＿９８９５】７分类号密级Ｕ１）ｃ—————————————————————————————————————————————一⑧研究生学位论文产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳 聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究研究生姓名段妊指导教师姓名韩窒左教授申请学位级荆亟±专业领域渔滢生物堂论文答辩日期全鲤§生垒旦墨！旦学位授予日期２凶壁生曼县一中国海洋大学产壳聚耱酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究摘要壳聚糖酶是一种降解壳聚糖的专一性水解酶，可用于制备功能性的壳寡糖。 本研究立足于从微生物中寻找高活性壳聚糖酶的新来源，以期对酶法制备壳寡糖 的规模化生产及应用开发研究提供实验依据和基础。 本研究是对本实验室保种的一株产壳聚糖酶的微生物菌株Ｐ００３进行了发酵条件优化，结果表明其最适培养条件为（％，ｗ／ｖ）：删。）２Ｓ０４２．Ｏ％，粉末壳聚糖１．Ｏ％，葡萄糖０．１％，Ｋ２ＨＰ０４０．０７％，ＫＨ２Ｐ０４０．０３％，ＮａＣｌ ０．５％，ＭｇＳ０４?７Ｈ２００．０５％，酵母提取物Ｏ．３％，调ｐＨ至５．０；接种量２．０％（ｖ／ｖ），以５００ｍＬ三角瓶装量为１５０ｍＬ， ３２＂Ｃ下１５０ｒｐｍ摇床培养９６ｈ。该条件下发酵液的壳聚糖酶活力达１０８ｕｍｏｌ，ｍＬ．ｍｉｎ， 是迄今所见报道中发酵液壳聚糖酶活力最高的微生物菌株。 菌株Ｐ００３发酵液中的壳聚糖酶经７０Ｖ艄ｑＨ４ｈＳ０４分级盐析、Ｑ—ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ阴离子交换层析、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ一７５凝胶过滤后，获得了电泳纯的壳聚糖酶，分 子量为３０．５ｋＤ。对其进行酶学性质的研究表明该壳聚糖酶的最适作用温度为４５＂Ｃ， 最适反应ｐＨ值为５．８，酶活力在ｐＨ５０．１１０范围内和４５℃以下时相对稳定：金属离子Ｍｎ２＋对酶活力有明显的促进作用，Ｈｇ”、ｃｄ”、Ｆｅ”、ｃｕ２＋和Ａ矿则对酶活力具有明显的抑制作用；ＥＤＴＡ、氨基葡萄糖盐酸盐和ＳＤＳ对酶活力亦具有不同程度 的抑制作用，而蛋白抑制剂Ｄ一巯基乙醇对酶活力没有影响；该壳聚糖酶最适作用 底物为胶体壳聚糖，其次为壳聚糖醋酸溶液，对胶体几丁质也表现一定的水解活 性，但不能降解羧甲基壳聚糖和羧甲基纤维素。 采用该壳聚糖酶对壳聚糖进行酶解试验，发现约１０．５ｕ的该壳聚糖酶液至少 可水解ｌｇ壳聚糖：酶解最适温度为４５＂Ｃ，最适ｐＨ值为５．８，壳聚糖底物脱乙酰 度高于８５％有利于酶解反应的进行。在最适酶解条件下酶解一定量壳聚糖，经乙 醇沉淀获得了水溶性良好的壳寡糖，薄层层析显示该壳寡糖成分比较单一，乙酰 丙酮法测得降解产物的数均分子量约为１２２０Ｄａ。 关键词：壳聚糖酶：发酵条件；分离纯化；酶解兰塞塞堡堕堕鳖竺垄壁墨竺垡些：塞塞塑堕塑坌墨丝！兰皇堕兰竺垦堕窒Ｓｔｕｄｙｏｎｏｐｔｉｍａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆａｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆｔｈｅ ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅＡｂｓｔｒａｃｔＣｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ｗｈｉｃｈ ｃａｔａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ ｂｏｎｄｓ ｏｆ ｃｈｉｔｏｓａｎ，ｃｏｕｌｄ ｈｙｄｒｏｌｙｚｅ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｉｎｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈｉｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ａｎｄ ｇｌｕｓｏｓａｍｉｎｅ．Ｏｕｒ ｒｅｓｅａｒｃｈｆｏｃｕｓｅｓｏｎｆｉｎｄｉｎｇ ｎｅｗ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ｆｒｏｍ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｉｎｇｏｎｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｓｕｐｐｏｒｔｅｎｚｙｍｉｃ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ａ ｓｔｒａｉｎ ｗｉｔｈ ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｏｉｌ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｐ００３ ｓｔｒａｉｎ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅａｒｅ ａｓｆｏｌｌｏｗｓ（％，ｗ／ｖ）：ｐｏｗｄｅｒ ｃｈｉｔｏｓａｎ１．０，ｇｌｕｃｏｓｅ０．１，（ＮＩ－］４）２Ｓ０４ ２．０，ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ ０．３，Ｋ２ＨＰ０４０．０７，ＫＨ２Ｐ０４０．０３，ＮａＣｌ ０．５，ＭｇＳ０４?７Ｈ２０ ０．０５，ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ５．０．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｐ００３ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ａｒｅ ５００ｍＬ ｆｌａｓｋ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １５０ｍＬ ｍｅｄｉｕｍ，２．Ｏ％（ｖ／ｖ）ａｍｏｕｎｔ ｏｆｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ，３２＂Ｃ ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｈａｋｉｎｇ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎａｔ１ ５０ｒｐｍｆｏｒ ９６ｈｏｕｒｓ．Ｔｈｅｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｂｒｏｔｈＣａｎｒｅａｃｈＬｔ●■ ｒ『●■ －＿ｒ１０８ｕｍｏｌ／ｍＬ?ｍｉｎ ｗｈｅｎ Ｐ００３ ｉｓ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｕｎｄｅｒ ａｆｏｒｅｍｅｎｔｉｏｎｅｄ ｃｏｎｄｉｄｏｎｓ．，Ｔｈｅｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅｏｆ ｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｂｒｏｔｈ ｉｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙａｍｍｏｎｉｕｍｓｕｌｆａｔｅｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ（７０％ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）．ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ｃｏｌｕｍ ａｎｄＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ．７５ ｃｏｌｕｍ，ＳＤＳ—ＰＡＧＥ ｓｈｏｗｓａｓｉｌｌ舀ｅ ｂａｎｄｆｏｒ ｍｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅａｎｄｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｉｓ ｅｓｔｉｍａｔｅｄｔｏ ｂｅ ３０．５ｋＤ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｆｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒｐＨ ｉｓ ５．８，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；Ｔｈｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ｉｓ ４５＂Ｃａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙｉｓ ｓｔａｂｌｅｉｎｔｈｅｐＨ ｒａｎｇｅｏｆ５．０—１１．０ａｎｄｔｈｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｕｎｄｅｒ４５。Ｃ；Ｍｎ２＋ｃａＩｌ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ，ｗｈｅｒｅａｓ Ｈ９２＋，ｃｄ２＋，Ｆｅ３＋，ＣｕＺ＋ａｎｄＡ矿Ｃａｎｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ；ＥＤＴＡ，ＧｌｕＮＨ２‘ＨＣＩｎｏａｎｄＳＤＳ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ ａｌｓｏ，ｗｈｅｒｅａｓ １３－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ ｈａｓｅｆｆｅｃｔｏｎｉｔ；ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｓｈｏｗ ａｃｔｉｖｉｔｙｆｏｒ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ，ｃｈｉｔｏｓａｎ ａｎｄ 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都比较低，因此，为了得到高活性的壳聚糖酶，本实验室进行了产壳聚糖酶菌株的分离、筛选，得到了一株产壳聚糖酶能力较高的菌株Ｐ００３。本论文的主要工作是对菌株Ｐ００３进行发酵产酶条件的优化，对发酵得到的高 活力壳聚糖酶进行纯化和部分酶学性质的研究，并利用该壳聚糖酶酶解壳聚糖制 备了一定量的壳寡糖。产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究第一章文献综述 １壳聚糖及壳寡糖概述几丁质（ｃｈｉｔｉｎ）又称甲壳质，甲壳素，化学名为ｐ（１，４）－２－乙酰氨基一２－脱氧－Ｄ一 葡萄糖。