[转载]毕赤酵母表达知识02转载于丁香
以pPIC9K为例，pPIC9K是用于在毕赤酵母中的多拷贝整合分泌表达蛋白的穿梭载体，利用组氨酸缺陷型标记进行互补筛选。
一、信号肽的2步切割
pPIC9K载体带有自身信号肽，在分泌过程中被切除，但是由于切割效率，在目的产物N端带有3－5个左右的信号肽的氨基酸。
设计引物时，为了防止切割不完全，能去掉GluAla两个重复单位，不过文献报道多个Glu会提高kex2的切割效率。
要求目的蛋白中不能含有信号肽酶切割序列：glu-lys-arg-glu-ala-glu-ala。
信号肽的切除分为两步：kex2在glu-lys-arg和glu-ala-glu-ala之间初步切除，STE123在两个glu-ala之间切割。
二、是否在3' 端是带上一些其本来的序列？
1,首先，你要保证表达后细胞内信号肽酶能正确识别原来的位点，即此位点是不能随便增减的，否则信号肽不能正常切割，在这个基础上你再决定3'
端其本来序列的去留。
2，一般5'端多出一些氨基酸不会明显影响到你的目的蛋白的活性，我们平时在做酵母表达时，信号肽切割后，目的蛋白往往有几个多余的AA，这对活性好象没什么影响，虽然如此，但你还得注意多余AA的性质，不能过酸或过碱。
三、重组pPIC9K/GS115表达出目的条带后，
确定信号肽是否切除完全的方法：
1、N端测序
2、先查查你的氨基酸序列里有没有糖基化位点，如果有就只能N端测序了。如果没有，看分子量大小。
信号肽中有kex2和ste13两个酶切位点，现在担心的是kex2的位点酶切完全了，但ste13的两个酶切位点glu，
ala重复序列没有切干净，如果这两个氨基酸没有切除完全的话，分子量差异不大，两个氨基酸的差异应该看不出来，一般来说，N端多一两个AA应该对蛋白的活性没有太大影响。western检测有两个条带的问题，可能是目的蛋白有一部分被降解了。
四、附：信号肽切割原理和优化切割
《Expression of Your Recombinant Protein with a Native
N-terminus》
If you wish to have your protein expressed with a native
N-terminus, you should clone
your gene flush(直接地) with the Kex2 cleavage site. Use PCR to
rebuild the sequence from the Xho I site at bp
arginine codon at nucleotides . Remember to include the
first amino acid of your protein, if necessary, for correct fusion
to the Kex2 cleavage site.
Signal Sequence Processing
The processing of the α-factor signal sequence in pPICZα occurs in
two steps:
1. The preliminary cleavage of the signal sequence by the KEX2 gene
final Kex2 cleavage occurring between arginine and glutamine in the
Lys-Arg * Glu-Ala-Glu-Ala, where * is the site of cleavage.
2. The Glu-Ala repeats are further cleaved by the STE13 gene
Optimization of Signal Cleavage
In Saccharomyces cerevisiae, it has been noted that the Glu-Ala
repeats are not necessary
for cleavage by Kex2, but cleavage after Glu-Lys-Arg may be more
efficient when
followed by Glu-Ala repeats. A number of amino acids are tolerated
at site X instead of
Glu in the sequence Glu-Lys-Arg-X. These amino acids include the
aromatic amino acids,
small amino acids, and histidine. Proline, however, will inhibit
Kex2 cleavage. For more
information on Kex2 cleavage, please see (Brake et al.,
There are some cases where Ste13 cleavage of Glu-Ala repeats is not
efficient, and Glu-
Ala repeats are left on the N-terminus of the expressed protein of
interest. This is
generally dependent on the protein of interest.
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五、翻译Genebank所查序列
为设计一个引物，在Genebank上查找序列如下：
CDS 序列是 57～560， sig_peptide 从 57～119， mat_peptide 从 120～557。
问题如下：
1、sig_peptide和 mat_peptide 各代表什么意思，sig_peptide是不是就是信号肽，哪mat_peptide
2、sig_peptide前面1～57是序列的什么部分？
3、cDNA序列中除了CDS是编码区外其它部分主要起什么作用，在设计引物时应该从第一个碱基开始还是从信号肽开始，还是从CDS的第一个碱基开始！
答：sig_peptide 信号肽，mat_peptide
成熟肽，就是切除信号肽以后的成熟蛋白元件。sig_peptide前面1～57是5‘非编码序列，它一般含有Kozard序列，在翻译起始过程中发挥作用。3’非编码序列是帮助翻译的终止。
母转化原理：
Like Saccharomyces cerevisiae, linear DNA can generate stable
transformants of Pichia
pastoris via homologous recombination between the transforming DNA
and regions of
homology within the genome (Cregg et al., 1985; Cregg et al.,
1989). Such integrants
show extreme stability in the absence of selective pressure even
when present as multiple copies. Note that single crossover events
(insertions) are much more likely to happen than double crossover
events (replacements). Multiple insertion events occur
spontaneously at about 1-10% of the single insertion events.
像酿酒酵母,线性化的转化DNA和Pichia
pastoris基因组的同源区域发生同源重组,使得线性化DNA产生稳定的转化子(Cregg et al., 1985; Cregg
1989).这样的整合方式显示极强的稳定性,即使多拷贝转化子在没有选择压力的情况下也很稳定.单交换事件(插入)比双交换事件(置换)发生几率更大.单插入事件中约发生1-10%概率的多插入事件.
电转化注意点：
一、&&制备感受态的菌液收集时间：
1、准确测定OD值：OD在1.2～1.5之间。
1）为了准确测定OD值，建议将菌液稀释不同浓度测定（1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系）。每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能OD稀释倍数不够！
OD值是否测准也可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min）约0.95g/10ml。高密度发酵时菌体湿重将相应下降。
2、75ml的菌，经18h左右的培养，最后sorbital洗涤完毕后，50ml离心管里所剩菌体特别浓，需要1ml
sorbitol才可溶解为糊状。正常培养的OD在1.2～1.5之间的500ml菌液，收集的感受态也用1ml稀释的，没那么粘稠。可以看看降低培养温度（27摄氏度）或缩短培养时间（12h）。
3、甚至不用转接,直接挑单克隆在50－100mlYPD中摇过夜，效果也很好
二、制备感受态的菌液量
如果只转一个样品，50ml就够了，一般50ml的培养液如果OD值正常的话够做10管感受态的，其他的按比例缩小。用大试管摇5ml菌液，然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受态，每一步的离心时间30秒就行。整个流程时间短，制备好的感受态用来做转化的效率很高。
山梨醇离心，洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度，不要过于粘稠和稀释。
三、感受态的保存
感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因，在冰上放几个小时再做可能有一定的影响，尽量马上制备马上转化。如果感受态细胞要保存，不需要加甘油，一般80ul
EP管分装，-70 或 -80 摄氏度保存。
另附：酵母GS115点种分离纯化
接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布 YPD平板，30℃培养48 小时，用
YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。
四、电转化注意点：
1、感受态做好后，最后一次吸出sorbital时，不是直接倒调的，而是用毛细管轻吸出来的，这样可能使剩下的感受态纯净些。
2、最后用毛细管取出100ul出来，加入质粒，混匀！（怕量不够，吸得很多，电转时效果反而不好。 ）
3、电转杯清洁处理:一般先冲洗，洗净；然后浸泡在75%的乙醇中；使用前我们都是放在超净台上，开启紫外，边吹风晾干，边进行紫外照射。电转杯的新包装或重复使用可能对转化率有一定的影响。
4、电击的时候，电压数以及电击时间可以摸索一下，适当增加电压或者延长电击时间都可以。电击条件比如1.5kv，放电4.8～5.5ms。电击所有过程都要尽量在冰上进行，电击时间可以减少一点，设置为5ms左右，电击之后马上加入预冷的山梨醇溶液，转移至EP管，30度静止培养1h。如果菌体悬液浓度比较大的时候，在制备感受态的时候要留心一下操作中的问题了。
5、电击之后，加入1ml的山梨醇，吸入1.5ml的ep管中，置于30度摇床低速培养1h，再涂板。
6、注意的是处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。
7、转化后1ml用sorbitol重悬的细胞悬液不能全部涂在一块板子上，按标准程序制作的感受态一般3块左右可能比较合适，以干燥后看见一薄层淡淡的白色为宜。转化子会在白色的薄层上长出圆韵、饱满的大菌落的。
五、转化试剂和培养基的正确准备方法
1、MD板子提前几天做好，放在冰箱里，涂板的时候吸收效果会好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些积层，反而不利于生长。
2、YNB42度水浴一会，然后过滤除菌，YNB是加到培养基里面的，去离子水pH偏低，建议直接用蒸馏水就可以（关系不是太大）。
3、山梨醇，以及无菌去离子水均是冰冻，存放在4度冰箱中
4、一般用10ug以上质粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ul
ddH2O重溶。转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。有人用LiCl和DTT处理细胞，转化效率很高，可以试试。建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。
5个电转化方案
方法一：高效
1.收集菌体
取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中，4℃、10000g
离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。
2.菌体处理
加入1ml处理液，室温下放置20min。
0.6M sorbitol
10mM TrisHCl(pH7.5)
3.离心，弃上清，加入1ml 1M sorbitol ，离心，弃上清，
4.用1M sorbitol洗涤二次，到最终体积约为80μl.（菌体太多可适当弃去部分）
5.加入10μl.经过BglⅡ酶切处理的工程质粒，混匀后转入 电击杯中，冰浴5min.
