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【讨论】小鼠断尾采血中遇到的超奇怪现象！我竟然采到了0.3ml血，小鼠却莫名其妙
真奇怪！！！大家快帮我分析一下今天遇到的奇怪现象吧！！因为担心从小鼠采不到elisa实验所需的血量（一般断尾采血只能最多采到0.1ml/只），所以今天做了一次断尾采血实验，步骤如下：四只雌性小鼠，分别称重26-30g,两只注射0.05ml 2%的戊巴比妥钠溶液腹腔麻醉，另两只注射0.1ml。注：按45mg/kg算0.05ml是正常剂量，0.1ml为加倍的麻醉剂量（因为前两只0.05ml的麻醉效果不明显，故加量）。（书上讲麻醉可以多采血，而且采血方便）用其中一只（注射0.1ml麻醉药的）断尾采血，尾部先在50度水浸泡一分钟左右，然后剪尾尖2mm，最后采血0.3ml。大家有没有发现异常？书上讲断尾采血最多只能采到0.1ml，而我竟然整整多采了2倍！而且用力挤还能再多采血！开始很兴奋，终于不用担心采血量够不够的问题了。可是接下来发生了意想不到的事情！采血鼠突然出现了四肢瘫软，抽搐，心跳逐渐停止。我胸部按压近一个小时，症状出现近半小时后腹腔注射近似等渗葡萄糖（时间仓促只能配成近似浓度，实验室没有生理盐水，后悔当时没有直接尾静脉注射，因为从来没想到断尾采血也能把小鼠搞到大失血，所以没能及时抢救），最后还是死了。然后再看另外三只鼠，注射0.05ml麻醉药的两只没有任何抑制症状，注射0.1ml的那只有些行动迟缓，但没有达到麻醉要求。我有太多疑问：1.为什么我采到了那么多的血，而从来没有人提到断尾采血能采到0.3ml的，而且按当时情况看，这还不是极限量。
2.采血后小鼠的死亡原因是什么，我本来觉得可能是大量失血后为了补充血量，腹腔注射的麻醉剂加快了吸收速度，导致血药浓度升高超过耐受值。可是另外一只注射0.1ml的小鼠连麻醉要求都没有达到呀。
3.采到大量血的原因到底是什么，是因为热水浸尾还是用了麻醉药，为什么从没有人提到过可以采到这个血量？
4.我没有用不麻醉的小鼠热水浸尾采过血，如果这样做，可以采到多少呢？
5.为什么我的麻醉没有效果？（从另外三只的情况看）请大家多多谈谈，并请各位赐教！注：小鼠总血量为1ml左右虽然是提问，楼主能够清晰得提出问题，提供详细的背景资料，看得出楼主对科研的兴趣，且是低分站友，故加一分，祝你实验顺利根据你上诉所说的情况，我个人觉得出现这种麻醉差异的现象是由于小鼠个体差异及和麻醉后采血有关的。我做过动物临床药物麻醉实验，有时也会遇到这种情况，就犬而言，一般临床上多用“８４６”麻醉，用量一般为０.1ml/kg。有些犬对麻醉药敏感，按这个量肌注，就会导致麻醉过深，在抢救不及时的情况下，动物就会出现死亡。同理，有些个体强健的犬，按这个用量用药则不能达到理想麻醉效果；另外，用麻醉药本身就会对机体造成一种应激，这时你又大量采血，必定对机体的损伤更大。至于你说书上说讲麻醉可以多采血，而且采血方便，不知你参考的是哪一本书。据我所知，一般麻醉只会使血管平滑肌收缩，血流量减慢，心跳减弱。在临床中进行宠物手术，如需补液，我们都是采用先输液，然后麻醉的过程，因为注射麻醉后，血管就不明显了，当然也有例外，但麻醉后采血，我们一般很少用的。王伯云（有个三点水的偏旁，打不出来这个字）主编的《病理学技术》，人卫的，提到“如不麻醉，采血量少”。我打算今天不麻醉试试，看能采到多少血。我打算先输液，再采血，这样可能安全些吧，不麻醉了，我问过动物中心的人，他们断尾采血也不麻醉的。