它广泛存在于虾、蟹和昆虫类等节肢动物的外壳及部分高等植物和真菌 细胞壁中，是自然界中含量仅次于纤维素的第二大类天然高分子化合物。１８２３年 由Ｏｄｉｅｒ从甲壳动物外壳中提取并命名。几丁质是白色或灰白色，半透明的无定型 固体，不溶于水、稀酸溶液、稀碱溶液、浓碱溶液和一般有机溶剂（蒋挺大，２００３）。 １９９１年，日本、美国、欧洲的医学界和营养食品研究机构将几丁质定为在碳水化 合物、蛋白质、脂肪、维生素和矿物质之后的第六大生命要素（康战燕等，１９９９；王小红等，１９９９）。壳聚糖（Ｃｈｉｔｏｓａｎ）俗称甲壳胺、脱乙酰几丁质等，是几丁质脱去部分乙酰基 的产物，化学名为Ｂ（１，４）．２．氨基．２．脱氧．Ｄ．葡萄糖，是一类由２莓￡基．２．脱氧．葡萄 糖和２．乙酰氨基．２．脱氧．葡萄糖单体（＜４０％）通过Ｂ．１，４糖苷键连接而成的直链 多糖。壳聚糖也是白色无定型、半透明、略有珍珠光泽的固体，因原料和制备方 法不同，相对分子量从数十万至数百万不等。不溶于水或碱性溶液，可溶于醋酸 溶液（蒋挺大，２００１）。与几丁质相比，壳聚糖以性质较活泼的伯胺基取代了惰性 的乙酰氨基，含有游离的氨基，是天然多糖中唯一一种含有阳离子的高分子聚合 物，具有了更多的独特性质，如良好的生物相容性、生物降解性、无毒性以及易 成膜性，因而在医药、食品、材料、化工、农业和环保等领域得到了广泛应用。ＣＨ ２０ＨＮＨｚ壳聚糖结构式壳聚糖来源丰富，功能优越，但由于其分子量较大，且不溶于水和普通的溶２产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究剂，只能溶于酸性溶液，使它在各行业的应用受到了很大的限制。而其降解产物——壳寡糖和氨基葡萄糖，则具有很好的水溶性以及易被生物机体吸收利用等优点。壳寡糖是指聚合度为２．２０的低聚糖（蒋挺大，２００１），具有很多独特的生理活 性和功能性质。近几十年来，随着科学的发展和人们对生命现象认识的不断深入， 糖生物学的研究成为生命科学研究的新前沿。壳寡糖生理活性和功能性质的研究 已经成为各国科研中最热门的领域之一，特别是在医药、食品、保健品及农业领 域等方面，应用前景倍受瞩目，引起了国内外的广泛重视和普遍关注。 在医药领域，壳寡糖具有免疫调节，降血脂，降血糖，降血压，排胆固醇， 排重金属离子，排毒素等作用；同时，它还可以抑制癌细胞生长，转移并抑制癌毒素产生（竺国芳，２０００），因此，在抗癌新药的开发方面具有较大的前途。许多 学者已证明（王中和等，１９９７；Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔａｌ．，１９８６；Ｔｏｋｏｒｅｔ ａ１．，１９９８）一些具有免疫活性的细胞表面存在Ｎ．乙酰氨基葡萄糖（ＧＩｅＮＡｅ）或Ｄ一氨基葡萄糖（ＧｌｃＮ）残基受体，因此认为ＧｌｃＮＡｃ或ＧｌｅＮ残基和受体的结合可能与抗肿瘤密切相关。其 作用机理为ＧｌｅＮＡｃ或ＧｌｅＮ残基与巨嗜细胞表面受体结合后，激活巨噬细胞释放 ＩＬ一１，同时引起Ｔ细胞表面的ＩＬ．２受体表达，加速了Ｔ细胞成熟而释放ＩＬ．２，ＩＬ．２ 与受体结合后，进一步使Ｔ细胞加速分化为细胞毒性Ｔ细胞，从而产生抗肿瘤的作用。另外，壳寡糖的自由氨基可中和等当量的胃酸，抑制胃溃疡的发生（ＩｔｏＭ ｅｔ ａ１．，２０００）。壳寡糖还可以作为双岐因子活化增殖人体肠道中的双岐杆菌，抑制大肠杆菌及肠道内病原菌的生长。在食品工业领域，由于壳寡糖具有吸湿、保湿性和一定的抗菌活性，又可以增强机体免疫力，消除人体氧负离子自由基，活化机体细胞，延缓衰老，因此在 改善食品结构，提高食品的保健性能方面具有良好的应用开发前景。Ｓａｖａｒｄ等（Ｓａｖａｒｄｅｔａ１．，２００２）报道了不同大小的壳聚糖对蔬菜发酵中的酵母菌和乳酸菌的抑菌效果，结果表明，分子量为５０００的较高聚合度壳寡糖的抑菌效果最好，分子 量为５００的小分子寡糖的抑菌效果小于较高聚合度的壳寡糖，没有经过降解的壳 聚糖则没有抑菌效果。Ｔｓａｉ ＧＪ等（Ｙｓａｉｅｔａ１．，２０００）研究了聚合度在８以下的壳寡糖混合物在牛奶保鲜中的应用，发现其能在不同程度上抑制沙门氏菌（ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）及葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）等微生物的增殖，从而延长牛 奶的保质期。产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究在日用化工领域，利用其良好的保湿性，壳寡糖可用做保湿乳液、化妆水的 原材料，保湿效果与透明质酸类似，成本却降低近一半。壳寡糖还可用于发胶中， 使头发更有光泽并防止头发受到紫外光的破坏。 在农业领域，壳寡糖可以作为植物生长调节剂和天然新型生物农药。在植物 的抗病机制中，聚合度为６－９的壳寡糖对植物病原菌有抗菌活性，可以作为诱导物 诱发植物的抗病反应。另外，壳寡糖还能调节植物基因的关闭与开放，促进植物 细胞的活化，刺激植物生长，达到增产的目的（张付云等，２００５）。 总之，壳寡糖功能众多，应用广泛。因此，选择合适的方法和条件，将资源 丰富的壳聚糖降解为具有多种生理功能的壳寡糖，是当前关于几丁质和壳聚糖的 研究领域中最为活跃的分支之一。２壳寡糖的制备目前，降解壳聚糖制备壳寡糖的方法主要有化学降解法、物理降解法和酶降 解法。 化学法是工业化生产中最早、最常用的方法。主要有酸降解法和氧化降解法。 酸降解法一般采用ＨＣｌ、ＨＦ等使壳聚糖主链上的Ｂ．１，４糖苷键断裂而生成各种分 子量相对较低的多聚物和Ｄ．氨基葡萄糖，充分水解只能得到单糖。氧化降解法采 用的是ＨＮ０２、ＨｚＯｚ、过硼酸钠等试剂将壳聚糖的Ｂ－１，４糖苷键氧化断裂，得到 的主要是四糖以下的低聚物，并且有些氧化法会引起反应产物结构的改变。 目前国内的生产厂家大多数采用化学降解法制备壳寡糖，由于化学法是非特 异性降解，反应条件十分苛刻，水解较难控制，而且产物转化率低，分离过程复 杂，反应过程中使用大量的浓酸和其他化学试剂，严重污染了环境并且降低了产 物的安全性。另外，采用化学降解法得到的降解产物聚合度一般很低，单糖含量 较高，很难得到较高聚合度的高活性壳寡糖，功能性较低（张立彦，曾庆孝，２０００）。４产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究化学法制备壳寡糖的途径物理降解法包括Ｙ．射线降解法、超声波降解法、光降解法和微波降解法等。虽然操作简单可控性好，但各种物理降解法降解效率普遍较低，很难得到符合一定分子量范围的产品。一般只作为化学降解方法的辅助手段，起到降低生产成本，缩短生产周期的作用。壳聚糖的酶法降解是利用自然界中存在的特别是微生物产生的各种酶来降解 壳聚糖制备壳寡糖。选择合适的生物酶降解壳聚糖，可以特异性地、选择性地切 断壳聚糖链上的Ｄ一１，４糖苷键，相对于化学法降解，酶法降解反应过程容易控制，易于得到所需分子量范围的低聚糖产品，反应专一性强，产物寡糖含量高，功能性 更强。另外酶法降解是在较温和的条件下进行的，降解过程不需要加入大量的反应试剂，产物安全性高，并且不易造成环境污染。因此，采用酶法降解壳聚糖是 壳聚糖资源利用的研究热点。３酶法降解壳聚糖用于降解壳聚糖的酶有专一性水解酶和非专一性水解酶。３．１非专一性酶对壳聚糖的降解３．１．１溶菌酶在大多数的哺乳动物中，几丁质的降解主要是由溶菌酶引起的。溶菌酶能以 几丁质和部分Ｎ．乙酰化的壳聚糖为作为底物，裂解１３—１，４－糖苷键，从而将其降解。 通过对部分脱乙酰几丁质（ＤＡＣ）及部分乙酰化壳聚糖（ＰＮＡＣｓ）溶菌酶降解敏感性和消化性的研究发现（Ｓｅｉｃｈｉｅｔａ１．，１９９４），底物的脱乙酰程度及ＧｌｅＮＡｅ、ＧｌｅＮ产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究的分布情况显著影响溶菌酶对上述底物的水解。３．１．２脂肪酶脂肪酶（１ｉｐａｓｅ）是作用于水．有机界面上不溶性底物的酶。近年来，脂肪酶对壳聚糖的降解作用已引起了不少学者的兴趣。Ｐａｎｔａｌｅｏｎｅ等（Ｐａｎｔａｌｅｏｎｅｅｔａ１．，１９９２）研究了不同来源的５种脂肪酶在ｐＨ３．６时对壳聚糖的降解作用，通过对降解产物 的粘度分析，发现来自猪胰腺的脂肪酶对壳聚糖有强烈的水解作用。Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ等（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉｅｔａ１．，１９９５）的研究结果表明，在２５℃，微酸性条件下，麦胚脂肪酶降解壳聚糖的反应速度很快，体系粘度在反应开始１０ｍｉｎ后就下降到初始值的 ３５％，相对分子质量从７００，０００降为１３，０００，并且壳聚糖的脱乙酰度不发生改变。３．１．３纤维素酶纤维素与壳聚糖结构相似，都是由Ｄ．葡萄糖经Ｂ．１，４糖苷键聚合而成的多糖。 据报道，某些纤维素酶具有较强的水解壳聚糖的活性。Ｄａｖｉｄ等发现Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｎｖ护ｉｄｅ和Ｔｒｅｅｓｅｉ三种真菌产生的纤维素酶均能使壳聚糖粘度显著下降（Ｄａｖｉｄｅｔａ１．，１９９２）；刘羿君等利用纤维素酶催化水解壳聚糖，通过控制反应条件可以制备聚合度为２—１２的壳寡糖，寡糖收率８８％（刘羿君等，２００５）。 有研究者（刘靖，２００５）对Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｎ ｖｉｒｉｄｅ生产的纤维素酶进行分离纯化，得 到了一个分子量约６６ｋＤ，具有纤维素酶一壳聚糖酶双活性的纯酶组分。３．１．４蛋白酶蛋白酶具有一些有利于水解的特性，且其价格低廉，因此也有许多研究者利 用其进行降解壳聚糖的研究，但水解的机理有待于进一步研究。Ｙａｌｐａｎｉ等（Ｙａｌｐａｎｉｅｔａ１．，１９９４）人在ｐＨ３．０和４０℃条件下利用蛋白酶水解壳聚糖，发现底物的平均相对分子质量由４００，０００．７００，０００下降至１０００．１０，０００之间，正好符合食品及药品行业 所需要的寡糖分子量范围。Ｆｕ ＪＹ等（Ｆｕ ＪＹｅｔａ１．，２００３）通过亲和层析和离子交换层析等手段从猪胃蛋白酶粗制剂中分离得到三种壳聚糖酶同工酶，经测定三种酶的分子量都在４０ ｋＤａ左右，其最适ｐＨ值分别为５．０，５．０和４．Ｏ，最适温度分别为 ４０℃，４０℃和３０℃，等电点分别为４．９，４．６和４．４，对脱乙酰度为６８．８８％的壳聚糖降解效果比较明显。 除了上述几种酶外，果胶酶，葡萄糖甘酶，半纤维素酶等也能不同程度的降６产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究解几丁质和壳聚糖。也有研究者发现，采用复合酶对壳聚糖进行降解效果优于单 一酶（ＺｈａｎｇＨ，１９９９）。从结构上看，这些酶中不存在共同的催化基团，其具体的作用机制尚不清楚。３．２专一性水解酶包括几丁质酶（ｃＭｔｍａｓｅ）和壳聚糖酶（ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ），几丁质酶可催化降解完 全没有脱乙酰化的几丁质，却不能降解完全脱乙酰化的壳聚糖，而壳聚糖酶正好 与之相反。然而，这两种酶都能够催化降解部分脱乙酰化的几丁质，在这一点上 将二者严格区分是有困难的。一般来讲，壳聚糖酶的分子量要小于几丁质酶的分子量。３．２．１几丁质酶几丁质酶广泛存在于动物、植物和微生物中，分子量差异较大，一般在３１ｌ一１５ｋＤ之间，最适ｐＨ值范围较宽，在３．０－－９．０之间，４０－－５０。