6.电转. 1.5kv，25μF，200Ω条件下进行电转。
7.电击后立刻加入1mL 1M sorbitol，吸出后于30℃培养2h。
8.取一定量涂平板(YPDS + Zeocin，涂布的量分别为100、200微升，剩余的经离心处理后全部涂在一个平板上)
有一点要注意的是处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。
方法二：按下面步骤转化,开始每个板子只长了一二十菌落;小细节修改后,每个板长了约100个.
步骤如下：
1、目的DNA（pPIC9K)，经电泳检测已经线性化（SalI酶切）；
2、DNA纯化方法是经酚仿－氯仿两步抽提后，无水乙醇沉淀的，目测定量应足够；
3、GS115甘油菌经新鲜平板复苏后，5ML培养过夜，16h左右后，取菌1：100稀释，接种于70ml菌液扩大培养，14h后测得OD600约1.3左右。
4、将sorbital、水和菌液均冰浴；
5、菌液离心5min－100ml冰水洗涤－50ml冰水洗涤－4ml
sorbital洗涤，然后溶解于300ul冰sorbital；
6、加入约5～10ug的DNA，枪吹匀，置0.2CM电转杯静置5min；
7、电击，1,5KV.
8、立即加入1ml冰浴的sorbital，静止10min。
9、取100ul转化液，涂布10cm的MD平板。
做了一点修改每块板子大概能长100来个菌落（一般需要2天左右）：
1、菌液收集时间：以前可能是OD值测得不太准确，我然后把菌液分别做了1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系。1、菌液测OD值时，建议将菌液稀释不同浓度测定，这样才准确些。菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能就是你的OD稀释倍数不够！你分别稀释2倍、4倍、8倍、10倍等，每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！
2、我开始是先挑单克隆于5mlYPD中，过夜16h后，转接于50ml
YPD中，培养大概18个小时吧。OD值是否测准可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min）约0.95g/10ml。高密度发酵时菌体湿重将相应下降。[测OD，用什么作空白对照呢？菌体稀释液，我一般使用PBS]
3、电击条件等上面帖子上都有，1.5kv，放电4.8～5.5ms。
2、其它做法相同，就是感受态做好后，最后一次吸出sorbital时，不是直接倒调的，而是用毛细管轻吸出来的，这样可能使剩下的感受态纯净些。
3、最后用毛细管取出100ul出来，加入质粒，混匀！（我以前怕量不够，吸得很多，电转时效果反而不好。 ）
4、MD板子提前几天做好，放在冰箱里，涂板的时候吸收效果会好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些积层，反而不利于生长。
5、你说的YNB，我用的是成品，只需要直接配制。42度水浴一会，然后过滤除菌。我没有加硫酸铵。YNB是加到培养基里面的，去离子水pH偏低哦，我建议直接用蒸馏水就可以了（关系不是太大）。
方法三：简便独特
在筛选高表达菌种中，与大多数人和说明书有区别(成功做出几个基因):
每次转化前，均用多种酶BlgII/salI/sacI同时切，转化时，用GS115/KM71/KM71H同时转化，转化的条件也和大家一样，即1.5/25/200,但是我用的是0.1的杯子，不是0.2的，转化后涂MM及YPD+0.25G，长出菌落后，即进行大规模的表达试验，直接用YPD表达的，一般48h后即进行大量的SDS-PAGE鉴定，鉴定时，样品不用浓缩，直接上样，看到目的带后再做PCR，测序。
方法四：没有转化子（无aa的YNB和硫酸铵称好后，去离子水溶解，然后高压灭菌）
1.挑取酵母单菌落，接种至含有50ml
YPD培养基的三角瓶中，30℃、250-300rpm培养过夜约14h，OD600约1.3
2.菌液离心5min－50ml冰水洗涤－25ml冰水洗涤－2ml
sorbital洗涤，然后溶解于200ul冰sorbital；两管分装，每管100ul
3.加入约5～10ug的线性化的DNA20ul，枪吹匀，置0.2CM电转杯冰浴5min；
4.电击，1,5KV.使用的是 Eppendorf 2510，用于转化细菌及酵母。
5.立即加入1ml冰浴的sorbital，静止1h。
将菌体悬液涂布于MD平板上，每300&l涂布一块平板；
方法五: 和Invitrogen公司说明书差不多的方法
X33菌株于100ml YPD摇到OD600约1.1-1.3，太高影响感受态效率
(1) g离心5min，将离心管倒置在吸水纸上轻轻控几下，充分弃上清
(2) 加入100ml 冰浴的超纯水ddH2O，可在振荡器上振荡混匀，可静置3－5分钟
(3) 离心，弃上清，再加100ml ddH2O洗一遍
(4) 离心，弃上清，加20ml 冰浴1M Sorbitol洗一遍
(5) 离心，弃上清，菌体置于冰浴中，加入约100－200ul Sorbitol混匀
加入Sorbitol量需自己调整，这时菌液很浓，只要能够用200ul黄枪头吸出来就可以了，一般共有约400－500ul，够做几管感受态了。
(7) 吸取100－150ul感受态到线性化的DNA中，用枪头打匀或手指弹匀
静置5min，于2mm电转化杯中，电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400），一般放电时间在4.5-4.9ms之间，小于4说明你的DNA盐浓度太高
(9) 立即加入1ml Sorbitol，转入10ml 离心管，30度静置1小时，然后加入1ml
YPD，30度，200rpm摇1小时，取50－200ul菌液涂100ul/ml YPDS板
(10) 一般转化效率可以达到：200个以上转化子每200ul菌液，足够筛选表达菌株了。
方法六:酵母感受态细胞的制备
⑴ 接种Pichia pastoris GS115于5 ml YPD液体培养基，30℃，250~300250 rpm
取200&l的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的三角摇瓶中，28~30℃、250~300r/min培养过夜，一般12小时左右。
⑶ 将细胞培养物于4℃，5000g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
⑷ 按步骤3离心，用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
⑸ 按步骤3离心，用20ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；
⑹ 按步骤3离心，用1ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为2ml；
⑺ NOTE：可将其分装为200&l一份的包装冷冻起来，但如果保存时间过长会影响其转化效率。
酵母PCR的6种基因组提取方法
