观察盖片下划线两旁是否形成假菌丝及其类型。 ⑤掷孢子（ｂａｌｌｉｓｔｏｓｐｏｒｅ）ｌ拘形成和形态 将待鉴菌种接种于麦芽汁固体斜面或平板，２５～２８＂Ｃ倒置培养３～７ｄ后， 观察斜面相对的试管壁或皿盖上是否形成和菌落形状相同的镜像（ｒａｚｏｒ）。如能形成，则应观察掷孢子的形状和大小。（３）生理生化试验鉴定 ①糖发酵 以新鲜培养物分别接种于发酵管，２８。Ｃ下培养，每天观察结果。凡能发酵 某种糖时，则在杜氏管顶部收集到一定量的Ｃ０２。 ②碳源同化本试验采用液体法，即在含有０．５％的某种碳源的基础培养液中加入新鲜培养物少许，接种量应尽可能做到一致，２８℃下培养１～２ｄ。观察生长时，注 意液体是否变混浊，是否有醭、环或岛的形成等。⑧氮源同化 方法同３．２．５（３）②。④产生类淀粉类化合物 本试验采用液体法，即在生类淀粉类化合物的液体培养基中，接入新培养物，２８。Ｃ培养３周，然后加碘液１～２ｄ，如颜色变蓝或者紫，则证明有类淀粉 类化合物生成。⑤产酯测定取１０％豆芽汁配制成５％的葡萄糖溶液，接入新培养物，２８。Ｃ培养３～５ｄ，用嗅觉判断是否有酯类香气。 ⑥耐高渗透压的测试 将新培养物接种于含５０％葡萄糖和ｌ％酵母膏溶液的试管中，２８℃下培养 ｌ～２周后，观察生长与否。（注：若有菌体生长，还应测试含６０％葡萄糖的生长情况。） ⑦在３７ ４Ｃ下作生长温度测试取新培养物，划线接种于麦芽汁琼脂斜面，３７。Ｃ下培养３～４ｄ，观察结果。 如系弱生长，则应重复接种，以同样温度培养３～４ｄ以后的结果为准。（注：第三章酸浆巾一株产香菌的鉴定若有菌体生长，还应在４２＂Ｃ下作生长温度测试。）３．３结果与讨论 ３．３．１结果 （】）生长曲线 通过比浊法测定ＣＦ６１０的生长曲线，如图３．１所示。１．２ｌ０．８ Ｏ．６ ０．４＾＿目。葛一越米昏０．２ ０ ０ １０ ２０ ３０ ４０ ５０时问（ｈ） 图３．１ ＣＦ６ｔ０生长曲线 Ｆ蟾ｕｍ ３．１ Ｃｔｏｗｔｈ ｃｌｌｒｇｃ ｏｆＣＦ６１０通过图３．１可以看出，从４ｈ开始，ＣＦ６１０开始进入指数生长期，２０ｈ后开 始进入稳定期。 （２）形态学鉴定 ＣＦ６１０单个菌体形态如图３．２所示。 ＣＦ６１０在固体培养基上的菌落形态如图３．３所示。图３．２ ＣＦ６１０单个菌体形态（１０００ｘ）Ｆｉｇｕｒｅ ３．３ Ｃｏｌｏｎｙ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ＣＴ：６１０Ｏｉｌ图３．３ ＣＦ６１０在固体培养基上的菌落形态Ｆｉｇｕｒｅ ３．２ Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ＣＦ６１０ｓｏｌｉｄｃｕｌｔｍｅ ｍｅｄｉｕｍ山东轻工业学院硕士学位论文（３）假菌丝的形成与形态 假菌丝的形态如图３．４所示。图３．４ ＣＦ６１０的假菌丝形态Ｆｉｇｕｒｅ ３．４ Ｐｓｃｕｄｏｈｙｐｈａｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆＣＦ６１０形态学观察结果如表３．１所示。表３．１ ＣＦ６１０形态学观襄结果Ｔａｂｌｅ ３．１ Ｒｅｓｕｌｔ ｏｆｍｏｒｐｈｏｉｏｇｌｃ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＦ６１０第三章酸浆中一株产香菌的鉴定（４）生理生化试验鉴定ＣＦ６１０生理生化特征如表３．２所示。表３．