Ｃ酶活性最高，底物专一性较窄，仅水解几丁质而不水解纤维素。壳聚糖是几丁质不同程度上脱去 乙酰基的产物，与几丁质在结构上具有相似性，因此，许多几丁质酶对壳聚糖也具有一定的降解活性。不同来源的几丁质酶的类别、组分和性质不尽相同，但都能专一性地水解线 性结构的乙酰氨基葡萄糖苷键，且发生作用时，要求底物中必须至少有一个Ｎ一乙 酰氨基葡萄糖残基作为还原端基团在水解键的一侧，不能作用于ＧｌｅＮ－ＧｌｅＮ问的键。目前国内外对几丁质酶的研究已经较为深入，除了已从多种微生物中分离纯 化出各种几丁质酶外，还从分子水平上对产酶微生物的基因作了研究和分析。虽 然各种几丁质酶差异较大，但在功能上起关键作用的残基在进化上是保守的，多 数微生物的几丁质酶都具有相似的结构域。３．２．２壳聚糖酶 壳聚糖酶（Ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ）是降解壳聚糖的专一性酶类。不同来源壳聚糖酶作用的底物不同，因此，对壳聚糖酶的研究是酶法降解壳聚糖制备壳寡糖研究中的中 心内容之一。产亮聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究４壳聚糖酶的研究进展４．１壳聚糖酶的发现和来源１９７３年，Ｍｏｎａｇｈａｎ等（Ｍｏｎａｇｈａｎ ｅｔ ａ１．，１９７３）在研究细菌和真菌过程中，首先提出壳聚糖酶是一种不同于几丁质酶的新酶，这种酶对胶态几丁质不水解，但 是能够降解完全脱乙酰化的壳聚糖，被认为是对线性壳聚糖具有水解专一性的一 种酶。１９９２年国际酶学大会上壳聚糖酶被系统命名为Ｔｃ．３．２．１．９９］。２００４年，国际 酶学委员会将壳聚糖酶重新定义为：以内切方式催化水解部分乙酰化壳聚糖中的 １３－１，４氨基葡萄糖萤键的酶。 壳聚糖酶主要存在于真菌、细菌、放线菌中，在单子叶和双子叶植物的不同 组织中也发现有壳聚糖酶的活性（Ｏｓｓｗａｌｄｅｔａ１．，１９９４），但动物中尚未发现壳聚糖ｅｔ ａ１．，１９９７；Ｓｕｎ Ｌ ｅｔ酶。此外，在某些病毒中也发现壳聚糖酶的存在（Ｙａｍａｄａａ１．．１９９９）。其中，微生物是壳聚糖酶的最主要的来源。迄今，已在多种微生物中 分离纯化出了壳聚糖酶。 绝大多数微生物都将产生的壳聚糖酶分泌到胞外，胞内型壳聚糖酶主要存在于少数植物（Ｇｒｅｎｉｅｒｅｔａ１．，１９９１）和结合真菌（Ｒｅｙｅｓｅｔ ａ１．，１９８５；Ａｌｆｏｎｓｏ ｅｔａ１．，１９９２）中。壳聚糖酶既有诱导型，也有组成型，但目前研究的大多数微生物产生的壳聚糖酶均为诱导酶（Ｓｏｍａｓｈｅｋａｒ ｅｔ ａ１．，１９９６），当以壳聚糖作为唯一碳源，微生物即被诱导产生壳聚糖酶。也有研究者发现氨基葡萄糖也可以诱导壳聚糖酶的产生， Ｍａｓａｈｉｒｏ等发现胶体壳聚糖和氨基葡萄糖对丑ｃｅｒｅｕｓ产壳聚糖酶均有诱导活性，可 得到酶活力为３．４４Ｕ／ｍＬ的粗酶液。４．２壳聚糖酶的分类最初，研究者们将壳聚糖酶分为两大类：一类只分解壳聚糖，例如从Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ得到的壳聚糖酶；另一类可以分解壳聚糖和羧甲基纤维素，例如Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ产生的壳聚糖酶。但后来许多研究表明，不同来源的壳聚糖酶作用的底物不同，据其将壳聚糖 酶分为三类：第一类是可以水解ＧＩｅＮ．ＧｌｅＮ键及ＧＩｃＮＡｃ．ＧｌｅＮ键的壳聚糖酶，如 来自Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｎ１７４的壳聚糖酶；第二类只能水解ＧＩｃＮ—ＧＩｃＮ键，产生这一产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究类酶的代表菌株有：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｎｏ．７一Ｍ；第三类是可以水解Ｇ１ｃＮ．ＧｌｅＮ键和ＧｌｅＮ．ＧＩｃＮＡｃ键的壳聚糖酶，产酶菌株包括Ｒｃｉｒｃｕｌａｎｓ ＭＨＫｌ。所有的壳聚糖酶都要求糖苷键的一侧至少有一个ＧｌｅＮ残基，而不能催化ＧｌｅＮＡｅ—Ｇ１ｅＮＡｅ键的断 裂（Ｆｕｋａｍｉｚｏｅｔａ１．，１９９４）。对于壳聚糖酶的这种底物特异性，Ｆｕｋａｍｉｚｏ提出了以下假设：壳聚糖酶临近催化位点的两个亚单位之一对ＧｌｃＮＡｃ基团亲和力很小，只 能结合ＧｌｅＮ基团，然而另一个亚单位比较灵活，能够同时识别ＧｌｅＮＡＣ和ＧｌｅＮ基团（Ｆｕｋａｍｉｚｏｅｔａ１．，１９９５）。另外，也有许多研究者按照壳聚糖酶的降解方式将壳聚糖酶分为内切壳聚糖 酶（ｅｎｄｏ—ｅｈｉｔｏｓａｎａｓｅ）和外切．ｐ－Ｄ一氨基葡萄糖酶（ｅｘｏ—ｐ—Ｄ—ｇｌｕｅｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）两大 类，前者将壳聚糖降解为大小聚合度不同的低聚糖，后者则从壳聚糖或壳寡糖的 非还原末端切下氨基葡萄糖，降解产物为单糖。４．３壳聚糖酶的性质到目前为止，已有众多研究者对微生物产生的壳聚糖酶进行了分离纯化并对 酶的性质进行了研究。分离纯化过程主要采用以下步骤：首先将发酵液离心，上清液加硫酸铵进行盐析，蛋白质沉淀经离心收集后进行透析脱盐，之后再采用离 子交换层析和凝胶过滤层析等方法纯化得到纯度较高的壳聚糖酶。通过ＳＤＳ—ＰＡＧＥ或凝胶过滤可以测定纯化后的壳聚糖酶的分子量，然后再进行酶的各种特性研究。 研究较多的是来源于Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ和Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ的壳聚糖酶。４．３．１分子量 壳聚糖酶的分子量一般在１０一５０ｋＤ之间，相对低于几丁质酶的分子量（３１—１１５ｋＤ）。不同来源的壳聚糖酶分子量相差较大，一般来说，植物中分离得到的壳聚糖酶分子量为１０—２３ｋＤ，而从微生物中分离得到的壳聚糖酶分子量为２０－５０ｋＤ。 如Ｍａｋｏｔｏ等（Ｍａｋｏｔｏｅｔａ１．，１９９５）对Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｓｐ．ＳｔｒａｉｎＣＨＢｌ０１产壳聚糖酶进行了分离纯化工作，得到了分子量分别３０ＫＤ和３７ＫＤ为两种壳聚糖酶。 但也存在少数高分子量的壳聚糖酶，如曲霉Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ＫＨ一９４有２种壳聚糖酶，其中一种酶的分子量高达１０８ｋＤ（Ｃｈｅｎｇ ＣＹｅｔａ１．，２０００）。Ｚｈａｎｇ ＸＹ等（ＺｈａｎｇＸＹｅｔａｌ．．２０００）从曲霉菌ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓＯｒｙｚａｅＩＡＭ２６６０纯化出分子量分别为４０ｋＤ和１３５ｋＤ的两种壳聚糖酶。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ ＫＢ－１Ｅｏｍ也产两种壳产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究聚糖酶，分子量分别为１１１．２３ ｋＤ和２３．３８ ｋＤ，前者降解壳聚糖产生氨基葡萄糖，后者降解产物为壳寡糖（Ｅｏｍ４．３．２等电点与最适ｐＨ值ＴＫ ｅｔ ａ１．，２００３）。壳聚糖酶等电点ｐＩ大部分在８．０－１０．１之间，但Ｎｏｃａｒｄｉａ Ｍｕｃｏｒｒｏｕｘｉｉ，Ｅｎｔｅｒｂａｃｔｅｒｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ ＩＦ０１ ２８０６，ｓｐ．Ｇ一１的等电点却分别为４．０，４．９和５．５。来源于各类微生物的壳聚糖酶，其最适ｐＨ范围一般在４．０—８．０之间。但也有一些例外，ＢａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓＷＬ．１２的壳聚糖酶的最适ｐＨ为９．５（ＰａｒｋＪ Ｋ ｅｔａ１．，１９９９）。Ｍａｓａｈｉｒｏ等（Ｍａｓａｈｉｒｏ ｅｔ ａ１．，２０００）对芽孢杆菌ａ．ｃｅｒｅｕｓ Ｓ１菌株产壳聚糖酶进行研究，发现该壳聚糖酶ｐＨ稳定范围为６－１１，说明该酶在偏碱性条件下比较稳定。 ４．３．３酶的最适反应温度与热稳定性 大多数微生物的壳聚糖酶具有良好的热稳定性，最适反应温度在３０－－７０＇Ｃ之 间。某些壳聚糖酶耐热性很高，如｝）ＬＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＦＢ－Ｃ１０８纯化出的壳聚糖酶最适 温度为５５＂（２，８０＂１２热处理１０ｍｉｎ或７０。Ｃ热处理３０ｍｉｎ酶活仍然保持稳定。Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ｓｔｒａｉｎＣＫ４的壳聚糖酶，６０＂Ｃ处理３０ｍｉｎ仍然能保持全部酶活性，８０＂Ｃ处理３０ｒａｉｎ和６０ｒａｉｎ后剩余酶活分别为８５％、６６％，只有在９０＊（２处理６０ｒａｉｎ才导致酶失活（ＹｏｏｎＨＧ ｅｔａｌ．，２０００）。４．３．４壳聚糖酶的催化性质 来源于不同微生物的壳聚糖酶对不同脱乙酰化程度的壳聚糖和其衍生物（如 羧甲基壳聚糖、Ｌ－－醇壳聚糖、羧甲基纤维素和羟乙基壳聚糖等）有不同特异性。丑ｓｕｂｔｉｌｉｓＫＨｌ壳聚糖酶则对氨基葡萄糖寡聚体（２～６聚合度）具有糖基转移Ｙ ｅｔ酶活性（Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉｃｉｒｃｕｌａｎｓａ１．，１９９９）。Ｍｉｔｓｕｔｏｍｉ等（Ｍｉｔｓｕｔｏｍｉ Ｍ ｅｔ ａ１．，１９９８）从ＢａｃｉｌｌｕｓｋＤａＷＬ．１２得到了分子量分别为３３ ｋＤａ和４０ ｋＤａ的壳聚糖酶，其中４０的壳聚糖酶除了具有壳聚糖酶活性外，还表现出Ｂ．１，３—１，４．葡聚糖酶的活性，酶的主要底物是壳聚糖和ｐ．１，３．１，４．葡聚糖，而且对２种底物具有相似的催化效率，这种广泛的底物特异性有助于Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ ＷＬ．１２充分降解和利用真菌的细胞壁成份 （Ｍａｓａｒｕ Ｍｅｔａ１．，１９９８）。大部分壳聚糖酶属于内切酶，降解壳聚糖生成不同聚合度壳寡糖的混合物， 反应速度很大程度上依赖于壳聚糖的乙酰化程度；在放线菌Ｎｏｃａｒｄｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ和真１０产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒ－ｍａｒｅｅｓｅｉＰＣ．３．７中分离纯化了外切型壳聚糖酶。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ＫＨ９４的２种壳聚糖能被Ｍｎ２＋激活，而被ｃｕ２＋、Ｈｆ＋抑制，其中酶Ｉ具有内切酶活性，能水解壳聚糖生成壳二糖：而酶ＩＩ则具有外切酶活性，能水解壳聚糖生成氨基葡萄糖， 另外，当反应初始底物中壳聚糖含量高过２％时，壳聚糖酶ＩＩ还具有糖基转移酶活性（ＣｈｅｎｇＣＪｏ Ｙ ｅｔａｌ．，２０００）。ＹＹ等（Ｊｏ ＹＹ ｅｔ．ａｌ，２００３）从Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｐ１６得到分子量４５ ｋＤａ内切壳聚糖酶，该酶对几丁质、纤维素和淀粉没有水解能力，对７０．