1、简易微波炉加热/-20℃冷冻法提取基因组
在微波炉中档加热1min，-20℃2min，(如果你怕之前效果不够，加热骤冷这两步可以重复一次)加入20ul水，振荡1min，离心30s，上清作为PCR模板。
1.挑选克隆培养过夜；
2.取1ml（或500ul）离心，收集菌体，蒸馏水洗一次，1ml山梨醇洗一次，（轻轻吹打），离心，收集菌体；
3.溶于100ul蒸馏水，80’C/10min,可在PCR仪中完成；
4.离心，收集上清
5.PCR，引物可以用5’AOX, 3’AOX引物
或这个方案：
1.取1ml菌液2500rpm离心5min，弃上清
2.用500ulPBS悬浮沉淀，2500rpm离心3min，弃上清
3.100ulTE融解沉淀，沸水浴10min，－70‘C冷冻40min，1500rpm离心，
4.再次沸水浴10min，1500rpm离心，
5.取上清为模板，以5’AOX1和3‘AOX1引物进行反应
2、手册的溶壁酶法： “毕赤酵母基因组的提取”方法完整的步骤
⑴ 接种重组和空质粒转化子于5ml YPDZ培养基， GS115菌于YPD培养基作对照，30℃，培养16～18小时。
⑵ 室温下，1500 g离心5-10min收集菌体
&# ulTE（pH 7.0）重悬，加入300 ul EDTA（pH 8.0），0.07M Tris－HCl，3
ulβ-巯基乙醇，1ul Lyticase ，37℃水浴30 min。
&#g离心5~10min，取沉淀，加90ul TE重悬。
⑸加入1 ul 100x proteinK ，10ul 10xSDS，56℃作用30min。
&#ul 饱和酚，200ul氯仿，混匀，离心30s ，取上层水相。
⑺ 加入两倍体积无水乙醇以及1/10体积的NaAC，-20℃放置30min；
&#g离心20min，弃上清；75%乙醇漂洗沉淀一次；
⑼ 干燥后，加入15 &l的TE或H2O溶解，-20℃备用。
手册中酵母基因组的提取的方法，称之为“溶壁酶法”，还有其他的一些方法，例如“酸性玻璃珠法”，还有一些试剂盒的提取等途径，等等。
“溶壁酶法”法的主要原理是在EDTA存在的情况下，用proteinK（蛋白酶K）消化真核细胞，用SDS溶解细胞膜并使蛋白质变性。核酸通过有机溶剂（如氯仿，饱和酚等）抽提进行纯化。这种方法可以产生十微克至数百微克的DNA。{利用Lyticase（sigma公司）打破细胞，释放重组质粒，需要通过离心收集质粒，以备下一步利用蛋白酶K和SDS作用于质粒，提取整合有外源基因的DNA。}
3、参考“精编分子生物学”上的方法，省去玻璃珠这一步，PCR扩出目的基因，效果还不错。
（1） YPD 培养基的配制：15gYPD粉末,来自Clontech公司,溶于300ml水中，6分钟121℃高压灭菌后，加入4.5
ml Adenine 溶液（Adenine，Sigma,200ug溶于10ml 0.5M HCl中 ）。
（2） 取YPD培养液3ml 到15ml 离心管中，挑AH109 酵母单克隆到培养液中，30℃，200RPM，4小时培养。
（3） 用10ml YPD培养液培养次级AH109，过夜。
（4） 3000RPM，10分钟离心。用0.5ml水重悬。移液于新的1.5ml EP
管中，在室温下离心，倒掉上清，快速振荡。
（5） 取少量酵母菌沉淀，加1 ml消化缓冲液（见《精编分子生物学》,包括：100mmol/L,NaCl; 10mmol/L,
Tris.HCl; 25mmol/L EDTA; 0.5% W/V,SDS ）及蛋白酶K（20 mg/ml）,使终浓度达到0.1
mg/ml，65℃水浴使充分消化。
（6） 取出200ul, 加200ul酚/氯仿（1：1）高速震荡3分钟。加TE 200ul,
高速震荡，高速离心13000RPM，5分钟。
（7） 加1/2体积 7.5mol/L (NH3)Ac
及两倍体积无水乙醇,颠倒混匀,室温下13000RPM,3分钟离心。冰70%乙醇洗涤。
（8） 去上清,干燥沉淀, 30ul 无菌水溶解。测OD，-20℃保存。
4、参考细菌总DNA提取方法，简化摸索得到，提取酿酒酵母和毕赤酵母完全可行。产物足以用来做N多次PCR模板。如果使用试剂盒提取的话会非常的纯。
（1）、菌体培养：出发菌先培养18-36小时，获得足够的菌体。
菌体收集：取1.5ml培养液于1.5ml离心管中，12000rpm离心20秒，弃上清，收集菌体（注意吸干多余的水分）。
（2）、消化：每管加入200mg/ml的蜗牛酶50μl，RNase 5μl，处理30-60min。
（3）、裂解：向每管加入200μl裂解缓冲液（40mMTris-乙酸，pH 8.0 20mM乙酸钠，1mM
EDTA,1%SDS，其实就是加了SDS的TAE（50倍TAE母液和SDS母液）,用吸管头迅速强烈抽吸以悬浮和裂解细菌细胞。
（4）、沉淀蛋白：向每管加入66μl5M
NaCl，充分混匀后，12000rpm离心10分钟，除去蛋白质复合物及细胞壁等残查。
（5）、得到上清液后
将上清转移到新离心管中，加入等体积的氯仿，充分混匀后，12000rpm离心3分钟，进一步沉淀蛋白质。
沉淀DNA：小心取出上清用两倍的无水乙醇沉淀，离心弃上清。
洗涤DNA：用400μl 70%的乙醇洗涤两次。
室温或真空干燥后，50μlTE或超纯水溶解DNA，-20℃冰箱放置备用。
使用DNA快速纯化试剂盒（其实胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒都可以灵活使用）
5、军科院的方法：
（1）、用酵母细胞裂解液重悬酵母菌
（2）、加酚－氯仿
（3）、加玻璃珠
（4）、振荡半小时
（5）、乙醇沉淀
（6）、电转大肠杆菌
Plasmid Isolation from Yeast
Reagents and Materials Required
The YEASTMAKER Yeast Plasmid Isolation Kit (#K1611-1) provides the
SDS and lyticase solutions, CHROMA SPIN-
1000 DEPC-H2O Columns, and 2-ml centrifuge tubes for use with the
& Appropriate SD liquid or agar medium to keep selection on the
plasmids (Appendix C.A;
Appendix E).
& Sterile, 1.5-ml microcentrifuge tubes (or a 96-tube microtiter
array, multichannel pipettors, and
centrifuge adaptor for multiwell plates).
& Lyticase Solution (5 units/ml in TE store at 4°C for up
to 2 months or at &20°C for up to
6 months. If colloidal material precipitates, mix the solution by
inversion before using.)