２ ＣＦ６１０生理生化特征Ｔａｂｌｅ ３．２ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｐｅｃｉａｌｉｌｌｅｓ ｏｆ ＣＦ６―１０项目 糖发酵 葡萄糖 乳糖 半乳糖 麦芽糖 蔗糖 糖同化 乳糖 半乳糖 麦芽糖 蔗糖 山梨糖 Ｄ．木糖 醇同化 山梨醇 甘露醇 肌醇 乙醇 甘油 氮源同化ＫＮ０３结果＋－一?－一一＋ ＋一一＋ ＋一＋＋?（ＮＨ４）２Ｓ０４＋生类淀粉类化台物 产酯测定 耐高渗透压（５０％） ３７。Ｃ生长 ４２℃生长 注：＋表示呈阳性，－表不呈阴性。＋＋一＋＋根据上述结果并参照酵母菌的特征与鉴定手册硎，推断ＣＦ６１０为弗里斯假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａｆｒｅｙｓｃｈｕｓｓｉｉ）。 ３．３．２讨论本试验待鉴菌株ＣＦ６１０是胶酸浆中分离而得到的，而酸浆又是黄浆水经过多种微生物发酵而成。但是，酵母菌的鉴定通常均采用麦芽汁。因此，试验山东轻工业学院硕士学位论文中各指标的测定所用菌种并未采用黄浆水液体或固体培养基培养得到。 本试验同样选择了尽可能少而又很关键的指标进行测定，通过菌落形态特 征的观察和生理生化指标检测，ＣＦ６１０菌株所测定的生理生化指标与弗里斯假丝酵母完全吻合。因此，可以推断ＣＦ６１０菌株即为弗里斯假丝酵母。 目前，很少见有关于弗里斯假丝酵母应用方面的报道。如前所述，该菌株是从酸浆中分离出来的，利用酸浆作为点浆剂生产出来的豆腐制品具有特殊的香味，并且单独利用该菌种发酵黄浆水时也有香味物质生成。据此，可以断定 ＣＦ６１０是酸浆中主要的产香菌。 因此，ＣＦ６１０具有很广阔的开发前景和发展空间。本试验结果同样也为该菌制备天然凝固剂提供了一定的理论依据。第四章ＡＰＩ １７最适发酵条件的研究第四章ＡＰＵ７最适发酵条件的研究４．１引言ＡＰｌ１７通过试验鉴定为嗜酸乳杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ），其产酸类型为乳酸。嗜酸乳杆菌是乳酸菌家族中被极为重视研究与开发的益生菌之一， 并被视为第三代酸乳发酵剂菌种。黄浆水作为豆腐制作过程中的副产品，其ｃ：Ｎ约为１０～１５：１，黄浆水可作为嗜酸乳杆菌发酵产酸的原料，而一般培养基的Ｃ：Ｎ为１００：０．５～２．０【６副。 因此，需要添加一定量的碳源以提高生物量和代谢产物量。由于酸浆的凝固机理是酸凝，因此，提高其产酸量就显得尤为重要。本试 验通过适当降低黄浆水培养基的ｐＨ，对本实验室保藏（从酸浆中分离、纯化）的ＡＰｌｌ７进行驯化，以期筛选出产酸量较高的菌株。并且对其最适发酵条件进行分析研究，利用正交试验法优化培养基的组成，为应用其与ＣＦ６１０混合 发酵生产天然凝固剂或其他工业化开发提供初步的实验依据。 ４．２材料与方法４．２．１菌种 本试验所用菌种为实验室保藏的ＡＰｌｌ７。在使用前需经过活化。 菌种活化：从斜面接一环到１００ｍＬ／２５０ｍＬ三角瓶的黄浆水液体培养基中， ３８℃，培养２４ｈ。种子培养：以１０％接种量接入１００ｍＬ／２５０ｍＬ三角瓶的黄浆水液体培养基中，３８＂Ｃ，初始ｐＨ为自然ｐＨ（６．Ｏ～６．５），培养１８ｈ。 ４．２．２试剂 葡萄糖ＮａＯＨ Ｃ６Ｉ－１４Ｃ０２ＨＣ０２Ｋ食品级 分析纯 分析纯 分析纯ＤＮＳ（３，５一二硝基水杨酸）４．２．３培养基 种子培养基：实验室自制黄浆水，添加葡萄糖２％（ｗ／ｖ）。 