另外，不知道小鼠采多少血才安全，一般来讲，小鼠血量为体重的5-8%，小鼠体重25g左右，也就是说小鼠一共有25×5-8%=1.25-2ml的血量。我想这可能与小鼠自身体质有关吧，我们做ELISA摸索浓度时，十几只小鼠全部剪尾采血的，最多一只取了0.4－0.5ml，没有一只死亡的。再一点，从上到下挤压按摩尾部，想血流得快一些，这种方法很容易发生溶血，血清呈红色的了。我们剪尾取血从不麻醉，你的小鼠死亡也许与这有关吧。你用温水浸尾也行，我们用酒精棉球消毒擦拭尾部，再用台灯烤一下，就可以剪了，大约3cm左右长度，之后按压止血。TO
多谢各位及你的经验！呵呵，你真高手，台灯都想的到。按压止血我觉得效果不佳，你们压多久？我压两三分钟一松手就又流出来，还不如抬高尾巴，让挂在尾尖的血滴凝固来得容易些，书上写6%液体火棉胶可止血，你用过么？效果如何？还要再多问几个问题，不好意思：
你们取的血是要加抗凝剂的么？是加液体的还是固体的抗凝剂？如何加？我担心加液体抗凝剂的量把握不好，会稀释血浆，ELISA测不准。
另外问一下，不按摩尾部你是如何促血液流出呢？是直接把尾尖放试管里就能不断向外流血么？再有，溶血对ELISA有多大的影响呢？
你们剪掉了3CM！？我要多次采血，不敢剪那么多呀，剪了两次，都是剪掉0.3MM，采血量的多少跟是否靠近尾根也应该有很大关系吧。
总觉得断尾采血，血流出很慢，十几只小鼠，采血要两个小时吧。
我想采血前或采血后腹腔注射生理盐水，以防采血后大失血，各位觉得可以么？多谢。cicidog wrote:TO
总觉得断尾采血，血流出很慢，十几只小鼠，采血要两个小时吧。
我想采血前或采血后腹腔注射生理盐水，以防采血后大失血，各位觉得可以么？多谢。你可以拿台灯烤一下，或者拿温水泡一下，但是一定要擦干水，以免溶血。十几只老鼠你要两个小时，速度实在慢了一点，我觉得大概一个小时就可以，关键你要让它血流加快就好了，但是台灯的温度也不能太高，以免烫伤。再说断尾取血是损伤比较小的方式了，其他方式虽然比较快，可是会让小鼠比较容易死掉，断尾还是比较好的，对老鼠的损伤也比较小，血也比较容易止住。腹腔注射的问题，我以前没有做过，但是感觉如果在采血前注射的话好像不怎么合适，我以前就是取了血以后马上让它们喝水，感觉也还挺好的祝你实验成功！不知道血的颜色如何？是否暗黑色的？如果颜色暗黑，应该和麻醉过量，导致血液携氧不足有关如果颜色正常，那就是采血过量导致死亡，这也许是个体差异吧TO
katherinexx:
多谢提醒，我还真没有想到擦干水来防止溶血，不知道你们每次能采到多少血量？
jnutjj谈到按摩尾部会导致溶血，可是，不按摩很难流出血呀，不知道你们怎么办？多谢。TO
谢谢提醒！我记得当时的血液颜色跟以前未麻醉时采血没有什么不同，应该是鲜红色吧。到现在我还十分疑惑，为什么另外三只只鼠一只都没有麻醉成功？采血后可以腹腔给生理盐水来补充血容量但前提是不能在同一天再次采血否则会有稀释血液的作用动物的麻醉与动物性别有很大关系雄性动物麻醉剂量不能太大雌性动物就要大一点一般来说，书上算出来的都是雄性的给药量雌性可能会是两倍甚至三倍第一只麻醉可能是个体差异，有可能比较小，脂肪少，需要的麻醉药也就少了，其它三只明显是给药量不足cicidog wrote:TO
katherinexx:
多谢提醒，我还真没有想到擦干水来防止溶血，不知道你们每次能采到多少血量？