& Recommended: CHROMA SPIN-1000 DEPC-H2O Columns (#K1334-1) and
2-ml centrifuge
tubes for use with the columns
& If you do not use CHROMA SPIN Columns, you will need materials to
perform phenol:chloroform
extraction and ethanol precipitation:
& Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1; See Sambrook et al.,
1989, for information on
preparing neutralized phenol solutions)
& 10 M ammonium acetate
& 95&100% ethanol
1.Prepare yeast cultures for lysis (Step a, b, or c below).
a. From a solid patch of growth:
i. Spread a thin film of yeast cells (~2-cm2 patch) onto the
appropriate SD agar medium.
ii. Incubate plate at 30°C for 3&4 days. (The patch should show
abundant yeast growth.)
iii. Scrape up a portion of the patch (~10 mm2) and resuspend the
cells in 50 ml of sterile
H2O or TE in a 1.5-ml microcentrifuge tube.
b. From a liquid culture:
i. Inoculate a large (2&4-mm), fresh (2&4-day-old) yeast colony
into 0.5 ml of the
appropriate SD liquid medium. Vortex tube vigorously to completely
break up the colony
and resuspend the cells.
ii. Incubate at 30°C overnight with shaking at 230&250 rpm.
iii. Spin down the cells by centrifuging at 14,000 rpm for 5
iv. Carefully pour off the supernatant and resuspend pellets in the
residual liquid (total
volume ~50 ml).
c. For semi-automated handling of a large number of samples:
i. Place a large (2&4-mm), fresh (2&4-day-old) yeast colony into
0.5 ml of the appropriate
SD liquid medium in separate wells of a 96-tube microtiter array.
Vortex each tube
vigorously to resuspend the cells. (Alternatively, use 0.5 ml of an
overnight SD liquid
culture instead of a yeast colony.)
ii. Using a centrifuge adapted for multiwell plates, centrifuge the
entire array at 1,000 x g
for 5 min to pellet the cells.
iii. Carefully pour (or draw) off supernatants and resuspend
pellets in the residual medium
(~50 ml) by vortexing or pipetting up and down.
2. Add 10 ml of lyticase solution to each tube. Thoroughly
resuspend the cells by vortexing
or repeatedly pipetting up and down.
3. Incubate tubes at 37°C for 30&60 min with shaking at 200-250
[Optional] Check a drop of the cell suspension under a phase
contrast microscope (400X) for the progress of
cell lysis by adding a drop of 20% SDS to the side of the
coverslip. As they come into contact with the SDS, most
cells should lose their refractile appearance and appear as
"ghost-like" spheroplasts. If there are still many intact
cells present, incubate the samples for another 30 min.
4. Add 10 ml of 20% SDS to each tube and vortex vigorously for 1
min to mix.
5. Put the samples through one freeze/thaw cycle (at &20°C) and
vortex again to ensure
complete lysis of the cells.
6. If necessary, samples can be stored frozen at &20°C. If samples
have been frozen, vortex
them again before using them.
7. Pour the entire contents of the tube from Step 5 above onto a
prespun CHROMA SPIN-
1000 Column and purify the plasmid DNA according to the CHROMA SPIN
User Manual.
Purified plasmid DNA will elute from the column.
If you do not use CHROMA SPIN Columns, clean up the prep as
a. Bring the volume of the sample up to 200 ml in TE buffer (pH
b. Add 200 ml of phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1).
c. Vortex at highest speed for 5 min.
d. Centrifuge at 14,000 rpm for 10 min.
e. Transfer the aqueous (upper) phase to a fresh tube.
f. Add 8 ml of 10 M ammonium acetate and 500 ml of 95&100%
h. Place at &70°C or in a dry-ice/ethanol bath for 1 hr.
i. Centrifuge at 14,000 rpm for 10 min.
j. Discard supernatant and dry the pellet.
k. Resuspend pellet in 20 ml of H2O.
Note: The amount of plasmid DNA recovered is small relative to the
contaminating genomic DNA;
therefore, it cannot be measured by A260 or seen on an agarose
另外：酵母菌落PCR方法
Pichia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法
模板的处理：
1.平板上的菌落长到肉眼可见时（约12小时）；
2.将除了模板之外的其它PCR反应液的组分准备好，并分装。引物最好使用Kit中已有的检测专用的引物，或者一条使用载体上的引物，一条使用基因的特异性引物（这样做可以鉴定非定向克隆的方向）；
3.用半根灭菌的牙签（节约，而且好用）挑取菌落，在PCR管中涮以下，放入一个灭菌的1.5毫升离心管，对PCR管和1.5毫升离心管编号；
4.PCR扩增，1％ 琼脂糖凝胶电泳；
5.对于PCR扩增显现特异性条带的克隆，把置于1.5毫升离心管中的半截牙签扔到5毫升YPDZ培养基中，30度培养，8－12小时后提质粒，酶切鉴定确认。
PCR反应体系：
以TaKaRa Taq DNA聚合酶反应为例，引物为5& AOX1 primer，3&AOX primer：
组分 20μl体系
10xReaction Buffer 2.0μl
dNTP 1.6μl
Primer 1（20pmol/L） 0.5μl
Primer 2（20pmol/L） 0.5μl
ddH2O 15.2μl
Taq DNA聚合酶 0.2μl
TOTAL 20.0μl
PCR反应条件：
初始变性 94℃ 4min 1
变性 94&#个循环
退火 50~54℃ 30s
延伸 72℃ 30s
结束延伸 72℃ 10min 1
保存 4℃ 1
如果筛选的是Mut+，将会出现两条带，一个是目的基因，另一个是2.2kb的AOX1基因，空质粒会出现以下条带（pPICZαA 588
bp)，将两者的大小加在一起来解释出现的实验结果。
我的结果是空载体的有大约580多的条带，但重组子的PCR只有将近1000bp的条带（我的目的基因是400bp），没有2.2kb的条带。
6其它一法：
1.Transfer 1.5 ml of liquid culture of yeast grown for 20 & 24 h at
30°C in YPD (1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose) into a
microcentrifuge tube. Pellet cells by centrifugation at 20,000 & g
for 5 minutes.
2. Add 200 μl of lysis buffer (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM
NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, pH 8.0).
3. Immerse tubes in a dry ice-ethanol bath for 2 minutes, transfer
to in a 95°C water bath for 1 minute. R vortex 30
4. Add 200 μ vortex 2 minutes.
5. Centrifuge 3 minutes, room temperature, 20,000 & g.
6. Transfer the upper aqueous phase to a microcentrifuge tube
containing 400 μl ice-cold 100% ethanol. Mix by inversion or gentle
vortexing.
7. Incubate at room temperature, 5 minutes. Alternatively,
precipitate at -20°C to increase yield.
8. Centrifuge 5 minutes, room temperature, 20,000 & g. Remove
supernatant with a pulled Pasteur pipette by vacuum
aspiration.
9. Wash the pellet with 0.5 ml 70% ethanol, spin down as described
in step 8 above. Remove supernatant.
10. Air-dry the pellets at room temperature or for 5 minutes at
60°C in a vacuum dryer.