发酵培养基：实验室自制黄浆水，添加一定量的葡萄糖。４．２．４仪器与设备同２．２．４。４．２．５实验方法 （１）添加不同碳源对ＡＰｌｌ７产酸量的影响山东轻工业学院硕士学位论文分别选择Ｄ．果糖、棉子糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖为参试碳源， 添加量均为２％（ｗ／ｖ），培养基以黄浆水配制。以１０％接种量接入１００ｍＬ／２５０ｍＬ三角瓶的添加了上述各碳源的黄浆水液体培养基中，３８＂Ｃ，发酵４８ｈ，测其产酸量。（２）发酵时间对ＡＰｌｌ７产酸量的影响 以１０％接种量接入１００ｍｌＪ２５０ｍＬ三角瓶的添加了４％（ｗ／ｖ）葡萄糖的黄浆 水液体培养基中，３８４Ｃ，静置培养，于不同时间测其产酸量。 （３）发酵温度对ＡＰｌｌ７产酸量的影响 以１０％接种量接入１００ｍＬ／２５０ｍＬ三角瓶的添加了４％（ｗ／ｖ）葡萄糖的黄浆 水液体培养基中，在不同温度下分别静置培养７２ｈ，测其产酸量。 （４）不同葡萄糖添加量对ＡＰｌｌ７产酸量的影响 以１０％接种量接入１００ｍＬ／２５０ｍＬ三角瓶的添加了不同量葡萄糖的黄浆水液体培养基中，４０℃，静置培养７２ｈ，于不同时间测其产酸量。 （５）不同接种量对ＡＰＩ １７产酸量的影响以不同接种量接入１００ｍＬ／２５０ｍＬ三角瓶的添加了４％葡萄糖的黄浆水液 体培养基中，４０℃，静置培养７２ｈ，测其产酸量。 （６）产酸量的测定方法㈣取５ｍＬ发酵液至２５０ｍＬ的三角瓶中，加入２５ｍＬ蒸馏水，再加２ｄ０．１％的酚酞，摇匀，用０．Ｏｌｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ溶液滴定至显微红色，３０ｓ不褪色即为终点。产酸量以式（４．１）计算： 产酸量（以乳酸计，ｇ／ｌＯＯｍｋ）＝―Ｃｘ（Ｖ－－Ｖｏ―）ＸＫＸｌ００ｍ式（４．１）式中：Ｃ一标凇ＮａＯＨ溶液的浓度（ｍｏｌ／Ｌ）；蝴定待测样消耗标准ＮａｏＨ溶液的体积（ｍＬ）；Ｖｒ一滴定黄浆水原样消耗的标准ＮａＯＨ溶液的体积（ＩＩｌ】Ｌ）： Ⅱｌ?取样量（ｍＬ）：Ｋ―酸换算系数，用乳酸表示，Ｋ＝０．０９０。（７）还原糖含量的测定ｒｉｏ］ ①葡萄糖标准曲线的制定葡萄糖标准溶液的配制：准确称取０．１０００９分析纯的无水葡萄糖（预先在 １０５。Ｃ干燥至恒重），定容到１００ｍＬ的容量瓶中。浓度为ｌｍ∥ｍＬ。 取９支２５ｍｍＸ２５０ｒａｍ的试管，分别按表４－．１加入试剂。苎型！垒！！！！墨望苎壁绁箜堡塞表４．１制定葡萄糖标准曲线的试剂添加量．一――堕旦蒸馏水（ｍＬ） ３，５－二硝基水杨酸（ｍＬ）旦２．０ １．５！０．２ １．８ １．５兰０．４ １．６ １．５！０．６ １．４ １．５兰０．８ １．２ １．５！１．０１．０皇１．２ ０．８ １．５！１．４ ０．６ Ｉ．５！１．６ ０．４ ｌ～葡萄糖标准液（ｍＬ）０１．５将各管溶液混合均匀，在沸水浴中加热５ｍｉｎ，取出后了立即用冷水冷却至室温，再向每管加入２Ｌ５ｍＬ蒸馏水，摇匀。于波长５４０ｒｉｍ处测其吸光度㈧值，以葡萄糖ｍｇ数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制出标准曲线。 ⑦发酵液中还原糖含量的测定 将发酵液适当稀释后，吸取１．０ｍＬ，然后加入１．０ｍＬ蒸馏水和１，５ｍＬ３，５ 一二硝基水杨酸，同时做空白（２．０ｍＬ蒸馏水，１．５ｍＬ ３，５一二硝基水杨酸）。 后续操作同４．２．５（７）①。 