８５％脱乙酰度的壳聚糖 水解能力较强，在酶解反应开始后反应体系的粘度会急剧下降，表明该壳聚糖酶 为内切酶，降解产物是聚合度为２—５的寡糖的混合物，最小作用底物为壳五糖。４．４壳聚糖酶的分子生物学特性随着分子生物学和基因工程的研究的深入，在国外关于壳聚糖酶的性质研究 逐渐从对酶的分离纯化发展到在分子水平上研究产酶基因和酶蛋白的一些特性。除了对壳聚糖酶蛋白进行序列分析以外，还通过基因克隆和定点突变技术对酶的 作用机理及不同来源的壳聚糖酶同源性进行研究和探讨。 Ｏ一糖苷水解酶（Ｏ—Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ，ＥＣ３．２．１一）是一组广泛的催化２个或多 个糖分子、或者一个糖分子与一个非糖分子之间糖苷键的酶。由于酶的氨基酸顺序与分子折叠相似性之间有直接的联系，根据酶的氨基酸序列的相似性，糖苷水 解酶分成８７个家族（除去不能分类的）。根据己知的壳聚糖酶氨基酸序列，壳聚糖酶分属其中的五类：５、８、４６、７５和８０号家族。 属于５类家族中的壳聚糖酶主要是从Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ ＨＵＴ ６０３７得到的两种酶。它们不仅水解壳聚糖，也水解羧甲基纤维素，且都有转糖基催化活性（Ｔａｎａｂｅｅｔａ１．，２００３）。８类中的糖苷酶有着更多样的底物特异性，其中Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｎｏ．７一Ｍ所产的酶是目前所知唯一只水解ＧｌｅＮ—ＧｌｅＮ键的酶（Ｏｈｎｏ Ｔ ｅｔ ａ１．，１９９６）。大多数已知的壳聚糖酶都属于４６号家族，如Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（Ｍａｓｓｏｎ Ｊ－ＹＸ ｅｔｓｐ．ＳｔｒａｉｎＮ１７４所产的酶ｅｔａｌ．，１９９４）。７５号家族主要来自真菌，如Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ等（Ｚｈａｎｇａ１．，２０００）。８０号家族主要有两种，分别来自Ｍａｔｓｕｅｂａｃｔｅｒ ｃｈｉｔｏｓａｎｏｔａｂｉｄｕｓ和ａＳｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ ＹｏｏｎＨＧ等（Ｙｏｏｎｅｔ ａ１．，２０００；Ｙｏｏｎ ＨＧ ｅｔａ１．，２００１）通过基因重组技术从Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎＣＫ４得到一种耐热的壳聚糖酶，该酶在８０。Ｃ放置９０分钟后还拥产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究有５０％的酶活力，表现出极大的工业化应用价值。降解产物主要为３－６聚合度的寡 糖。对该酶序列中的Ｇｌｕ－５０，Ｇｉｎ．６２，Ａｓｐ．６６和Ｃｙｓ－２１１进行替换研究表明Ａｓｐ－６６ 对该壳聚糖酶的催化水解是必需的，而Ｃｙｓ－２１１对于维持该壳聚糖酶的热稳定性起 关键作用。 研究发现不同微生物产生的壳聚糖酶在其序歹ｄ ｌ－＿有一段保守区域，研究者们推测该序列可能与酶的水解活性有关。为了验证这个假设，ＹｏｏｎＨＧ等（ＹｏｏｎＨＧｅｔａ１．．２０００）对从ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＣＫｌ０８中得到的热稳定壳聚糖酶ＴＣＨ．２运用定点突变对其进行分析，结果表明该酶序列中发生Ｌｅｕ６４－＋Ａｒｇ和Ｌｅｕ６４－－－，Ｇｉｎ突 变后，酶的反应常数Ｋｃａｔ和Ｖｍａｘ均变为原来的１／１０，而ＡＳＰ９８一ＧＩｕ和Ａｓｐ９８－－－，Ａｓｎ突变体的酶解常数则与原酶相差不大，说明该壳聚糖酶水解活性与其序列中的Ｌｅｕ直接有关。后来，ＹｏｏｎＨＧ等（Ｙ；ｏｏｎＨＧ ｅｔａｌ．，２００２）又将壳聚糖酶ＴＣＨ一２的氨基酸序列与从Ｂａｃｉｌｌｕｓｅｈｅｍｅｎｓ西Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ和Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ得到的壳聚糖酶的氨基酸序列作了比较分析，结果发现它们分别具有６１．６％，４８．０％和１２．６％的相似性。Ｚｈａｎｇ ＯＦｙｚａｅＸＹ等（ＺｈａｎｇＸＹ ｅｔａ１．，２００１）通过克隆技术获得了编码ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓＩＡＭ ２６６０壳聚糖酶的基因拷贝ｃｓｎＡ，它含有一个开放阅读框架，能够编码一个由２４５个氨基酸残基组成的分子量约为２６，５００ Ｄａ的多肽。序列分析结果表明 该酶的氨基酸序列与其它几种来源于真菌的壳聚糖酶具有很多相似性。Ｋｉｍｏｔｏ等（Ｋｉｍｏｔｏｅｔａ１．，２００２）对Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｆｕｋｕｉｎｅｎｓｉｓ产生的壳聚糖酶经过克隆、测序和定点突变分析结果表明该酶由７９７个氨基酸残基组成，分子量 为８５ｋＤ。与传统的属于４６家族的壳聚糖酶不同，该酶在氨基末端含有８家族糖 苷水解酶的序列，在Ｅ．ｃｏｌｉ中克隆表达的基因除了具有壳聚糖酶的活性外，还显示 Ｂ．１，４葡聚糖酶的活性。用Ｇｉｎ和Ａｓｎ取代Ｇｌｕ－１１５和Ａｓｐ一１７６以后，壳聚糖酶 和葡聚糖酶的活性即会丧失，说明Ｇｌｕ－１１５和Ａｓｐ．１７６是该壳聚糖酶的催化位点所在。梁东春等根据烟曲霉菌壳聚糖酶基因序列人工合成了其ＤＮＡ，将重组后的壳 聚糖酶基因在大肠杆菌中诱导表达，获得了高活性的壳聚糖酶，其活性受温度及 ｐｎ值的影响（梁东春等，２００５）。 从目前情况看来，研究得最为深入的是放线菌属的Ｓｌｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｎ１７４生产的产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究壳聚糖酶，已对酶的三级结构，活性中心基团都进行了研究。Ｆｕｋａｍｉｚｏ Ｔ等（Ｆｕｋａｍｉｚｏ Ｔ．ｅｔ ａ１．，１９９７）对Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎＮ１７４产生的壳聚糖酶的结构与功能研究表明Ｇｌｕ一２２和Ａｓｐ一４０与该酶的催化水解能力相关，而Ｔｙｒ残基不直接 参与水解过程但可以起到稳定酶结构的作用。另外，已知三级结构的还有ＢａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓＭＨ－ＫＩ生产的壳聚糖酶。４．５壳聚糖酶的功能与应用研究壳聚糖酶具有多种应用价值，如在农业上可作为生物防治剂以及在生物技术 中可用于原生质分离、细胞化学定位和生产单细胞蛋白等。但用其对壳聚糖进行 酶解，生产具有独特的生理活性和功能性质的壳寡糖则是当前研究的热点。 控制一定的条件，利用壳聚糖酶对壳聚糖大分子进行降解，较容易获得聚合 度为２—７的水溶性低聚壳寡糖，甚至单糖。不同来源的壳聚糖酶的水解动力模式 也不同，一般依赖于底物的特性特别是脱乙酰度的大小。如来源于ＢａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓＭＨ２Ｋ１的酶最易水解８０％脱乙酰度的壳聚糖，来源于Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏ瑚括ＵＴＫ的 酶主要作用于６５．８０％脱乙酰度的壳聚糖，Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ和Ｎｏｃａｒｄｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ产生的壳聚糖酶则对３０％脱乙酰度壳聚糖水解作用最好。目前文献中所报道的壳聚糖酶多为内切酶，水解产物为聚合度大小不等的壳寡糖混合物，只有少数壳聚糖酶是以外切方式降解壳聚糖。Ｍｉｙａｋｅ利用芽孢杆菌属ＬＣＣ２１壳聚糖酶在ｐＨ ５．０下水解反应ｌＯｈ，获得平均 相对分子质量为１５００的低聚糖。ＪｏＹＹ等（ＪｏＹＹ ｅｔ．ａｌ，２００３）利用来自芽抱杆菌 的壳聚糖酶对壳聚糖进行降解，得到了聚合度为２－５的壳寡糖。Ｉｚｕｍｅ等（Ｉｚｕｍｅｅｔａ１．，１９９２）利用从Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＯ．７－Ｍ产生的壳聚糖酶，在乳酸溶液对９９％脱乙酰度的壳聚糖中进行降解反应，在壳聚糖浓度为５％，ｐｎ值为５．４，３７＂Ｃ时反应６ｈ， 得到聚合度为２－６的壳寡糖混合物，通过高效液相色谱分析，二糖至五糖的收率可达６０％以上。Ｙａｍａｓｈｉｔａ（Ｙａｍａｓｈｉｔａ，１９９９）研究了壳聚糖脱乙酰度对Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．壳聚糖酶 生产壳寡糖的影响，发现随着脱乙酰度的增加壳寡糖的得率也增加，在水解反应 的初期产物的聚合度大于５，随着反应时间的延长，聚合度低于４的产物增加，说 明反应时间也是控制产物聚合度大小的一个关键因素。为了获得高聚合度的壳寡 糖，Ｍｕｒａｋａｍ等人探讨了几种不同来源的壳聚糖酶的特性，选择Ｓｔｒｅｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究ＨＵＴ６０３７的发酵上清液作为粗酶，在ｐＨ ５．０醋酸缓冲液中构建了一个连续酶水解流动体系，获得了一定量的高聚合度的壳寡糖。 杜昱光等（杜昱光等，２００１）选用壳聚糖酶和６０３６酶降解壳聚糖，建立用飞 行质谱方法测定壳寡糖聚合度，壳聚糖脱乙酰度和产物中还原糖浓度的方法，得 到了克级壳寡糖纯品，经过抑瘤试验，发现该壳寡糖的抑瘤率高达９９．５％，远远 高于其他来源的寡糖及磺化寡糖，尤其以对人肝癌细胞的生长抑制作用效果最好。 Ｙｏｏｎ等（ＹｏｏｎＨＧ ｅｔａ１．，２０００）通过基因重组技术得到的热稳定壳聚糖酶在５５℃左右时显示良好的稳定性，其水解壳聚糖的主要产物是聚合度为３－６壳寡糖， 水解１２ｈ寡糖产率可达８０％，具有很好的工业化应用前景。５展望壳寡糖的研制开发国外走在前列，在我国的研究始于２０世纪５０年代，直Ｎ８０ 年代才受到重视，近年来发展较为迅速，但相对于我国储量丰富的壳聚糖资源及 其广泛用途来说，其研究力度还远远不够。我国的壳寡糖生产厂家，规模一般都 较小，多采用化学降解法生产几丁质及壳聚糖作为化工及医药等原料出口，产品 附加值低，对环境污染严重，因此有效利用几丁质和壳聚糖资源，生产壳寡糖等 高附加值的产品，对于防止资源浪费、提高经济效益、加强环境保护等具有重要的意义。随着糖生物学的发展，对壳聚糖的水解产物尤其是聚合度在５一１０之间的壳寡 糖的研究逐渐深入，对其功能性质的应用开发也将越来越广泛，具有条件温和、 产物可控等优点的壳聚糖酶法降解将得到广泛的应用。但要最终实现产业化大生 产，产生显著的社会经济效益，还必须在降解酶的获得、降解反应机理、降解效 率、降解产物的分子量分布以及降解产物的分离纯化等方面进行深入地研究，探 索新的生产工艺。 目前，酶法降解壳聚糖制备壳寡糖大多数还处在实验室研究阶段，关键问题 是难以获得大量的专一性的高活性壳聚糖酶制剂，而采用非专～性酶降解壳聚糖 的效果又不够理想。