11. Resuspend in 25&50 μl TE [10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH
8.0)] or water. Samples obtained directly from plates should be
resuspended in a 10 μl volume。
酵母表达外源蛋白的注意点和相关检测
用GS115表达不出蛋白，换KM71H后，大部分克隆能表达。
　在28度和室温下诱导表达，表达水平可能都不低。
手册上用6.0，pH提高到6.8，不表达的蛋白可能就表达出来。BMMY的pH7.0-7.5比较合适。国内外做的最好的rHSA，最适pH大概5-6左右。pH3的时候yeast和peptone好像会沉淀的，可以用磷酸和磷酸二氢钾调，具体比例自己去试试。
4、偏爱密码子
bias一般不是主要的问题，你要表达的蛋白特性才是主要问题，酵母对分子量大（30KD以上），结构复杂（如一些蛋白酶），二硫键含量多的蛋白往往不能有效表达，尤其是分泌表达。密码子改造对一些较小的而且结构简单的蛋白表达量的提高可能有一些作用。比如一位战友用Pichia酵母表达一个单链抗体，29KD，含有2对二硫键，表达量约几毫克每升，选用酵母偏好密码子全基因合成后，表达量没有什么提高。
5、表达时间与空质粒转化对照
诱导时间长了以后，是会有很多蛋白分泌出来的，时间越长杂蛋白就越多，且分子量都比较大。最好做一个空质粒转化的对照，这样就会比较肯定到底是不是自身的蛋白分泌的结果。
每个样品从G418板上挑10个左右单克隆于2ml
BMGY摇菌（30ml玻璃管，比LB管大一点），纱布一般用8层，一天左右看着比较浑离心，留样1ml，余1ml换2ml
BMMY诱导表达，3,4层纱布足够了。
污染一般都是跟瓶口覆盖有关的原因造成的，只盖纱布肯定会污染。加盖报纸后，就再没遇到过污染。如果只用6层纱布，污染的可能当然很大，100ml三角瓶，装量10ml培养液，用橡筋把8层纱布和2层报纸拴紧封口，空气浴摇床。
蛋白有没有表达就要看你的运气了，一般重复2－3次实验都没有表达菌株，这个蛋白就放弃表达了。
30KD,10mg/L表达量已经很高，最直接的方法是发酵，一般提高5－10倍。大肠杆菌一样出现大团的超表达蛋白。
酵母分泌表达的N糖基化是可以预测的，有如下序列：N X
S/T就是潜在的糖基化位点，X为任意氨基酸，1个糖基化位点会加上1－3KD左右的糖基。另外可能还有O糖基化话，但是无法预测其位点，不过很少听说表达蛋白有O糖基化的。如果胞内表达，不存在糖基化的问题。
10、表型与表达
重组SalI和BglII酶切产生单交换和双交换，结果就是产生Mut+和Muts表型的菌株；前者在甲醇诱导表达时生长快，消耗的甲醇多，后者生长慢，消耗的甲醇少，所以诱导表达时Muts表型要求更高的菌体浓度。一般用Mut+表型的较多，但是对某些蛋白Muts菌株可能表达的更好，只有试试才知道你的蛋白用那种菌株表达较好。
11、培养基
YPD：最基本的培养用；BMGY：诱导表达前培养用；BMMY：诱导表达用；MD：电转化后筛选his＋用。
YEPD是不能代替BMGY的，因为有葡萄糖，这样残留的葡萄糖会影响下一步的诱导表达。不过有一种方法是可行的，就是用YPG培养基代替，只是把YEPD中的葡萄糖用3%的甘油代替，也可以降低成本。摇瓶毕竟不能和发酵罐比，甘油残余会抑制甲醇利用。
BMGY、BMMY灭菌后才能加甲醇、磷酸钾、生物素。配制BMMY时也没必要用5%过滤除菌的甲醇，在灭菌后使用前加100%甲醇至你要的浓度。
YNB可以高压灭菌，没问题的，也可以0.22um过滤处理，天冬氨酸和苏氨酸要待培养基高压灭菌后加入；配YPD时可以加入YPD一起灭菌，但时间不能太长，温度不能太高，一般121-125度12-15分钟足够了。若时间过长，温度过高，可能导致YPD焦化。glucose和含氮化合物在一起容易产生美拉德反应，这是配制培养基中的禁忌。颜色很深的话，基本不能使用了。或者含有葡萄糖和/或YNB的培养基108度35min高压灭菌。
小量发酵其实可以把培养基成分中的YNB和生物素去除，培养基价格便宜，操作又方便，可以直接灭菌，效果也很好（效果不比含YNB的差）。
如果是用自己配置的培养基，如玉米浸提液、麦芽浸提液、麦麸浸提液等等，可以不用换液，采取添料来维持酵母对培养基的营养需要。
用无机盐进行大规模发酵，更省钱。
大规模发酵时，甲醇的流加速度增加不要太快。另外使用纯氧并不昂贵，在武汉买个钢瓶600元左右，一瓶纯氧20元。一个批次100h左右估计3－4瓶氧气。
关于Tryptone和Peptone的选择：
1）用培养E.coli的Tryptone替代Peptone对有些酵母菌可以,例如一般的表达酵母.但是对有酵母菌些绝对不行.例如做双杂交的AH109,Y187之类表达酵母，根本就长不好．
2）Tryptone和Peptone虽然都是营养胨，但营养成分不一样．即使是一般的表达酵母可以在Tryptone生长，生长状态也没有在Peptone中好．但tryptone和peptone就是含量上有点不同外，其他没什么区别，用peptone的目的不是为了提供氮源，提供氮源的是培养基里面的YNB。
3）如果要求不高，一般使用也还凑合．尽可能的用Peptone，difco公司的，晶美公司代理的，甚至是其它国产的蛋白胨都可以很正常的培养绝大多数酵母菌．
4）用含Peptone的培养基颜色很深，纯化表达蛋白时颜色要去掉，所以还要进行麻烦的后续处理。而改用Tryptone后，培养基颜色变得很浅，和LB（液体）颜色差不多，后续处理要简单些。invitrogen说明书说
peptone的作用是防止目的蛋白被一些酶类水解，加入peptone的目的就是竞争性抑制目的蛋白的水解，因为peptone是一些小的短肽，是一些酶作用的底物。
培养毕赤酵母,书上说BIOTIN储液是水溶液,但事实上BIOTIN很难溶于水, 可以稍稍水浴加热一下。配制500&BIOTIN
stock solution（0.02％）有这么3种方案：
1）、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；
2）、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；
3）、水浴加热，温度不能高于50度。
D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。MD、MM属于基础培养基，没有哪种成分会含有微量生长因子（如生物素）。所以肯定要加的。
附：无机培养基配方
BSM无机培养基：
85% H3PO4 26.7ml/L
CaSO4 &2H2O 0.93g/L
K2SO4 18.2g/L
MgSO4&2H2O 14.9g/L
KOH 4.13g/L
甘油 40g/L
PMT1 4.0ml/L
100%氨水调pH5.0(1瓶50ml加800ul氨水)或10g/L硫酸铵调pH5.0，氨水用于上罐调pH（便宜，方便）。诱导表达前调pH6.0。pH5.0是为了防止BSM形成磷酸钙沉淀，pH6.0是表达HSA融合蛋白的最适pH。
BSM高压灭菌后再加4.0ml/L 过滤除菌的PTM1(微量元素)4.0ml/L 。100%的500ml甲醇加6ml
PMT1，用于补加甲醇诱导表达目的融合蛋白。
PMT1（1L）配方：
CuSO4&5H2O 6.0g/L
KI 0.088g/L
MnSO4&H2O 3.0g/L
Na2MoO4&2H2O 0.2g/L
H3BO3 0.02g/L
CoCl2&6H2O 0.5g/L
ZnCl2 20.0g/L
FeSO4&7H2O 65.0g/L
Biotin 0.2g/L
浓H2SO4 5.0ml
12、蛋白降解
分泌表达的目标蛋白比胞内蛋白确实容易被降解。可以尝试以下几种办法：1、尽可能降低培养液的pH值减少酶活，酵母生长pH值比较广，4～7都可以试一下；2、多试几种蛋白添加剂，充当酶解底物（比如酵母酸）；3、摸索最适下罐（摇瓶也一样），宁可少表达点也别给降解光了。实在没办法，只好换菌株或做pcr突变酶切位点（当然不能影响表达和蛋白活性）。
Several strategies have been reported as effective in minimizing
the proteolytic instability of specific foreign proteins secreted
into the P.pastoris culture medium.
1）、The first is adding to the culture medium of amino-acid rich
supplement such as peptone or casamino acid, which reduce product
degradation possibly by acting as execess substrates for one or
more problem proteases.
2）、The second strategy to minimize proteolytic degradation is to
optimize the culture pH between pH 3.0 and pH7.0.
3）、The third strategy involves elevating the level ofammonium in
the culture broth adequately, which is explained by the hypothesis
that portease activity is induced under nitrogen starvation.