测定后，取样品的Ａ平均值在标准曲线上查出相应的糖量。４．３结果与讨论４．３．１结果 （１）添加不同碳源对ＡＰＩ １７产酸量的影响 为了选择ＡＰＩｌ７发酵产酸的最适碳源，选择６种糖作为参试碳源，产酸 量结果如图４．１所示。图４．１不同碳源对ＡＰＩｌ７产酸量的影响砘ｕ∞４．１ Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔ ｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃａｒｂｏｎ￥ｏｌｌｌＶ’七ｏｌｌ ａｃｉｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆＡＰｌｌ７ｆｅｒｍｅｎｔｉｏｎ从图４．１中可以看出，ＡＰｌｌ７利用葡萄糖产酸量最高，其次为蔗糖，最低山东轻工业学院硕士学位论文的为麦芽糖。利用葡萄糖比蔗糖产酸量提高了３４．１％，比利用麦芽糖提高了 ５６．４％。因此，可以确定葡萄糖为ＡＰｌｌ７发酵产酸的最适碳源。 （２）发酵时间对ＡＰｌｌ７产酸量的影响 为了确定ＡＰｌｌ７发酵产酸的最适时间，选择２４ｈ、４８ｔｌ、７２ｈ和９６ｈ作为 取样时间，测其产酸量，结果如图４．２所示。０．８善０．６高０．４鏊㈣茸 、００Ｚ４４８７２９６１２０时间（ｈ） 图４．２ＡＰｌｌ７的产酸曲线ｒ－蟾ｕｒｅ ４．２ Ｃｕｒｖｅ ｏｆａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆＡＰｌｔ７ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ从图４．２中可以看出，从２４ｈ到９６ｈ，其产酸量呈现逐渐升高的趋势。发 酵２４ｈ，其产酸量仅为０．２６９９／ｌＯＯｍＬ；发酵７２ｈ，产酸量为０．５３３９／１００ｍＬ：而 发酵９６ｈ，产酸量为０．５３４９／１００ｍ／．，，仅比７２ｈ时提高了不到０．２％。因此，可 以确定７２ｈ为ＡＰｌ １７的最适发酵产酸时间。 （３）发酵温度对ＡＰｌ １７产酸量的影响 为了确定ＡＰｌｌ７发酵产酸的最适温度，选择３４℃、３６℃、３８℃、４０℃和 ４２℃作为发酵温度，测其产酸量，结果如图４．３所示。一０．６｜ｏ．５５≥０．５塞ｏ．４５．｝Ｌ０．４ ３２ ３４ ３６ ３８ ４０ ４２４４温度（℃）图４．３发酵温度对ＡＰｌｌ７产酸量的影响Ｆｉｇｕ∞４．３ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅＯｌ２，ａｃｋｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆＡＰｌｌ７ｆｅｍｔｎｔｉｏｎ第四章ＡＰＩｌ７最适发酵条件的研究从图４．３中可以看出，从３４。Ｃ开始，随着温度的升高，产酸量逐渐增加， 至４０℃时达到最大值，为０．５６８９／１００ｍＬ，较３８℃时的产酸量提高了将近８％， 而在４２。Ｃ时的产酸量呈下降趋势。因此，可以确定４０℃为ＡＰｌｌ７发酵产酸的 最适温度。 （ｔ）不同葡萄糖添加量对ＡＰＩｌ７产酸量的影响 为了确定ＡＰｌｌ７发酵产酸的最适葡萄糖添加量，选择２％、４％、６％、８％ 和１０％作为葡萄糖添加量，测其产酸量，结果如图４．４所示。００．６．５５ ５Ｏ Ｏ．／＾＼ ／、―～．―，。． ． ，―． 、。ｒ．Ｌ０一．４５ ４＾１血０ ．【‰ｖ珊岛ｋ０．２４６８１０１２葡萄糖