虽然经过３０多年的研究，已经从多种微生物中分离出壳聚糖 酶，但因其产酶能力都较低，使壳聚糖酶的生产成本过高，价格昂贵，难以实现商业化应用。因此，要采用酶解的方法实现壳寡糖的规模化生产，充分利用和开发丰富的１４产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究壳聚糖资源，除了利用基因工程或诱变手段提高现有壳聚糖酶产量外，寻求新的 专一性的高活性壳聚糖酶来源，并对其理化性质及应用进行研究具有重要的意义。６研究目的和意义目前已从多种微生物中得到了壳聚糖酶，但酶活力普遍不高，因此继续寻找 不同微生物来源的壳聚糖酶，以得到具工业化潜在应用价值的新酶源，已迫在眉 睫。本实验室通过简便、高效的筛选方法，从自然界环境中分离筛选到一株产壳 聚糖酶活性较高的微生物菌株，作者对其进行了菌株的发酵产酶条件的优化、酶 的分离纯化以及部分酶学性质的研究，并对酶法降解壳聚糖制备壳寡糖的研究作 了一些初探性的工作，以期对壳寡糖的规模化生产及应用开发研究提供实验依据和基础。产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究第二章产壳聚糖酶菌株的筛选与发酵条件优化壳聚糖酶（ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ，ＥＣ ３．２．１．９９）主要存在于真菌和细菌细胞中，在单子叶和双子叶植物的不同组织中也发现了有该酶活性。微生物是壳聚糖酶的主要来源。 微生物产酶是一个复杂的生理生化过程，不同的培养条件直接影响菌体的代谢，从而影响酶的产量，因此，对发酵产酶条件进行优化是提高酶产量的有效手 段之一。本章通过单因子试验，对本实验室保种的一株产壳聚糖酶的菌株进行发酵产 酶条件的优化，确定该菌株产酶的最佳培养条件，以期为壳聚糖酶的研究和应用 提供新的并且活性较高的壳聚糖酶来源。１实验材料、试剂与仪器１．１菌株本实验室保存菌种Ｐ００３。１．２试剂１．２．１壳聚糖购自青岛海汇生物工程公司（脱乙酰度９０％）。不同脱乙酰度壳聚糖为实验室 自制，脱乙酰度采用电位滴定法测定（蒋挺大，２００１）。１．２．２胶体壳聚糖取２０９壳聚糖加入少量蒸馏水中，缓缓加入浓硫酸，边加边搅拌至壳聚糖完 全溶解，将反应液到入１Ｌ蒸馏水中析出胶体状的壳聚糖，待其自然沉降或离心， 将沉淀物用蒸馏水反复洗涤至接近中性，然后配制成所需浓度置４＂１２冰箱保存。１．２．３ＤＮＳ试剂９１９酒石酸钾钠加入５００ｍＬ热水中，搅拌溶解后依次加入３，５一二硝基水杨酸（ＤＮＳ）３．１５９和２０９ ＮａＯＨ，然后加入结晶酚２．５９和无水亚硫酸钠２．５９，搅拌溶解，冷却后用蒸馏水定容到１０００ｍＬ，贮存在棕色瓶中放置一周后使用。 氨基葡萄糖盐酸盐为Ｓｉｇｍａ产品。其它试剂均为国产分析纯商品。１６产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究１．３培养基１．３．１壳聚糖平板培养基（％，ｗ／ｖ） （Ｎ｝Ｊｉ４）２Ｓ０４ ０．５，ＫＥＨＰ０４ ０．２，ＮａＣｌ ０．５，ＭｇＳ０４?７Ｈ２０ ０．１，胶体壳聚糖１．０，琼 脂２．０，５００ｍＬ三角瓶中加蒸馏水２００ｍ＿Ｌ，调ｐＨ至６．０。１．３．２斜面种子培养基同１－３．１。１．３．３液体种子培养基（％，ｗ／ｖ） 蛋白胨０．５，ＫＥＨＰ０４０．０７，ＫＨ２Ｐ０４０．０３，葡萄糖０．１，酵母粉０．３，ＮａＣｌ０．５，ＭｇＳ０４?７Ｈ２０ ０．０５，粉末壳聚糖１．０，２５０ｍＬ三角瓶中加蒸馏水５０ｍＬ，ｐＨ值为６．３。 １．３．４发酵基础培养基（％，ｗ／ｖ）（Ⅻ４）２９０４１．０，Ｋ２Ｈ］１０４０．０７，Ｋ｝－１２Ｐ０４０．０３，ＮａＣｌ６．３。Ｏ．５，ＭｇＳ０４?７１－１２０ Ｏ．０５，葡萄糖Ｏ．１，酵母粉Ｏ．３，粉末壳聚糖１．０，２５０ｍＬ三角瓶中加蒸馏水５０ｍＬ，ｐＨ值为１．４设备ＨＺＱ—Ｆ全温振荡培养箱，哈尔滨东联电子技术开发有限公司制造。ＧＮＰ．９０８０型隔水式恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司。 ＧＬ．２０全自动高速冷冻离心机，中国湘西仪器仪表总厂仪器厂制造。ＴＵ．１８００紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限公司。ＴｎｅｒｍｏＯｒｉｏｎ型ｐＨ测试仪ＤＫ．￥２４型电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司。 电子天平，梅特勒一托利多仪器（上海）有限公司。 超净工作台，苏净集团安泰公司制造。２实验方法２．１菌种复壮 将Ｐ００３接入液体种子培养基中，３０。Ｃ，１５００ｍ摇床培养２４ｈ，取培养液以无菌生理盐水进行系列稀释后涂布到壳聚糖平板培养基上，３０。Ｃ培养３—４天，挑取透明圈较大的菌落转接到斜面培养基上保存。将新鲜斜面种子挑取一环接入种子培养兰圭窭堕堕堕壁塑垄壁墨堡垡些：查壁塑堕堕坌塞堑些墨堕兰堡垦堡窒一基中，３０＂Ｃ，１５０ｒｐｍ摇床培养２４ｈ（菌体密度约为３．０×１０１３ｃｆｕ／ｍＬ）后以２％（ｖ／ｖ）的接种量接入到发酵培养基中，３０＂Ｃ，１５０呻摇床培养７２ｈ，发酵液经５０００ｒｐｍ离，心１０ｍｉｎ，取上清液测酶活。２．２壳聚糖酶活力的测定２．２．１ＤＮＳ标准曲线的制作精确称取１００℃干燥至恒重的氨基葡萄糖盐酸盐０．１２９９，加蒸馏水溶解并定容 到５０ｍｌ，配成１２ｕｍｏＶｍＬ浓度的标准溶液。按表２．１在各２５ｍＬ比色管中加入溶液，沸水浴显色５ｍｉｎ，冷却后加蒸馏水定容到２５ｍＬ，于５２０ｒｉｍ下测ＯＤ值。表２．１氨基葡萄糖盐酸盐标准曲线制作方法（单位：ｍＬ）Ｔａｂｌｅ ２．１ ｓｔａｎｄａｒｄ Ｃｌｌｌ－ＶｅｏｆＧＩｕＮＨ２‘ＨＣＩ（ＤＮＳ）２ ０．４ １．６ １．５ ３ ０．８ １．２ １．５ ０．４３８ ４ １．２ ０．８ １．５ Ｏ．６９ ５ １．６ ０．４ １．５ ０．９７试管编号０ 标准溶液０ 蒸馏水ＤＮＳ试剂０Ｄ５２０ ２．０ １．５Ｉ ０．２ １．８ １．５ ０．０４２对照０．１８１以０Ｄ５２０值为横坐标，氨基葡萄糖盐酸盐的微摩尔数为纵坐标，绘制标准曲线，结果见图２．１。筋加坫 ｍ５０＾＇【ｏ星ｕ哪姐捌链捌舞龋掘郴艟００．２０．４０．６０．８１ｏＤ值图２．１氨基葡萄糖盐酸盐标准曲线（ＤＮＳ法）Ｆｉｇ ２．１ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｏｆＧｌｕＮＨ２‘ＨＣＩ（ＤＮＳ）１８产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究２．２．２壳聚糖酶活力测定 参照文献（Ｉｍｏｔｏ＆Ｙａｇｉｓｈｉｔａ，１９７１）的方法并作适当的改进。发酵液于４＂Ｃ下 ５０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ得到发酵上清液。取０．１ｍＬ酶液（必要时作适当倍数的稀释） 加入０．９ｍＬ浓度为１％的壳聚糖溶液和ＩｍＬｐＨ５．６的醋酸缓冲液，５０。Ｃ保温１５ｒａｉｎ，加入１．５ｍＬＤＮＳ终止反应，沸水浴显色５ｍｉｎ，冷却后定容到２５ｍＬ，６０００ｒｐｍ离心１０ｒａｉｎ，取上清液测５２０ｎｍ处ＯＤ值，煮沸灭活的酶液同法处理作为对照，根 据标准曲线求出反应液中的还原糖含量。 酶活力单位（ｕ）定义为上述条件下，每毫升发酵液每分钟下释放生成的微摩尔还原糖数。２．３菌体的生长曲线的测定从新鲜斜面种子挑取一环菌体接入液体种子培养基中，３０＂Ｃ，１５０ｒｐｍ摇床培养，每隔４ｈ取培养液测定５８０ｒｉｍ处ＯＤ值，２４小时以后每隔８ｈ测一次，绘制菌株Ｐ００３生长曲线。２．４发酵培养条件研究２．４．１菌株培养从新鲜斜面挑取一环菌体，接入液体种子培养基中，根据菌体生长曲线测定结果，３０。Ｃ，１５０ｒｐｍ下摇床培养１６ｈ（菌体密度约为２．３ Ｘ １０１３ｃｆｕ／ｍＬ），再以４％的体积比接入发酵培养基中，３０＊（２，１５０ｒｐｍ下摇床培养７２ｈ。２．４．２最适氮源的筛选 在发酵基础培养基中，分别以０．５％硝酸钾，Ｏ．５％牛肉膏，Ｏ．５％蛋白胨，０．５％硫酸铵，１．０％硫酸铵，０．５％硝酸铵，１．０％硝酸铵为氮源，代替１．Ｏ％硫酸铵，按照 ２．４．１所述方法进行发酵培养，测定发酵上清液的酶活力，研究不同氮源对菌株产酶的影响。 ２．４．３最适碳源的筛选在最适氮源条件下，分别以１．０％胶体壳聚糖，１．Ｏ％羧甲基壳聚糖，１．０％粉末 几丁质，１．Ｏ％可溶性淀粉，１．Ｏ％粉末壳聚糖，１．Ｏ％粉末壳聚糖＋ｏ．１％葡萄糖，１．０％ 葡萄糖，１．０％羧甲基纤维素纳作为碳源，按照２．４．１所述方法进行发酵培养，测定 发酵液的酶活力，研究不同碳源对菌株产酶的影响。产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究２．４．４培养基起始ｐＨ值对产酶的影响在上述优化条件下，将培养基起始ｐＨ值分别调至３．０，４．０，４．５，５．０，５．５，６．０，７．０，８．０，按照２．４．１所述方法进行发酵培养，测定发酵液的酶活力，试验不同口Ｈ值对菌株产酶的影响。２．４．５培养温度对产酶的影响在上述优化条件下，分别选择２６＂Ｃ，２８。Ｃ，３０。Ｃ，３２。Ｃ，３４＂Ｃ，３７＂Ｃ为培养 温度进行实验，研究培养温度对产酶的影响。 ２．４．６最适接种量实验 在优化条件下，分别以０．２％，Ｏ．５％，１．０％，２．Ｏ％，４．Ｏ％，６．Ｏ％的体积比为不 同接种量（种子液菌体密度约为２．３×１０１３ｃｆｕ／ｍＬ），进行实验，研究其对产酶的影响。２．４．７最适装液量实验 在优化条件下，统一型号的５００ｍＬ锥形瓶分别以５０ｍＬ，１００ｍＬ，１５０ｍＬ， ２００ｍＬ，２５０ｍＬ的装液量进行实验，研究装液量对菌株产酶的影响。 ２．４．８最适碳氮比研究 将培养基中硫酸铵的浓度分别设为０．５％，１．Ｏ％，１．５％，２．Ｏ％，２．５％，３．０％， 试验不同碳氮比对菌株产酶的影响。 ２．４．９壳聚糖的脱乙酰度对产酶的影响 用本实验室制备的脱乙酰度分别为５５％，６５％，７５％，８０％，９５％的粉末壳聚 糖，代替发酵基础培养基中９０％脱乙酰度的壳聚糖进行实验，研究壳聚糖脱乙酰 度对产酶的影响。２．４．１０最适发酵时间实验分别以２４ｈ，４８ｈ，７２ｈ，９６ｈ，１２０ｈ，１４４ｈ，１６８ｈ，２１６ｈ，２６４ｈ为菌株发酵培 养时间，进行实验，研究培养时间对产酶的影响。３实验结果３．１菌株Ｐ００３的性状如图２．２。菌株Ｐ００３在以壳聚糖为唯一碳源的平板上培养时，菌落周围产生明 显的水解透明圈，并且水解圈直径和菌落直径的比值（Ｄ／ｄ）较大。该菌株菌落呈２０产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究鲜黄色，表面湿润，圆形，边缘整齐，易挑取。将Ｐ００３接入发酵培养基中，３０。Ｃ， １５０ｒｐｍ摇床培养７２ｈ，测得发酵液中的酶活力为３．３Ｕ／ｍＬ。３．２菌株的生长曲线结果见图２．３，菌株在第８ｈ时开始迅速生长，菌体密度以对数形式增加，到 第３０ｈ左右进入稳定期，之后菌体密度不再随培养时间的延长而明显增加。因此 选择１６ｈ作为菌株种子液的培养时间。０?４０．３罾０．２ 。０?１０ ０ １２ ２４ ３６４８６０７２８４培养时间（ｈ）图２．２菌株Ｐ００３Ｆｉｇ ２．２ ＳＵｍｎ Ｐ００３图２．３Ｐ００３的生长曲线Ｆｉｇ ２．３ Ｔｉｍｅｃｏｕｒｓｅｏｆｇｒｏｗｔｈ ｏｆＰ００３ ｓｔｒａｉｎ３．３培养条件的优化３．３．１最适氮源实验结果如图２．４，不同氮源对菌株产酶的影响不同，铵盐作为氮源时发酵液酶活 力较高，其中１．０％（ＹＨ４）２Ｓ０４作为氮源时，产酶效果最好，发酵液的酶活力为３．