The forth strategy is let the culture temperature 28 deg instead of
连续两个或两个以上的碱性氨基酸相邻的结构，如果有的话，在这一位点是很容易被蛋白酶切断，产生偏小的多肽。
通常用BMGY和BMMY是要换液的，但也可以不用换液。培养到菌液浑浊后，直接向BMGY里加甲醇诱导就行了。GS115在第4天达到了最高表达量。换液不是必要的，适量甘油的存在有时反而会使表达量提高，
10ml生长培养后，等体积换液。我用250三角瓶，装量25mlBMGY发酵2天，再取0.5ml加入BMMY（250三角瓶，装量25ml)中诱导发酵.
BMGY和BMMY的换液方式有2种：
1）一种是离心换液，即在生长培养结束后，转移到灭菌大离心管中，4000rpm室温离心5分钟后，用BMMY洗下菌体，再转移到摇瓶，整个过程均用灭菌移液管操作。另外2）一种是静止换液，即在生长培养结束后，将摇瓶在无菌室静止4小时后，直接在酒精灯旁倾倒培养液，再加入诱导培养基，此种方法的缺点有少量生长培养基残留。
是离心换液或者静止换液，到底那个好，只有根据自己的实验结果来考量。如果只是从防治污染的角度来说，静止换液也好一些，因为操作毕竟少一些，速度也快。
总之，无论是取样还是补料、加甲醇，尽量用灭菌的移液管（因为比较长，不容易引起污染）。当然，微量的如200ul，还是用移液器加（快而准确），可以在瓶口处往瓶内加入100％甲醇等。用新开启的分析纯甲醇，我们都没有过滤或者其他处理，一直放在无菌室里面，每次直接用灭菌TIP吸取加入摇瓶就可以了。实验室里也有人试过用膜过滤，结果膜都溶解了。
14、上罐表达
放罐时OD能达到400左右，生长过程最高OD500左右，重组蛋白发酵水平大约300-400mg/L。30g/L甘油初始培养OD约40左右，流加约420g/L甘油后，菌体密度达到最高约500。开始诱导后，起初3－5h之内流加的甲醇很少，发酵体积变化小，但是菌体的OD值是快速下降的，一般是原来的90%左右，每次都是这样，确切原因我们也还不清楚，估计是酵母从高速生长转向营养饥饿过程中，菌体形态发生很大变化，比如大小、含水量、折光率等。随酵母逐渐适应利用甲醇为碳源，mut＋型酵母的诱导可以将甲醇的流速逐步提高，此时仍然能发现OD值下降，我们认为这主要是发酵体积增加的原因造成的。我们诱导过程一般增加约40%的体积7L到10L，最终OD值约为最高OD值的80%左右，简单换算一下，应该知道菌体生物量增加约1/7。其实，这和毕赤酵母代谢甲醇途径也是一致的，甲醇首先被氧化成甲醛，一部分继续氧化成甲酸进而生成CO2，产生菌体所需的能量，另一部分可以被菌体同化，进入小分子碳架的合成途径，提供菌体生长所需的碳源。
15、菌体密度：
菌体是在BMMY中培养的，可以不用BMMY做对照，在600nm处测OD值，培养基和PBS光吸收都很低，PBS更方便。
麦芽浸提液培养酵母（不换液，补料），生长阶段结束后，密度可达到10-12，诱导培养结束后，密度可达到18左右。
如果用1体积的BMGY，在生长阶段结束后，换液时，加入1/10——1/2体积的BMMY进行诱导培养（即浓缩培养），细胞密度也可达到20以上。
通常，真正的高密度发酵只有在发酵罐里才能实现，OD600可达到40-60及以上。摇瓶很难达到那样的密度，不过可以采取浓缩培养的方式实现高密度。
摇瓶不能像发酵罐那样保证通气量，但可以通过装量来暂时替代这个指标。
17、菌种保存
用15%甘油做保护剂，-70度长期保存，-20度短期保存使用。不过要注意冻存前一定充分混匀，酵母菌体很容易沉降到EP管底部，保存效果大打折扣。
一般OD2-6的YPD过夜菌吸取300ul菌液到灭菌的ＥＰ管然后加等体积的甘油，混匀，放于－２０度．保存长的话最好放－８０度冰箱。
重组菌株传代次数太多，确实可能存在菌株退化的现象。这在用动物细胞表达系统如CHO，NS0系统更为明显，所以一定要保存好最原始的重组菌株，每次从中划板，挑单克隆表达，尽量减少菌株传代次数。不行的话再用相同的方法重新转化筛选高表达菌株。
GS115的鉴定方法
接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布 YPD平板，30℃培养48 小时，用
YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。GS115的his4基因突变了，不能在组胺酸缺陷型培养基上生长，一般的YPD培养基营养丰富，什么都有了，而YNB却只含基本氮源，GS115应该在上面不长，就是从YPD上挑菌落，在YNB和补充了HIS的平板上对应的点一下，在HIS上长而YNB上不长的是GS115，这样能挑到纯的，以防突变。
"用P.pastoris进行胞内表达时，外源蛋白都是储存在过氧化物酶体里吗，一点也不会泄漏到胞浆中？
酿酒酵母和其它酵母都是这样？
如果我想让表达的外源蛋白分布在胞浆中，我该怎样做。 "
自问自答：
用P.pastoris进行胞内表达时，外源蛋白是在胞浆里而不是在过氧化物酶体里，只有给外源蛋白连上定位于过氧化物酶体里的信号肽才能将蛋白定位于过氧化物酶里
如何判断何时使用含有硫酸铵的YNB,何时用不含硫酸铵的YNB?我是用PIC9载体在GS115中表达膜蛋白.
说明书没有看的太明白.见笑了.