jnutjj谈到按摩尾部会导致溶血，可是，不按摩很难流出血呀，不知道你们怎么办？多谢。我们是取血测血糖的，大概在0.2ML左右，有些小鼠很容易就取出来了方法也是摸索出来的，都是在断尾前拿台灯烘一下小鼠的尾部，翻过来，但是不要凑的太近，大约30S，然后按摩一下尾巴根部，而后剪断，从上往下捋尾巴，这样血就出来，有时候运气好会自己流出来的，不能太用劲的去按住来压老鼠的尾巴，这样是不会溶血的。不知道你的指标是全血还是血清呢？血清的话取血的时候要很小心的，个人认为拿灯烤是个不错的方法。你可以试很多种方法，取一种最快最好的方法，有时候完全模仿书上的方法是很难，需要自己去摸索了，我也不知道是不是表达清楚了，这些也是我经过很长时间总结出来的。大家互相探讨吧 TO
silverman：
这下那只小鼠可以瞑目了，呵呵。TO
katherinexx:
多谢，都听懂了，呵呵。我采的血量基本上也在0.2ml多一点这个范围。
我要测量血液的VEGF，试剂说明书上讲血浆或者血清都可以用的。你们用的是血清还是血浆？是不是采血时不加抗凝剂，离心后就是血清了，不需要加别的什么东西么？有点不敢相信差别就这么小。大家提了这么多比较好的建议，我也是正在摸索之中。我们曾经尝试过用剪尾，摘眼球，皮下心尖搏动处心室穿刺取血等方法，第一种最安全，第二种容易死去，第三种取血最多，也容易死去不安全。三种都有不同程度的溶血，第三种稍微好一些。剪尾流血比较慢费时，我们也是比较头疼的，流得慢止住也慢，常用明胶海绵按压，效果还行。
还有，要想流血快但又不能过度挤压导致溶血，确实是个问题。如果你是用了注射器，那么将血推入离心管的时候就要把针头拔掉，那种挤压也是对RBC的一种损伤。摘眼球的话，据说第一滴血不能要，带有鼠毛等杂质可致溶血发生。心脏穿刺需要麻醉，剂量要掌握好，取血量不要太大，术后注意保暖。我们的ELISA试剂盒上写着避免溶血，所以我估计溶血可能会影响试验结果，但具体原因我也不清楚。
至于抗凝的问题，我们用的是500万肝素2ul就行了，不要将鼠尾断端伸入到离心管的底部沾到肝素，那样凝血就会比较困难，我们也试过用冰袋夹住尾部使血管收缩，但效果不太理想。剪尾越往上血管越粗，流血应该越快些，剪得太短流得会很少的，一下就可能凝住了。
采血后腹腔注射生理盐水0.4ml左右，可以尝试，应该是有用的吧。既然断尾采血能采到2-3ml（根据大家的经验和我这些天的实验），我觉得多次采血呢，还是用断尾好些。眼眶采血，一是技术有难度，二是怕难以止血。我是要多次采血的，如果实在一次采血量不够，就把两次采的血累加起来做一次ELISA，或者生理盐水稀释后再做ELISA，这样应该没有问题吧。TO
还是你想的远，能想到针管引起溶血的问题。
你们有没有试过不用抗凝？我离心过已经凝固的血，好象没什么问题，一样能分层。你的试剂盒是要血浆的吧，所以可以加抗凝，我们的试剂盒写有血清需10ul，血浆需50ul，如果我能用采到血清就根本不用担心采血量的问题了。
断尾采血书上也写要弃去第一滴，好浪费呀。不这么做会溶血么？请问大家。实在不行，我就拿这一滴做血涂片总没有问题吧，我想就算第一滴溶血也不影响我涂片观察白细胞吧。TO
katherinexx：