４Ｕ／ｍＬ，（ＮＨ４）２Ｓ０４浓度为Ｏ．５％时效果次之。３．３．２最适碳源实验实验结果如图２．５，以胶体壳聚糖作为碳源时，发酵液酶活力为２３．２Ｕ／ｍＬ，显著高于其它各组；１％粉末状壳聚糖＋Ｏ．１％葡萄糖作为复合碳源效果次之，为４．６７Ｕ／ｍＬ。单纯以葡萄糖作为碳源则发酵液中检测不到酶活力，说明该酶是一种诱导酶。 ３．３．３培养基最适起始ｐＨ值实验实验结果如图２．６，当培养基起始ｐＨ值为５．０时，该菌株发酵液酶活力最高，２ｌ产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究为３６．８Ｕ／ｍＬ。随着ｐＨ升高，酶活力迅速下降，ｐＨ６．０以上，下降的趋势有所平缓。 而当口Ｈ值在４．０以下时，发酵液中几乎检测不到酶活力。 ３．３．４最适培养温度实验 结果如图２．７，该菌株在３２。Ｃ培养时，发酵液酶活力最高，为３９．３Ｕ／ｍＬ，３０。Ｃ培养时产酶效果次之。温度低于３０＂Ｃ或高于３２＂Ｃ时，发酵液的酶活力显著下降。 ３．３．５最适接种量实验实验结果如图２．８，当接种量在２％（菌体密度约为２．３Ｘ １０１３ｃ６】／ｍＩ．）以上时，发 酵液酶活力最高，为３７．６Ｕ／ｍＬ，继续增加接种量发酵液的酶活力不再增加。３．３．６最适装液量实验实验结果如图２．９，可见，当５００ｍＬ锥形瓶中装有１５０ｍＬ发酵液时发酵液的 酶活力最高，为５１．１Ｕ／ｍＬ。 ３．３．７壳聚糖脱乙酰度对发酵酶活力的影响 实验结果如图２．１０，壳聚糖脱乙酰度越高，越有利于该菌株产酶，壳聚糖脱 乙酰度为９５％时，发酵液酶活力最高。 ３．３．８最适碳氯比研究 试验结果如图２．１ｌ，硫酸铵浓度低于１．５％时，发酵液酶活力随硫酸铵浓度的 增加迅速升高，当硫酸铵浓度在１．５％以上时，酶活力的上升趋势变得平缓，当硫 酸铵浓度达到２．Ｏ％，发酵液的酶活力最高，继续增加硫酸铵浓度酶活力无明显上升。３．３．９最适发酵时间实验 实验结果如图２．１２，当对菌株的发酵培养时间为１２０ｈ时发酵液的酶活力最高， 之后进入平台期，发酵液酶活力不再上升。，兰塞墨望堕堕堡竺垄壁墨壁垡些：塞壁堡堕竺坌曼丝些皇堕兰竺垦堕窒４３ ５ ３ ２ ５ ２收蜒髓Ｒ烬溢１５ ｌ０ ５ ＯＱＱ?Ｑ?Ｑ?、?Ｑ?、氨源碳源图２．４最适氮源研究Ｆｉｇ ２．４ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎｏｕｓＳＯＵｒＣｅｓ ｏｎ图２．５最适碳源研究Ｆｉｇ ２．５ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｖａｒｉｏｕｓ ｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｓ ｏｎｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ冒ｅ Ｒ 蜒 韪—１田／ｎ『）Ｒ蜒鞋蚰弘如拈蚰¨ｍ０ ０ ３４蝎蚰踮∞拈加坫ｍ０ ｏ５６７８９２４２６２８３０３２３４３６３８ｐＨ值温度（℃）图２．６最适ｐＨ值的研究Ｆｉ９２．６ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｏｆｍｅｄｉｕｍ ｏｎ ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ图２．７最适温度研究Ｆｉ酩．７ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆｃｕｌｔｕｒｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ６０ ５０童４０昙３０嚣２０—１Ⅲ／ｎ—Ｒ蜉蹴ｌＯ蚰踮∞撕加坫如００ ０ ｌ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ０ ５０ １００ １５０ ２００ ２５０ ３００ Ｏ接种量（％）装瓶盈（ｍＬ）产壳聚耱酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究图２．８最适接种量的研究Ｆｉ９２．８ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｏｎ图２．９最适装液量研究Ｆｉｇ ６ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆｌｉｑｕｉｄ ｖｏｌｕｍｅｓ ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｎＣｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ∞∞舳 ∞蚰∞０５５％６０％６５％７０％７５％８０％８５％９０％９５％００?５Ｉ１．５２２?Ｓ３３?５脱乙酰度硫酸铵浓度（％）图２．１０壳聚糖脱乙酰度对菌株产酶的影响 Ｆｉ醇．１０ ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＤＤ ｏｆｃｈｉｔｏｓａｎｏｎ图２．１１最适碳氮比研究Ｆｉｇ ２．１１ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆｃｏｎｓａｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆｏｎｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（ＮＨ）２Ｓ０４ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ发酵时间（ｈ）图２．１２培养时间对产酶的影响 Ｆｉ９２．１２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅｏｎｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ４讨论４．１壳聚糖酶来源的选择由于壳聚糖酶在自然界中主要存在于真菌、细菌、放线菌等微生物中，且微 生物繁殖速度快，生产周期短，产量高，成本相对较低，又不受自然条件的限制， 能够进行大规模生产，是非常重要的酶源。故在寻求壳聚糖酶的来源时，我们选 择从微生物中开发壳聚糖酶。产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚耱酶的分离纯化与酶学性质研究菌株的筛选采用以壳聚糖作为唯一碳源的平板培养基进行，目的是限制绝大 多数不能利用壳聚糖的微生物生长，而能够产生壳聚糖酶、利用壳聚糖的微生物则能在其上生长，并且能够在菌落周围形成明显的水解透明圈。通过该法，本实 验室从自然界中筛选得到了产壳聚糖酶能力较强的菌株Ｐ００３，作者对该菌株的复壮同样采用了该方法。由于条件所限，本研究未对Ｐ００３进行菌种鉴定，其具体分类尚需相关的试验加以确定。４．２Ｐ００３发酵条件优化微生物产生的壳聚糖酶有组成型和诱导型之分，其中多数为诱导型（ＲｉｖａｓＬＡｅｔａ１．，２０００；Ｓｈｉｍｏｓａｋａ Ｍｅｔａ１．，２０００）。本研究中通过不同诱导物对菌株Ｐ００３产生壳聚糖酶能力的实验表明该菌株产生的壳聚糖酶也是典型的诱导酶，只有以壳聚糖 或其结构类似物作为碳源时才能诱导产酶，单以蔗糖或葡萄糖作为碳源，菌株虽 能生长良好却不能产酶，这与国内外的报道基本一致（Ｓｏｍａｓｈｅｋａｒ＆Ｊｏｓｅｐｈ，１９９６； 逢玉娟等，２００５）。当以１．０％粉末状壳聚糖＋Ｏ．１％葡萄糖为复合碳源时，产酶效果 优于仅添加壳聚糖，分析原因可能是在培养基中添加适量葡萄糖可以在发酵初期 使菌体较快进入对数生长期，从而更利于产酶。虽然胶体壳聚糖作为碳源时产酶 效果最好，但考虑到胶体壳聚糖的制作成本，故选用１．０％粉末状壳聚糖＋０．１％葡 萄糖作为发酵碳源。不同氮源对产酶的影响在不同菌种间有较大的差异性。如葛正红等（葛正红 等，２００２）报道青霉菌（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）的最适产酶培养基中添加氮源为尿素与蛋白胨，方祥年等（方祥年等，２００１）报道球孢白僵菌（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ）的最 适产酶培养基中氮源为蛋白胨，李风平等（李风平等，２００３）报道腐皮镰孢菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉ）的产酶培养基中最适氮源为蛋白胨与干酪素，王钦宏（王钦宏等，２０００）等报道假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）的培养基中添加ＮＨ４Ｎ０３最有利于产酶。本研究中最有利于菌株Ｐ００３产酶的氮源为（ＮＨ４）２Ｓ０４。 研究中发现诱导物壳聚糖的脱乙酰度对产酶的影响较为明显，壳聚糖脱乙酰 度越高越有利于产酶，分析其原因可能与该菌株所产的壳聚糖酶酶切位点有关， 具体机理尚需更深入的研究。ｐＨ值对该菌株酶活力影响很大，最适产酶ｐＨ值为 ５，当低于或高于这一ｐＨ值，发酵液中的酶活力迅速下降。 由于条件的限制，在对菌株Ｐ００３进行产酶条件的优化时，采用了较为传统的产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究单因子实验法，该方法虽然不能反映各种产酶因素的协同作用，但结果易于分析。 对菌株Ｐ００３发酵产酶培养条件的优化效果十分显著，发酵液酶活力由３．３Ｕ／ｍＬ提 高到１０８Ｕ／ｍＬ，是目前所见报道中最高的发酵液壳聚糖酶活力，在酶法降解壳聚 糖制备壳寡糖的研究工作，以及壳寡糖的规模化生产中有很高的应用前景。４．３壳聚糖酶活力的测定酶活力的测定一般是在单位时间内，使一定量的酶和底物发生反应，通过检 测反应体系中底物的减少量或产物的增加量来表示酶促反应速度的快慢。在本研 究中我们采用了３，５．二硝基水杨酸（ＤＮＳ）法测定壳聚糖酶活力，反应原理是３， ５．二硝基水杨酸在碱性条件下与还原糖共沸，被还原成红褐色的３一氨基－５－硝基水杨 酸，单位时间内，壳聚糖酶与底物壳聚糖于一定温度和一定ｐＨ的环境下进行反应， 通过测定反应体系中新产生的还原糖量的多少来确定壳聚糖酶活力的大小。该法 操作简单、对还原糖的种类没有选择性、结果也较为精确（张惟杰，１９９４）。 关于用ＤＮＳ法测定壳聚糖酶活力，文献中提供的方法可以分为两类：一类以 胶体壳聚糖作为酶促反应的底物，通过加热终止反应，然后离心取上清液测还原 糖含量；另一类以壳聚糖的醋酸溶液作为底物，加热终止反应并通过调节ｐｎ使未 反应的底物析出，然后离心取上清液测还原糖含量。考虑到胶体壳聚糖制作繁琐 且成本较高，不同制作批次又很难得到完全一致的胶体壳聚糖作为反应底物，故 在本研究中选择１％的壳聚糖的醋酸溶液作为底物。又考虑到ＤＮＳ试剂呈碱性，所 以在反应１５分钟后直接加入ＤＮＳ试剂即可使壳聚糖底物析出，酶促反应随之终止， 沸水浴５ｍｉｎ显色后离心，再取上清液比色测定反应体系中还原糖的增加，从而换 算出壳聚糖酶活力。该法省去了加热终止反应并通过调节ｐＨ使未反应的底物析出 的步骤，使壳聚糖酶活性的测定方法变得相对简便、快捷，且结果可靠，方便了 研究工作的进行。 为保证酶活力测定的准确性，应使反应体系中底物过量，当发酵液酶活力较 高时，将发酵上清液进行适当倍数的稀释后再进行测定。４．