10&YNB （100ml）
13.4g的YNB（含有硫酸铵）
3.4g YNB（不含硫酸铵） 和 10 g 硫酸铵
看了毕赤酵母表达系统的说明书，还是不明白a因子信号肽＼XhoI的两个酶切位点以及Kex2裂解位点之间的关系．我想用pPICZaA分泌表达蛋白，打算用XhoI和XbaI两个酶切位点，说明书里讲用XhoI可使蛋白具有天然Ｎ端，但这样会不会破坏信号肽，蛋白还能分泌表达吗？对表达蛋白的结构有没有影响？另外，还想请教一下如何确定是否有读码框移位？紧急求助，希望各位高手能帮助解答，谢谢．
用XhoI可使蛋白具有天然Ｎ端，不会破坏信号肽，这需要你在以xho1为酶切位点时，在引物上－－－补齐它之后的部分信号肽序列后－－－再直接缀上你的目的基因。而不是直接从XhoI位点就直接加入你的目的基因。你可以从相关文献上看看其它基因的具体做法。
确定是否有读码框移位，是要根据毕赤酵母表达系统的说明书pPICZaA的读码框，结合你目的基因本身的读码框来推导。
挑取单克隆菌落 点与MM板长到菌落明显肉眼可见，用灭菌的硝酸纤维膜贴上再让菌落长过夜，取下膜37度烘干，后面加奶粉封闭
一抗后封闭加二抗 后显影 后续同WB步骤一样。
我发现最近以来，又有很多新手开始做毕赤酵母表达的研究了，大多数都在讨论重组，电转化，筛选等问题，其实我也是才从迷惑中走过来一年的，现在觉得这些并不是最难的问题。
难的是阳性菌得到后，发酵证实产物发酵，表达的问题，纯化的问题。
但是这方面的问题和讨论确不多，只做构建是不完整的，表达纯化，得到一个最终的结论才有意义。
我对发酵问题感觉头疼，我的目的产物也很少（或者说还没有确定）， 我开始用的是5ml 的BMMY
在2.5cm口径的大试管中发酵的，曾做过一种基因工程抗原的表达，这对于用elisa检测是足够的，但发酵液直接跑电泳后，用western
blot 检测，很难检测到，用硫酸胺浓缩10倍后，跑电泳后，用western blot 检测才能看到。我还尝试过用100ml的BMMY
在500ml三角瓶中诱导，结果也不理想。
我现在做的是一种蛋白酶(没有太多的创新性，因为类似的从产品到文章，都做成了，而且有的产量和效果还不错)
。实验室没有条件上发酵罐，只能用三角瓶摇，但是这样发酵条件就很不好优化控制，产量也不知道会有多少。
酵母发酵液中有不少其它蛋白酶，所以跟底物作用，必须进行发酵液纯化后才能研究酶活，菌早就OK了，就是诱导培养，纯化不好，酶切了几次，没有明显的正确作用证明，有几次用的阴性对照发酵液上清也把底物降解了。耽误了几个月也没有得到满意的结果。
今天希望的结果终于出来了，用的是新发酵的上清液，也是用5ml 的BMMY
在2.5cm口径的大试管中发酵的，sds－page电泳显示，底物被清晰的切割成了需要的条带了。下面想多做点，纯化一些。
我决定严格按手册来做：
1.首先是依据目的蛋白的特性，选择用MM ，BMM，BMMY 做为诱导培养基。
2.要确定 MUT+ 或MUTs，然后根据不同的条件来诱导发酵，英文操作手册上关于这两种表型的发酵策略是很不相同的。
3.通气一定要好，发酵体积不能超过摇瓶体积的10%，所以我决定用1L三角瓶做。
&最近刚开始作Pichia酵母表达一个7ｋＤ的蛋白，遇到一些问题，请各位高手指点。
我想将我的目的蛋白放入pPICZaA，选用了EcoRI和 NotI这两个酶切位点。这里有两个问题请教：
１．在Kex2 和Ste13消化后，我的目的蛋白的N端就会多出两个氨基酸，这多出的两个氨基酸会否影响我所需蛋白的活性？
２．Parental vector的C端有myc epitope and polyhistidine,
有二十多个氨基酸，会否影响我所需蛋白的活性？因此我想去掉myc epitope
，在我的引物中人为加上六个histidine，这样我的引物就太长了，会不会有问题。
多谢各位的参与和指点。
多出两个氨基酸一般不会蛋白的活性，在我的总结里有，大家多看，是个宝库啊。当然还要看你的蛋白质N断氨基酸是否是活性关键位点。你可以在目的基因上游用XhoI再加上KR，避免Ste13酶切，切的更干净，个人观点。
59bp引物都不算太长，但是要看你的目的片断和所用的聚合酶，如果用Pfu酶，建议你扩增的目的片断最好在1000bp以内，如果超过1500bp，可以使用重叠延伸PCR扩出全长片断。
想请教各位高手,我用GS115,pPICAZaA,分泌表达一个小肽,经过SDS-PAGE在相应分子量处出现了目的条带2.7KD.不过奇怪的是,0时刻的对照也就是未更换培养基的BMGY培养中也出现了该条带,只是没有添加甲醇后的颜色深.我在帖子中看到"通常用BMGY和BMMY是要换液的，但也可以不用换液。培养到菌液浑浊后，直接向BMGY里加甲醇诱导就行了。换液不是必要的，适量甘油的存在有时反而会使表达量提高."这样的话,不知道是否不添加甲醇,目的蛋白也可被表达呢?
(1)在0时刻,对照和表达的在同一位置都出现条带,不一定是同一个蛋白,有可能宿主菌在这一位置有表达蛋白质
(2)换溶液的目的一个是为了浓缩生长的酵母菌,另一方面也是为了加入甲醇可以更好的诱导.如果更科学的话,不妨两个方法都做一下比较
(3)一般说来,甲醇在不诱导的时候是不会表达的
(4)可以进一步做Western或Elisa验证
首先谢谢你回复我的帖子!我能确信该位置条带是我的目的蛋白,至于换培养基的目的我早已知道,我只是想知道在添加甲纯诱导的条件下,目的基因是否有可能被表达,因为我在其它文献中也曾经看在未开始诱导的0时刻处,也有条带,只是不很明显罢了,我想知道各位战友是否在做实验过程中出现过同样的现象.
请教一个比较菜的问题：酵母表态时为什么先要接种YPD培养后再BMGY培养基培养24h然后再接种于BMMY，直接接种于BMMY不可以吗？
YPD培养基是种子培养基,BMGY培养基是为了使菌体生长,提高生物量的，因为目的蛋白的表达水平与生物量的高低有很大的关系，而当表达目的蛋白时,为了使表达量尽量的高,因此较高起使生物量较为有利,此外表达目的蛋白的时候多数营养用于合成目的蛋白.因此不利于菌体自身的生长.BMMY培养基中是以甲醇为唯一碳源的，在此诱导条件下，可以诱导AOX1启动,使位于其下游的目的基因开始表达.
关于酵母分泌表达菌株的高产筛选，如果产物具有可westernblot检测的特性，是最为方便的了(用G418或Zecion也是不错的办法)。
去年表达的一个病毒囊膜糖蛋白的实验就是采用了westernblot的筛选方法，很好。将所有的His＋转化子，先是点对点（不实用影印法，而是用牙签单菌落挑的，工作量很大，一定要做好编号）做好原种，铺有NC膜（用铅笔划有格子）的MM（或BMMY等诱导的都可以）板诱导种平板（倒置平板，每天补甲醇，依靠甲醇挥发上升可使NC膜保持一定适度），培养约4天，揭起NC膜，洗去菌落后做westernblot检测，显色的有无以及深浅可以基本判断出阳性菌及其产量高低（如图片），对于显色较深的可以再做摇瓶发酵，用96孔板Elisa法精确判断产量高低，或SDS电泳检测。
你好!象你请教下下,我用的是PPIC9K(ECOR1+NOT1插入我的目的基因,设计自带有6个HIS标签)载体,用SAL1线形化后电转入GS115,当时2天只长出两个菌,挑了做表达,第3天板上又长出许多菌但比前一天的小,这是假阳性的吗???没敢用,仍然用第二天挑的两个菌做筛选,在2mg/ml的G418都能生长，继续作表达,跑SDS-PAGE发现跟未诱导的菌体比诱导后的菌体明显有一个表达带，大小和我的目的蛋白差不多，诱导后上清（冻干浓缩后）有一个非常弱的带位置稍大（可能是电泳没压下去）．然后我扩大４倍体积又做了一次，效果并不明显，上清条带仍较弱（浓缩同前），上柱子后在１５０mM咪唑有个０．４７８的峰，但电泳效果仍不好，不知是上样浓度大还是什么原因，Ｍarker都挤歪了．纯化条带仍较若（需仔细辨认才行），另外，提酵母基因组做ＰＣＲ和提ＭＲＮＡ做ＲＴ－ＰＣＲ均没作出，不知道该怎么办了，望指点！！　　　　　