这位兄台，原来在我以前的帖子里咱们见过面。那种没上市的新药PTK787，我们已经拿到了。老外真够意思，先是我发E-MAIL询问他们，然后他们基本同意后让我们寄个书面的合同给他们，很快就拿到了。另外，虽然是药品，但是赠送性质的药品的是不需要报关的。但是他们要求发文章前必须经过他们的审查，而且他们可以使用我们的实验结果和论文。大哥，你这么晚还不睡吗？这样是什么意思啊，你们帮他们做实验？有酬劳吗？这样不是白做吗？我觉得你必须要把这个问题跟他们说清楚药是你们买的还是他们送给你的呢？最好问清楚吧，还是要提防老外的你们有没有试过不用抗凝？我离心过已经凝固的血，好象没什么问题，一样能分层。你的试剂盒是要血浆的吧，所以可以加抗凝，我们的试剂盒写有血清需10ul，血浆需50ul，如果我能用采到血清就根本不用担心采血量的问题了。断尾采血书上也写要弃去第一滴，好浪费呀。不这么做会溶血么？请问大家。实在不行，我就拿这一滴做血涂片总没有问题吧，我想就算第一滴溶血也不影响我涂片观察白细胞吧。 我个人认为小鼠的血很难取的，还是珍惜一点吧，做过预示吗？既然你需要的血清那么少，我想多次取血问题不大的祝你成功cicidog wrote:TO
katherinexx:
多谢，都听懂了，呵呵。我采的血量基本上也在0.2ml多一点这个范围。
我要测量血液的VEGF，试剂说明书上讲血浆或者血清都可以用的。你们用的是血清还是血浆？是不是采血时不加抗凝剂，离心后就是血清了，不需要加别的什么东西么？有点不敢相信差别就这么小。啊啊啊！刚才发到一半自己重启了，郁闷小鼠的血是比较难取的，0.2ML中取到你要的血清或者血浆，应该足够的，关键是要预防溶血！一定要注意，不然会有种前功尽弃的感觉，多次取血断尾总是安全一点的，记得消毒。对于血清和血浆的区别，我印象中就是有没有纤维蛋白吧，不对的地方还请多多指正，基本概念，我有点汗了，不好意思祝你实验成功！TO
katherinexx：
是诺华公司在全球均未上市的新药，一种酪氨酸激酶抑制剂。他们赠送的，免费。
实验结果是这样分配的，我们和他们共同拥有使用权，我们发表之前需先同他们联系，但是，同等的，也不可能只允许他们发表而不让我们发表。是属于共同研究的吗？不怕我们作仿药吗？很强啊是你们公用实验结果是吗？还是怎么的呢？发表之前要先给彼此看，这样说到可以修改内容吗？还是可以借鉴一些实验数据呢？感觉上好像你们的好处很多，这样他们有什么好处呢？诺华没有派他们大陆公司的检察员，只是在条款里写不准分析PTK787的药物结构，不准用该药制造其他药品，老外可能都是比较守信用吧。我们合同的仲裁法庭在瑞士，人家的法律很厉害的，估计不怕。他们是把我们的实验当作PTK一系列研究的一部分吧。应该不算共同研究。是公用实验结果，就是这个意思。老外应该比较能坚持实验结果，应该不会修改结果，是要用我们的数据，毕竟该药在世界范围内还没有治疗白血病的文章，对于他们来讲也是很新的内容，如果能成功他们当然很高兴，对他们也是有很大好处的。我也能够作完课题，而且对双方都有好处。我今天再次给小鼠剪尾采血了，真的感觉好郁闷的。血流的很慢，容易凝，轻轻的从上到下捋尾部，结果还是溶血比较厉害。我没有用抗凝剂，每只取了0.3－0.4ml，然后离心，结果发现血清都是不同程度的红色，怎么这么容易就溶血呢？十几只老鼠整了我好长时间，还不知道溶了血的血清做试验有没有影响，大家有什么好的方法能避免溶血吗？那很好啊，努力做啊，我觉得不错，比较此类药物还是空白不是吗？祝你成功jnutjj wrote:我今天再次给小鼠剪尾采血了，真的感觉好郁闷的。血流的很慢，容易凝，轻轻的从上到下捋尾部，结果还是溶血比较厉害。我没有用抗凝剂，每只取了0.3－0.4ml，然后离心，结果发现血清都是不同程度的红色，怎么这么容易就溶血呢？十几只老鼠整了我好长时间，还不知道溶了血的血清做试验有没有影响，大家有什么好的方法能避免溶血吗？你按照方法了吗？不能很用劲挤的，不然基本都会溶血，象你取那么多是一次吗？溶血是非常容易发生的，要尽量让血自然流出是绝对不会溶血的，不过好像有点不可能再说取血的时间也太长了，一只老鼠大概最多也就十分钟吧会不会是时间太长引起的呢？jTO
