流式细胞仪和细胞分选：实用指南
流式细胞仪和细胞分选：实用指南
Jay Haron (jay dot haron at gmail dot com)
Freelancer, formerly of BD Biosciences, San Diego, United States
王秀英 (mary at labome dot com)
美国新泽西州普林斯顿合原研究有限责任公司 (Synatom Research)
http://dx.doi.org/10.13070/mm.cn.3.165
更新 : ; 原始版 :
实验材料和方法
A practical guide for using flow cytometry and cell sorting.
流式细胞术（FC）和荧光激活细胞分类术（FACS）诞生以来, 它们已得到大大改进。但要成为实验室广泛接受的技术，除成本因素外，还存在不少障碍。技术上的问题主要是细胞内低丰度分子的检测，缺少“通用”细胞通透物质，细胞自发荧光的干扰效应，荧光分子间发射光谱的重叠，以及缺少可识别目标分子的试剂。特别是对于细胞分拣来说，由于液滴的形成收集、分拣细胞重分析或培养前的稀释，以及为获得足够数量的可用细胞需要的时间延误的原因，还存在细胞存活问题。最后，特别是在处理低丰度对象时，数据分析也是很棘手的。应用细胞表面细胞内分拣免疫反应是是是细胞凋亡&坏死是是OCell therapy是否是信号传导/ 激酶活性是是是细胞周期分析O是是可溶性蛋白定量是否否细胞器分析O是是胚胎& 多能干细胞是O是基因组分析是是O细菌分析是是是环境微生物分析是O是微藻/浮游生物种群和群落是O是表达载体效率O是是受体药理学是是是细胞衰老是是是Sperm physiology and sexing是否是癌症干细胞分析是是是病理学 - 疾病鉴别是是O产前诊断是是O癌症诊断是是O遗传性疾病诊断是是是循环内皮细胞和前体是OO基因表达是是是病毒感染是是是食品安全是O否突变O是是毒理学和诱变O是O染色体分拣O是是HLA分型是否否异种移植监测是O是细胞离子通量是是O高通量检测是是O细胞克隆是否是细胞分裂和迁移(CFSE）是是O表一：流式细胞仪和/或细胞分拣的常见应用。有一篇关于 流式细胞仪理论的不错的综述，介绍了流式细胞仪的操作语言。此外，Labome.com还有另一篇文章涵盖了提供流式细胞仪所用特定试剂的 。本文将聚焦于以下几点: 1）硬件的选择和注意事项，2）流式细胞仪和细胞分选的实际问题和，3）数据分析和软件。这几个话题包含的内容不展开论述，希望读者在着手开展表一列出的一些流式细胞仪应用研究前，了解一些注意事项。硬件
在决定需要什么实验设备的时候，细胞生物学家需要了解自己的预计需求和预算。表二列出了市场上可有的选择。由于这些设备会不断更新，建议到制造商网站查询最新的升级。细胞分拣设备JSAN& / Bay Biosciences&Benchtop Asian Co.</tdBD& / FACS Calibur / AriaAlso clinical instrumentsBeckman Coulter& / MoFlo&Also clinical instruments</tdCytonome&Closed CartridgeInflux / BD&Large Particle</tdMicromet AGAcquired by Amgen 3/12Owl / Innovative Micro TechnologiesMicrofluidic cartridges</tdPartecBench topSony& / iCytStart-Up</tdUnion Biometrica&Large Particle流式细胞仪（分析级）Accuri&/ BD&Bench top to multi-laser</tdAttune / Life Technologies&Acoustic focusingApogeeSmall particle focus</tdGuava / Millipore&MicrocapillaryGallios / Beckman Coulter&Multi - laser</tdStratedigmIso-Pressure Fluidics竞争技术AmnisImaging Cytometry</tdDVS Sciences&/CyTOFMass Spec discriminationMiltenyi and othersMagnetic Beads</td表二：主要设备供应商。 做小颗粒分析的专业公司（JSAN, Partec, Accuri）将他们的服务定位于个体实验室或需对其细胞分拣仪做恒定质量分析的实验室。他们通常会用到改进的更小的激光二极管和微流体。但如果需要做每日监控或者对大型项目（如临床试验）的多台仪器的数据进行比较，其软件没有大公司的强大。一个建议是确保仪器输出文件能够同您打算使用的收集后分析软件兼容。研究人员对研究对象进行了分类，超大型（浮游生物、母细胞、早期胚胎），非常小（微粒、细菌）或者高度不对称（精子、肌小管）。确保您将要使用的仪器以前在这一应用中被成功使用过。喷嘴直径、流动细胞的几何形状、流速、液滴大小、检测器位置都会影响到结果。再生医学和癌症治疗研究通常要求对细胞进行分离以确保纯度、细胞活力，并且便于在流式细胞仪实验室和病人间运送。