４ｐ００３的产酶能力从已报道微生物的产酶能力来看，一般微生物所产壳聚糖酶酶活力普遍不高，发酵液中酶活力大多只有几个单位，如吴潇韫（吴潇韫，２００２）曾报道其筛选到产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究的一株高产壳聚糖酶菌株的发酵液壳聚糖酶活力为２．８Ｕ／ｍＬ：陈小娥等（陈小娥， ２００４）采用紫外诱变和６０Ｃｏ诱变处理获得一株壳聚糖酶高产菌株ＣＪ２２．３２６，产酶 活力为３．０６Ｕ／ｍＬ；而发酵液酶活力在十个单位以上的鲜见报道，如逢玉娟等（逢 玉娟等，２００５）筛选到的菌株经过培养条件优化后，发酵液酶活力由３．９４Ｕ／ｍＬ提 高到１７．０４Ｕ／ｍＬ，是当时已报道的最高的发酵液壳聚糖酶活力。目前报导产酶活力最高的Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｎ １７４的基因工程菌所产发酵液粗酶活为３６．８Ｕ／ｍＬ。作者对从土壤中筛选到的一株壳聚糖酶高产菌株经培养条件优化后，发酵液 酶活力达到了１０８Ｕ／ｍＬ，为酶法降解壳聚糖制备壳寡糖提供了一个具有工业化潜在应用价值的新酶源。产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚耱酶的分离纯化与酶学性质研究第三章壳聚糖酶的分离纯化与性质研究本章在最适产酶条件下对菌株Ｐ００３进行发酵培养，采用硫酸铵盐析、透析和 冷冻干燥，从发酵上清液中获得了壳聚糖酶粗品，再经过离子交换层析和凝胶过 滤层析对酶进行纯化，得到电泳纯的壳聚糖酶，并考察了该酶的部分酶学性质， 对影响酶活性的各种因素进行研究，以期为酶法降解壳聚糖制备壳寡糖的研究提 供实验依据。１实验材料、试剂与仪器１．１菌种经过复壮的菌株Ｐ００３１．２培养基（％，ｗ／ｖ）１．２．１种子培养基（％。ｗ／ｖ）蛋白胨Ｏ．５，ＫｚＨＰ０４０．０７，ＫＨ２Ｐ０４０．０３，葡萄糖０．１，酵母粉０．３，ＮａＣｌ０．５，ＭｇＳ０４’７Ｈ２０ ０．０５，粉末壳聚糖１．０，２５０ｍＬ三角瓶中加蒸馏水５０ｍＬ，ｐＨ值为６．３。１．２．２发酵培养基（％．ｗ／ｖ） （ＮＨ４）２８０４２．０，Ｋ２ＨＰ０４０．０７，ＫＨ２Ｐ０４０．０３，ＮａＣｌ ０．５，ＭｇＳ０４?７１－１２０ ０．０５，葡萄糖Ｏ．１，酵母粉０．３，粉末壳聚糖１．０，加蒸馏水１５００ｍＬ，调ｐＨ值至５．０。１．３试剂１．３．１离子交换层析试剂平衡液：０．０２ｍｏｌ／Ｌ的Ｎａ２ＨＰ０４－Ｎａ［－１２Ｐ０４溶液，ｐＨ６．０。 梯度洗脱液：０－１．０ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ溶液（含０．０２Ｎ，ｐＨ６．Ｏ的Ｎａ２ＨＰ０４－ＮａＨ２Ｐ０４ 溶液）。 １．３．２凝胶过滤层析试剂产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究洗脱液：Ｏ．０２ｍｏｌ／Ｌ的Ｎａ２ＨＰ０４－ＮａＨ２Ｐ０４溶液，ｖｒｔ７．０。１．３．３电泳试剂凝胶贮存液：丙烯酰胺：双丙烯酰胺＝２９：ｌ。 分离胶缓冲液：１．５ｍｏｌ／Ｌ的＂Ｉｒｉｓ－ＨＣＩ缓冲液，ｐＨ８．８。 浓缩胶缓冲液：１．０ｍｏｌ／Ｌ的Ｔｒｉｓ－ＨＣＩ缓冲液，ｐＨ６．８。 电极缓冲液：３９Ｔｆｉｓ，１４．４９甘氨酸，ｌｇＳＤＳ，加蒸馏水定容到１Ｌ，ｐＨ８．３。 样品缓冲液：０．６ｍＬ浓缩胶缓冲液，２ｍＬｌ０％ＳＤＳ，２．５ｍＬ甘油，Ｏ．５ｍＬｌ３．巯基乙醇，ｌｍＬ １％的溴酚蓝，０．９ｍＬ蒸馏水。 过硫酸铵：浓度１０％。分离胶：凝胶存贮液１．３５ｍＬ，分离胶缓冲液１．２５ｍＬ，蒸馏水２．４ｍＬ，１０％过硫酸铵２５９Ｌ，ＴＥＭＥＤ２．５此。浓缩胶：凝胶存贮液０．３３５，缓冲液１．２５ｍＬ，蒸馏水１．１５ｍＬ，１０％过硫酸铵１５１ｘＬ，ＴＥＭＥＤ２．５乩。染色液：０．２５９考马斯亮蓝Ｒ－２５０溶于含有４５％甲醇、１０％冰醋酸的水溶液中，定容到１００ｍＬ。 脱色液：含有１０％甲醇、１０％冰醋酸的水溶液。 标准蛋白（Ｍａｒｋｅｒ）：ＭＢＰ－［３－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（１７５ ｋＤａ）；ＭＢＰ－ｐａｍｍｙｏｓｉｎ（８３ｋＤａ）：ＭＢＰ－ＣＢＤ（６２ ｋＤａ）：Ａｌｄｏｌａｓｅ（４７．５ ｋＤａ）；Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ（３２．５ ｋＤａ）；肛Ｌａｅｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ａ（２５ ｋＤａ）；Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（１６．５ ｋＤａ）；Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ（６．５ ｋＤａ）。１．３．４其它试剂粉末壳聚糖：脱乙酰度９０％，青岛海汇生物工程公司；Ｑ—ＳｅｐｈａｒｏｓｅＳｅｐｈａｄｅｘ ＦａｓｔＦｌｏｗ：Ａｍｅｒｓｈａｍ公司：Ｇ一７５：Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司；考马斯亮蓝Ｒ－２５０：ｓｉｇｍａ公司； 蛋白电泳成套试剂：上海生物工程公司： 其余试剂均为国产分析纯。１．４仪器设备产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究超净工作台，苏净集团安泰公司制造。ＨＺＱ—Ｆ全温振荡培养箱，哈尔滨东联电子技术开发有限公司制造。 ＧＬ．２０全自动高速冷冻离心机，中国湘西仪器仪表总厂仪器厂制造。 ＴＵ．１８００紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限公司。 ＤＫ．￥２４型电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司。 电子天平，梅特勒一托利多仪器（上海）有限公司。 ９１．１磁力搅拌器，上海安亭电子仪器厂。 ＦＤ．１Ｄ冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司Ｔｈｅｒｍｏ Ｏｒｉｏｎ ８１８型ｐＨ测试仪。透析袋（截留分子量＞８０００Ｄａ），华美生物工程公司 离子交换层析柱：直径２．２ｃｍ，长２０ｃｍ，上海华美生物公司 凝胶过滤层析柱：直径１．６ｃｍ，长８０ｅｒａ，上海华美生物公司ＴＨ．３００梯度洗脱仪，上海沪西分析仪器厂ＤＨＬ－Ａ电脑恒流泵，上海康华生化仪器制造厂 ＨＤ．２１Ｃ．Ｂ型核酸蛋白检测仪，上海康华生化仪器制造厂 ＬＭｌ７－１Ａ台式纪录仪，上海康华生化仪器制造厂 ＤＢＳ一１００电脑全自动部分收集器，上海康华生化仪器制造厂ＤＹＹ－６Ｃ型电泳仪，北京六一仪器厂２实验方法２．１壳聚糖酶粗品的制备２．１．１Ｐ００３菌株发酵培养液的制备在１０个５００ｍＬ三角瓶中，各装入１５０ｍＬ优化后的发酵培养基，按２％接种量 将Ｐ００３的种子菌液（菌体密度约为２．３Ｘ １０１３ｃｆｕ／ｍＬ）接入发酵培养基中，３２＇（２，１５０ｒｐｍ摇床培养９６ｈ，于４＂Ｃ下５０００ｒｐｍ离心３０ｍｉｎ去除菌体，得到离心发酵上 清液，并测定上清液中的酶活力。 ２．１．２硫酸铵分级盐析曲线的测定 在９个２５０ｍＬ三角瓶中各装入１００ｍＬ离心上清液，在冰浴中边搅拌边加入硫３０产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究酸铵粉末，９个三角瓶中分别加入硫酸铵至１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、 ７０％、８０％和９０％饱和度。盐析后４＂Ｃ静置过夜，６０００ｒ／ｍｉｎ冷冻离心２０分钟，取 上清液分别测定其中剩余的酶活力，以确定壳聚糖酶盐析所需要的硫酸铵的饱和 度。２．１．３壳聚糖酶粗品的制备向菌株Ｐ００３发酵上清液中加入硫酸铵至７０％饱和度，４＂Ｃ静置ｌＯｈ后，６０００ｒｐｍ 冷冻离心收集沉淀并用少量冷却的蒸馏水溶解，置于透析袋中用蒸馏水４＂Ｃ透析脱 盐，再经冷冻干燥即得絮状的壳聚糖酶粗品。２．２壳聚糖酶的纯化２．２．１ Ｏ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆ Ｉ ＯＷ阴离子交换层析用３倍体积的上样缓冲液平衡Ｑ．Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ层析柱，流速Ｏ．５ ｍＬ／ｍｉｎ，然后取粗酶粉Ｏ．１克溶于４ｍＬ上样缓冲液，上样，洗涤２．３个柱体积。待记录仪 跑至基线后，改用Ｏ．１．ＯＮ，ｐＨ６．０，ＮａＣＩ的Ｎａ２ＨＰ０４．ＮａＨ２Ｐ０４溶液梯度洗脱，总 体积４００ｍＬ。紫外检测器检测灵敏度０．１Ａ，记录仪灵敏度２０ｍＡ，纸速０．５ｒｎｍ／ｍｉｎ， 收集器２０ｍｉｎ／管。层析结束后对分离出的各蛋白峰进行壳聚糖酶活力检测，收集有酶活力的部分。２ ２．２ ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５凝胶过滤层析Ｆａｓｔ用上样缓冲液平衡Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ一７５层析柱４个柱体积。将Ｑ—ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦｌｏｗ纯化后的酶液对凝胶过滤层析上样缓冲液透析，再用ＰＥＧ２００００透析浓缩，取２ｍＬ浓缩后的酶液上样，流速Ｏ．２ｍＬ／ｍｉｎ，紫外检测仪灵敏度０．１Ａ，纸速 ０．５ｍｍ／ｍｉｎ，记录仪灵敏度２０ｍＡ，收集器２０ｍｉｎ／管。层析后收集有酶活力的部分。２．３壳聚糖酶活力测定方法见第二章中的测定方法。酶学性质的研究中使用相对酶活力来表示各因素对壳聚糖酶活力的影响，使 实验结果更为直观。相对酶活力（％）是指某一酶活力影响因素下，各个水平发酵液的酶活力与最高酶活力的比值。２．４蛋白质浓度的测定产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚耱酶的分离纯化与酶学性质研究采用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法。 ２．４．１考马斯亮蓝试剂 考马斯亮蓝Ｇ．２５０ １００ｒａｇ溶于５０ｍＬ９５％７，醇中，加入１００ｍＬ８５％磷酸，用蒸馏水稀释至１０００ｍＬ，抽滤除去不溶颗粒。最终试剂中含Ｏ．０１％（ｗ／ｖ）考马斯亮蓝Ｇ．２５０，４．７％（刊Ⅵ乙醇，８．５％（ｗ／ｖ）磷酸。 ２．４．２标准蛋白质溶液以牛血清白蛋白（ＢＳＡ）作为标准蛋白质，根据其纯度配制成Ｏ．Ｉｍｇ／ｍＬ的蛋 白质溶液。２．４．３标准曲线的制作按表３．１在各试管中加入溶液，充分混匀后，于５９５ｎｍ处测吸光值。表３．１蛋白质标准曲线的制作Ｔａｂｌｅ３．１ Ｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｏｆｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ以ＯＤ５９５为横坐标，标准蛋白质含量为纵坐标绘制标准曲线（图３．１）。１００ ８０嗣 缸 血 咖６０ ４０ ２０ ０ ０ Ｏ．２ Ｏ．４ Ｏ．６ ０．８０Ｄ５９５图３．１蛋白质含量标准曲线Ｆｉｇ ３．１ ＳｔａｎｄａｒｄＣＵｌ＇Ｖｅｏｆｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ３２产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究２．