建议在较靠近根部位置剪断，这样血流的快些、多些。
另外，还记得麻醉剂吧，死掉的那只鼠真的是血喷涌而出！可能麻醉真有点用处，用1/2麻醉量作个小实验试试吧。
或者隔日采血，采三次血总够你做一次实验的血量吧。找到了解决采血量问题的最好方法，呵呵ELISA试剂盒说明上写血浆要每孔50ul共100ul，血清只要每孔10ul共20ul，一般来讲每ml血液分离出的血清或血浆量差不多，我试过的，所以100ul就够了。100ul，预热鼠尾部完全采的到还不怕溶血！PCR则有一种提取剂10个细胞都可以做的出结果，就是贵了点3000块，我们准备买，因为5×10的6次方才能够做RT-PCR，小鼠总血量1.2-2.1ml，白细胞一般3×10的6次方/ml，单个核细胞的采集率是30%，就算把小鼠的血放光也不够呀！你们的试剂盒有写可以用血清么？也可以这么少量么？你都是这么晚才来的啊很强既然你的试剂盒上有明确的规定就可以了啊照着试剂盒的要求来做吧在广东，夜生活比较晚，我又是天生的夜猫子，在北方就算天气很冷也要挺到2、3点才去睡觉，而且晚上干活查资料没有干扰。你是必须；要那么多血量么？说明书上说最低多少量？哥哥，我没做过，只是我都是这样做实验的，先按照实验要求（书上或者文献上），量比较少，大约三－五次吧，发现问题，然后问老师，然后修改实验方案，最后才开始大规模的实验，摸索一下吧你那不是有试剂盒的说明书吗？应该他要求用多少量的血清就用多少吧我以前测的东西和你不一样，但大多都是20ul血清左右其实你用血清比较好吧，这样取血的量可以少一点的，但是一定不能溶血溶血的问题搞的我好怕怕，我要再多练下子先！断尾取血我也做过,一般是只用温水泡泡,取的血量就足够我们用了.不过我也曾经试过先麻醉，我们用的是乙醚吸入麻醉,效果确实很不错的!我觉得用吸入麻醉,可控制一些,操作也简便，建议不妨试试!断尾取血我也做过,一般是只用温水泡泡,取的血量就足够我们用了.不过我也曾经试过先麻醉，我们用的是乙醚吸入麻醉,效果确实很不错的!我觉得用吸入麻醉,可控制一些,操作也简便，建议不妨试试!dophne wrote:断尾取血我也做过,一般是只用温水泡泡,取的血量就足够我们用了.不过我也曾经试过先麻醉，我们用的是乙醚吸入麻醉,效果确实很不错的!我觉得用吸入麻醉,可控制一些,操作也简便，建议不妨试试!请问你一般采到多少血？要按摩挤血么，有溶血么？你麻醉的目的是什么，为了方便操作还是增加采血量？增加采血量吧也许麻醉后采血多点，可以避免溶血，我打算再麻醉试试各位，谁知道给老鼠体内打药或者接种，药品或细胞怎么消毒呢？我要进SPF室的，它有紫外线消毒，是不是这样就可以了？建议先用3.5％水合氯醛0.2ml腹腔注射麻醉小鼠，然后减去胸部皮肤的毛，从皮下心尖搏动点进针，大概进入左心室的位置取血，我们取了0.5ml还多的血，然后拔下注射器的针头，将注射器里的血注入离心管里。拔下针头是为了避免针头的挤压对RBC的损伤，之后再离心（不宜久放），12000rpm30秒后逐渐减速下来共约5分钟左右，结果血清完全就是清亮的很淡黄色，完全没有红色没有溶血！而且那只小鼠居然还活着（抽血量最好小于0.5ml比较保险）！
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我是火影烧饼修改器
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