Closed cartridges（Owl，Cytonome公司） 似乎是制造商为解决这一问题的一个尝试。另一个途径是提供带有无菌罩或者可匹配标准尺寸无菌罩的细胞分拣仪。有几种可增强流体流动的技术，如声学对焦（Life Technologies公司）、等压射流（Stratedigm公司）、毛细管（Millipore公司），或微流控技术（几个还在开发中）。它们大多已在其他设备上应用，却未必已用于流式细胞仪。为便于使用者获得及时反馈，我建议本文读者加入 。许多流式细胞仪方面的领军人物都会定期在该论坛上提供有价值的信息。其他博客，比如Google+，也有类似功能，但它们缺乏普渡团队的深度和广度。另外，还有一些有意思的技术在这一领域也很有影响。首先，利用Miltenyi或其他公司的磁珠对目的细胞做预纯化或清洗可提高分拣效率。当然，仅仅利用一轮或多轮磁珠筛选而不用流式细胞仪，许多研究也能开展起来，但这不是本文讨论的重点。Amnis 公司已将流式细胞仪射流与荧光显微镜和数字成像整合在一起。其结果是一系列单个细胞的图像能够显示荧光团的分布，而非简单的平均荧光指数（MFI）。DVS Sciences已极大地扩展了可用质谱（MS）检测结合报告抗体的金属螯合物的靶标数。目前有33种不同的金属可被同时检测。该仪器被Time of Flight 称为"Cytof" [] 。考虑购买该仪器的研究人员应该确保他们有这一深度的细胞分析需要。此外，细胞在等离子体中会被汽化，所以用于研究的细胞不能恢复。细胞分拣仪制造商有一点不能达成共识，激光检测是在细胞通过喷嘴后的液滴中（空气中的蒸汽），还是液滴形成前的流动细胞内，完成效果最好。如图1，（上图）一个蒸汽系统（Influx，也可能是FACSCalibur或其他设备），（下图）一个流动细胞系统（BD公司的 FACS Aria III）。 图 1. 蒸汽的（顶部）和流动的（底部）细胞分拣装置的光学构造。BD Biosciences&转载许可。
这两者各有优势和局限。蒸汽分拣仪硬件设备简单，检测点与收集装置间距离较短，检测样品的激光数多。而流动细胞分拣系统通过比色皿提供层流和增强的样品聚焦。然而，流动细胞长度有限，而且激光光学装置需要足够空间避免不同通道间的串扰。对于敏感性来说，流动细胞系统明显占优，但蒸汽系统没有保持细胞清洁的问题，并且能提供额外的激光束。需要指出的是，有些激光束本身对细胞有毒害作用。细胞悬浮于液滴中，然后使其经主脉冲自由下滴（或提供压力）。有关液滴如何带点和偏向的问题，请参考Labome其他流式细胞仪的文章 图7。此外，关于培养基种类和细胞存活体积的问题。相关文章和普渡大学网站有大量关于培养基的建议，但培养基通常会选用牛胎儿血清（FBS）。将细胞收集到11 x 75 毫米或更大的管中，需要用到0.5 - 1 mL的牛胎儿血清。对于多层平板来说，牛胎儿血清应该占一半的体积，因为还要考虑平板干掉的问题。而如果仅仅是收集核酸，用于细胞裂解和核酸提取的同样的产品就可以了。此外还建议对进一步处理的细胞在营养丰富的生长培养基中进行复苏。所有的流式细胞仪制造商都在增加分拣细胞存活方面取得了很大的进步。微流体方面的最新进展可能使不通过液滴形成做细胞收集成为现实。不管答案是否是毛细管-基础系统或基于微通道的系统，都必将规避分拣时的细胞压力问题。试剂-抗体
除非你用病人血清建立诊断检测，不缺少提供流式细胞仪抗体的公司。请见Labome文章 列表。然而，并非所有这些公司都有相同克隆-并且不是所有克隆在流式细胞分析中作用方式相同。如果文章中没有列出想要的克隆，而你又想运行相似的实验，请联系作者找出使用的哪一克隆。 多数公司不会公开抗体纯化和标记的方法，但如果你是从一个声誉较好的公司购买，同一克隆标记相同的荧光基团就可以了，除非是在发货途中受损，微生物污染或者保存不当。按照制造商建议的储存条件，抗体至少能保质一年。然后，你应该决定你的实验是否要用荧光直接标记的抗体，或者用二抗，生物素-链霉亲和素，或其他配体-受体。除非您的实验室预算紧张，应使用直接标记的抗体。直接标记的抗体背景较低，没有裂解细胞释放的生物素造成干扰，重复性较好。另一种选择是用标记试剂盒或者第三基团标记的抗体，如 或其他的。一些抗体制造商也提供用户定制标记，但应认真考虑公司在抗体标记方面的声誉如何。所有的化学基团各有优劣，因此需要慎重考虑交联剂（请见Thermo Fisher Pierce
。有五种基本类型的荧光染料：小分子染料（如荧光异硫氰酸酯/ FITC和Alexa染料），蛋白染料（藻红蛋白、别藻蓝蛋白、绿色荧光蛋白），串联染料，其中蛋白染料收集荧光，将它传输至小分子染料，然后串联染料发出同小分子染料（如APC-Cy7）量子点和多聚染料（ ）相同波长的光波。所有的都各有优点和缺点，但蛋白染料和小分子染料在流式细胞仪中使用时间最长。我们很容易就能观察到标记的大分子蛋白（> 100 kD）、疏水性染料或聚合物是如何改变单克隆抗体活性的。为说明相对相对大小，图2显示了一个抗体分子与一个蛋白分子共轭的结构（在这种情况下辣根过氧化物酶“只有”44 kD）。我们可以得出这样的结论：最安全的方法是使用以前别人用过的同一克隆抗体和荧光染料结合的抗体。但是，我们为什么不能创造出一种独特的抗体呢-通过表达细胞或非表达细胞共轭组合并表征其特异性，然后滴定抗体最大化其信噪比，这样你的实验室就有一个新的试剂了。 图 2. SoluLink