４．４样品测定取适当稀释的样品蛋白质溶液ｌｍＬ，加入考马斯亮蓝试剂５ｍＬ，摇匀后测定 其ＯＤ５９５值，然后根据标准曲线求出样品溶液的蛋白质浓度。２．５蛋白质纯度鉴定及分子量测定采用ＳＤＳ一聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ．ＰＡＧＥ）鉴定纯化后的壳聚糖酶纯度并测定其分子量。ＳＤＳ一聚丙烯酰胺凝胶采用上海生物生物工程公司的４０％浓度的凝胶存贮液配 制，浓缩胶浓度为５％，分离胶浓度为１ ０％，电极缓冲液为ｐｒ：８．３的Ｔｒｉｓ．甘氨酸缓 冲液。样品与样品缓冲液４：１体积混合后沸水浴加热３分钟，１００００ｒｐｍ离心１分 钟，上样量２０“Ｌ／孔，以标准蛋白作为对照。电泳结束后用考马斯亮蓝Ｒ－２５０染色２０ｍｉｎ显示电泳条带。根据电泳结果判断酶的纯度并对照已知分子量的标准蛋白得 出壳聚糖酶的分子量。２．６壳聚糖酶酶学性质的研究２．６１温度对酶活性的影响２．６．１．１最适反应温度的测定 将酶促反应体系的温度分别设定为３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃和７０℃，测定壳聚糖酶的酶活力，以确定该壳聚糖酶的最适反应温度。２．６．１．２温度对壳聚糖酶稳定性的影响 将壳聚糖酶酶液分别置于３０℃、４０℃、４５℃、５０℃和６０℃，保温１０ｍｉｎ、２０ｍｉｎ、４０ｍｉｎ、８０ｒａｉｎ和１２０ｍｉｎ，然后测定剩余酶活力，试验温度对酶稳定性的影响。２．６．２ｐＨ对酶活性的影响２．６．２．１最适反应ｐＨ值的测定用ｐＨ值分别为４．０、４．４、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０和６．２的醋酸缓 冲液和壳聚糖底物溶液，代替酶活力测定中的ｐＨ５．６的醋酸缓冲液和壳聚糖底物 溶液，测定壳聚糖酶的酶活力，以确定该壳聚糖酶的最适反应ｐＨ值。２．６．２．２ｐＨ值对壳聚糖酶稳定性的影响将壳聚糖酶液与ｐＨ值分别为３、４、５—１２的缓冲液（柠檬酸一ＮａｏＨ缓冲体 系），以１：９的体积比混合，置于４。Ｃ保存５ｈ，然后测定剩余酶活力，试验ｐＨ值产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究对酶稳定性的影响。２．６．３金属离子对酶活性的影响配制不同浓度的Ａ矿、Ｋ＋、ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍ矿、Ｈ矿＋、ｃｕ２＋、ｚｎ２＋、Ｂａ２＋、Ｐｂ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃ，和Ｆｅ３＋溶液，使酶反应体系０．２ｍｏＬ／ＬｐＨ５．６的醋酸．醋酸钠缓冲液中各种金属离子的终浓度分别为０．ｉｍｍｏＬ／Ｌ，１ｍｍｏＬ／Ｌ和５ｍｍｏＬ／Ｌ。以不加金属离子 的缓冲液作为对照，按照酶活力测定方法测定酶活力，研究不同金属离子对酶活性的影响。 ２．６．４几种小分子有机物对酶活性的影响在ｐＨ５．６的醋酸．醋酸钠缓冲液中加入ＥＤＴＡ、ＳＤＳ、Ｂ．巯基乙醇和氨基葡萄糖 盐酸盐，使其终浓度为５ ｍｍｏＬ／Ｌ。以缓冲液中不加上述物质为对照，测定壳聚糖 酶活力，研究其对壳聚糖酶活性的影响。 ２．６．５底物脱乙酰度对酶活性的影响 分别以脱乙酰度为７２％、７６％、８０％和９０％的壳聚糖作为酶解底物，测定壳聚 糖酶的酶活力，研究底物脱乙酰度对壳聚糖酶活性的影响。２．６．６壳聚糖酶的底物专一性分别以浓度为１．Ｏ％的粉末壳聚糖醋酸溶液、胶体壳聚糖、羧甲基壳聚糖、胶 体几丁质及羧甲基纤维素作为底物，按照酶活力测定方法测定壳聚糖酶的酶活力， 研究该壳聚糖酶的底物专一性。２．６．７底物浓度对壳聚糖酶影晌向不同浓度的壳聚糖溶液中加入一定量的壳聚糖酶溶液（遵循底物过量原 则），使反应体系中底物的终浓度分别为０．２％、０．４％、０．６％、Ｏ．８％和１．０％，５０＂Ｃ， ｐＨ５．６反应１５ｍｉｎ后，测定还原糖浓度。３实验结果３．１壳聚糖酶粗品的制备通过测定不同饱和度硫酸铵对发酵上清液盐析，离心后上清液中剩余酶活力， 得到了硫酸铵分级盐析曲线。可见随着硫酸铵饱和度的增加，上清液中剩余的酶 活力明显降低，当硫酸铵饱和度达到７０％，上清液中已经检测不到酶活力，因此，产壳聚耱酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究选择７０％的硫酸铵饱和度进行盐析，盐析后收集沉淀，充分透析脱盐后经冷冻干 燥即可制得壳聚糖酶的粗酶粉，因为处于７０％．１００％饱和度区间的杂蛋白已被除 去，壳聚糖酶得到了初步的纯化，有利于酶的进一步的分离提纯。∞ 邑 Ｒ 魍 避 娱 藤 导 楚 钴 蜒 ∞ ∞ ∞ 如 ∞００％１０％２０％３０％４０％５０％６０％７０％８０％９０％１００ ％硫酸铵浓度图３．２（ＮＩ－ｈｈＳ０４分级盐析曲线 Ｆｉ醪．２ Ａｍｍｏｎｉｕｍｓｕｌｆａｔｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｃａｌｖｅ３．２壳聚糖酶的纯化３．２．１ Ｏ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆ Ｉ ｏｗ阴离子交换层析 Ｆａｓｔ对经过盐析，透析后的酶液进行Ｑ—ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦｌｏｗ阴离子交换层析，结果见图３．３。可见，上样后的洗涤过程中，一部分未与柱子结合的蛋白被洗脱下来 形成第一个蛋白峰。用０．１Ｎ，ｐＨ６．０，Ｎａ２ＨＰ０４－ＮａＨ２Ｐ０４洗脱，洗脱的蛋白峰中 只有一个有酶活力，将其收集。洗脱之后改用２Ｎ的ＮａＣｌ溶液继续洗脱，洗脱液中未检测到壳聚糖酶活力。兰塞墨塑堕堕堡塑垄壁墨生垡些：塞墨笙堕竺坌曼垫些皇堕兰竺星堡塞———一——（卜Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ洗脱曲线 ０?６ ０?５０一。ｏ∞Ｎ白ｏ㈣誉Ｏ．２∞∞∞们｛；；加＿２０ ０ ５ １０ １５ ２０ ２５ ３０ ３５ ４０ ４５ ５０ ５５Ｏ．１ ０收集管号图３．３ Ｑ．Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ阴离子交换层析Ｆｉ９３．３ Ｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅｏｎＱ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ｃｏｌｕｍｎ３．２．２ Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５凝胶过滤层析Ｇ．７５层析柱的结果见图３．４，两个蛋白峰中，第二个峰有酶活力，收集相对应的酶液，用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检验其纯度。ｓｅｐｈａｄｅｘ—Ｇ７５洗脱曲线４０ ３０ 。 １ ０．９ ０．８ ０．７碧２０。１０ ０—． 。．— ． — ． —．Ｌ０●■ ●●●●●● ●／ｍ５ｌＯ园１５ ２０ ２５Ｏｉｌ０．６呙８：ｉ荟０．３ ０．２ ０．１ ０３０收集管号图３．４ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５凝胶过滤层析 Ｆｉ够．４ Ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｏｆｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ＿７５ ｃｏｈｍｍ３．２．３壳聚糖酶纯化结果壳聚糖酶的主要纯化步骤见表３．２。最终壳聚糖酶的纯化倍数为１２．３７，酶收率为２７．６％。产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究３．３蛋白质纯度鉴定及分子量测定纯化后的酶液经ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳检测为一条带（如图３．５），说明Ｐ００３所产壳聚糖酶为单一酶组分，纯度达到电泳纯。样品蛋白质相对迁移距离与标准蛋白样品的相对迁移距离相对照，得出其相对分子质量约为３０．５ｋＤ。１．纯化后的酶液：２．标准蛋白样品图３．５壳聚糖酶电泳图Ｆｉｇ．３．５ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ３．４壳聚糖酶部分酶学性质的研究３．４．１温度对酶活性的影响 ３．４．１．１壳聚糖酶反应的最适温度从图３．６可以看出，当反应温度在４５ ４Ｃ以下时，壳聚糖酶活力随温度的升高产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究而提高，４５。Ｃ以上时酶活力开始下降，当反应温度高于５０。Ｃ，酶活力急剧降低。 该壳聚糖酶作用的最适作用温度为４５。Ｃ。∞ ∞ ∞ 如 加０ ２０ ３０ ４０ ５０ ６０ ７０ ８０温度图３．６温度对壳聚糖酶活性的影响Ｆｉｇ ３．６Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｅｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ３．４．１．２温度对壳聚糖酶稳定性的影响酶在３０。Ｃ、４０＊（２、４５。Ｃ、５０。Ｃ、６０℃下放置不同时间后测得的剩余酶活力如图３．７所示，４５＂Ｃ下随放置时间的延长，酶活力有一定的损失，９０ｍｉｎ后剩余酶活力为５０％，而３０＂Ｃ、４０。Ｃ下酶活力基本保持稳定，损失不大。∞ ∞ ∞ ∞ 如 加０ ０ ２０ ４０ ６０ ８０ １００ １２０ １４０保温时间（ｍｉｎ）图３．７温度对壳聚糖酶稳定性的影响Ｆｉｇ ３．７ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ产壳聚糖酶菌株的发酵条件优化、壳聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究３．４．２ｐＨ对酶活性的影响３．４．２．１壳聚糖酶反应的最适ｐＨ值由图３．８可以看出，ｐＨ低于４．４时该壳聚糖酶酶活力明显降低，当ｐＨ值为４ 时酶活力已经降至原来的５％。在ｐＨ５．０—６．４范围内酶活力相对稳定，结果表明酶 的最适反应ｐＨ值为５．８。３．４．２．２ｐＨ值对壳聚糖酶稳定?陛的影响由图３．９中可以看出，该壳聚糖酶对碱性条件耐受性很高，酶在ｐＨ６．０—１１．０之 间活力相对稳定，在此范围内，４＂Ｃ下放置５ｈ后，酶的剩余酶活力仍可保持原来 的８０％以上。但是当ｐＨ值大于１１，该酶严重失活，在ｐｉｌｌ２时酶活力剩余不到２０％。图３．８ ｐＨ值对壳聚糖酶活性的影响Ｆｉｇ ３．８ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆｐＨＯｉｌ图３．９ ｐＨ对壳聚糖酶稳定性的影响Ｆｉｇ ３．９ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆｐＨｏｎｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ３．４．３金属离子对酶活性的影响 以不加