我感觉你可能没有筛选到阳性菌株，有几个问题要注意：
电转化只长两个菌（MD板？），转化效率太低，搞不好是假阳性。想办法优化条件提高转化效率比较好。这个我想在所有的步骤中最重要的一步。
没明白你说的PCR是没作出来还是阴性结果？GS115阴性对照怎样？用的什么引物？如果你用5'AOX和3'AOX引物能扩增出2.2Kb酵母菌株本身条带而没有其他条带，才说明是阴性结果。用ＭＲＮＡ做ＲＴ－ＰＣＲ鉴定阳性菌株是“舍本逐末”的做法，我还没听说用这个方法鉴定阳性菌株的。
没确定目的蛋白有表达之前最好不要做纯化，不然浪费时间。要是纯化后看不到你的目的蛋白，分析原因比较麻烦，很难确定是本来就没有表达，还是表达量太低没有挂柱。
单纯的表达上清电泳不是鉴定目的蛋白表达的好方法，除非你的蛋白表达量超高（100mg/L？)。酵母实际上可以分泌一堆蛋白到表达上清，可以找找前面的帖子，TCA浓缩后的上清可以看到很多条带。另外你的对照也不对，不能拿诱导后的菌体和跟未诱导的菌体比，应该用GS115菌株或者GS115转化了pPIC9K空载体和你的阳性菌株在同样的条件下表达，如果在相应的位置GS115没条带而阳性菌株有条带才有可能是真正的表达条带。
5. 既然你的目的蛋白加了Histag，最好用抗histag的抗体，用Western,Dot
blot或ELISA鉴定表达上清。如果有自制的或公司的抗你的蛋白的单抗或者多抗也可以。个人推荐用Qiagen的抗histag单抗，虽然贵点，但性价比超好！好像4000块左右，0.5ml，可以1：00稀释。买好的抗体比浪费时间和其他试剂强。上清ELISA灵敏度在1mg/L左右，Western灵敏度更高。
上柱子后在１５０mM咪唑有个０．４７８的峰，但电泳效果仍不好，这个峰很可能是酵母杂蛋白或者培养基中一些挂柱的小分子的峰。如果表达上清直接挂柱更明显，透析后会好一些，你可以拿点GS115空菌株表达上清试试，估计也有一个峰。
胡哥，感谢您提供的载体和菌株，我已将重组载体转到GS115中，菌落PCR得到目的条带，挑单菌落BMGY培养24(OD600=12)小时后，离心收集菌体，加BMMY洗涤后，用BMMY调OD600=1，诱导4天，每天加甲醇至0.5%并取样，但做SDS-PAGE电泳没有看到目的蛋白。我又重新做，这次用BMMY调OD600=30，诱导4天，每天加甲醇至0.5%并取样，仍然SDS-PAGE电泳没有看到目的蛋白，能帮我分析一下原因吗。
我又取诱导后的菌体涂在载玻片上，做免疫酶反应，在镜下只看到个别的酵母染色，不知是何原因。请指点。
还是同样的问题，表达上清直接电泳根本就不是鉴定蛋白表达的好方法，除非蛋白表达量很高。通常电泳都跑的比较模糊，看不清特异条带。如果是1mg/L表达量，电泳最多上50ul，也就是0.05ug，基本上超过了考染的检测极限。如果大于10mg/L电泳才勉强能看到条带。很不幸，大部分的重组蛋白在普通摇瓶条件根本达不到这个表达量。很多文献讲的高表达都是指发酵条件，并且优化了表达条件的。试试TCA将0.5-1.0ml表达上清浓缩成20ul跑电泳，看能不能检测到目的条带。
你说的酵母免疫酶反应，我没用过。你确定这种方法对毕赤酵母适用？不过你的表达条件有些问题。GS115转化子一般都是Mut+，用BMMY调OD600到30已经是很高的菌体密度了，再诱导4天，表达量不会有太多提高的，估计大部分菌株还没来得及表达目的蛋白都挤死了，空间太小，营养不足，养气太少，代谢废物积累的太快。
另外注意诱导表达的问题，不能超过30度，虽然酵母32度都不死，好像有时候目的蛋白表达对温度很敏感，尤其是高温，我一般都设定27－28度。
您试过每天添加甲醇到2%吗?
试过，表达量第1-2天差不多，第3天后降得厉害，估计是因为甲醇累积得毒性。不过不同蛋白可能不一样。
您好！我用TCA浓缩的上清跑了电泳，条带太多了。看不清楚哪条是表达的，做的WESTERN条带位置在30几KD，而我的片段1257KB,按理说是48KD,同样浓缩的空9K上清没有条带出现。这样算是表达吗？我是做的融合表达，分别用了两个抗体做，都是这样。搞不明白了！
还有，我想请教您，有人说做二次电转化能提高表达，您试过吗？
无非就两种情况，一种是你的融合蛋白表达了，但是不稳定，降解了，另一种是没有表达，30几KD条带是非特异条带。多设些对照，看是那种情况。
二次转化提高表达量，原理也是提高目的基因的拷贝数，问题是拷贝数对很多蛋白表达量没有什么明显影响。你得用两种不同抗生素的载体，比如pPIC9K和pPICZalphaA分别转化。
各位战友，我最近在做毕赤酵母表达一个60KD左右的蛋白，但是一直没有成功，大致情况如下：
目的片断是我经过密码子优化后通过PCR搭起来的，构建入pPIC9K载体，测序确认阅读框正确后，电转化到GS115菌中，经PCR鉴定确认阳性，在G418抗性培养基上筛选为阳性的克隆，用BMGY/BMMY诱导表达三天，TCA沉淀上清，细胞都电泳观察，与空质粒转化的阴性对照无任何差异
我的蛋白pI大约5，诱导的培养PH为6，这个是否对蛋白表达影响很大呢？
还有一个奇怪的问题，质粒线性化用SacI或SalI进行的，表型筛选在MM平板上菌的生长速度都比MD上慢很多（我是用菌液在MM，MD平板点的），看了园子里有几位战友也曾经出现过如此情况，但是似乎没有得到回答，还请各位战友支招呀！
想办法搞到抗体做Western看看，可能表达量比较低，电泳看不清楚。
pI为5的蛋白很正常啊，培养基PH值不应该是严重的影响因素，如果你用的BMMY培养基，里面有很多组分，可以防止蛋白降解。
手册上都说了，SacI和SalI线性化90％以上（记不太清了，肯定是绝大部分）是Mut+表型，挑个十个八个克隆，基本上都会是Mut+，筛选表型意义不大。MD板是葡萄糖作碳源，YNB作氮源，相当于酵母的最营养的生长条件，MM板是甲醇作为碳源，YNB作氮源，酵母需要AOX基因先代谢甲醇，然后才能用作碳源，就像营养不良，当然长得慢了。反正是技术难度比较高，真要鉴定表型，可以用PCR。
用毕赤酵母表达外源蛋白，不仅原核的基因，甚至是真核的基因表达，如果想提高产量的话，条件允许的话一定要尝试优化基因。
另外一个限制因素就是：整合后外源基因的拷贝数的差异也会造成产量的巨大差异，所以不能保证仅仅优化基因后就可以了。还需要摸索不同外源基因的拷贝数的转化子具体发酵产量的高低。当然，先要筛外源基因的拷贝数高的，不过拷贝数中等的也不易轻易放过，因为也有报道说如1mg/ml
G418上的转化子，比2或4mg/ml G418上的转化子的产量高。
这方面的专门研究比较少，而且工组烦重，一个人或者一个实验室也不可能解决这个问题，所以需要做相关工作的人的点点滴滴的贡献。特别是有的实验结果在目前的实验条件下不容易定量，往往是粗略的经验。所以，自己有经验了也可以判断出研究报道的可信度。多看看可信的研究报道，从经验中得到收获与提高。
所以有的时候筛选工作烦重，很多时候需要运气。有很多例子，表明优化后产量可以提高，甚至是几十倍的。
full-length
优化,我做的也是500－800bp左右的几个，我见过的相关的资料上说最多的一次能做到1300bp左右的。我合成的都在每条40－50bp之间，因为一般公司合成引物大于50bp的价格就贵一个级别了，而且合成的越短出差错越少，长了质量难保证（有不少人说即使平常合成短的引物也会有碱基错误的），所以要找个信誉好，质量好的公司合成。730bp的基因我就分了34条去合成的，然后34条全部混合，直接一起扩，按上文的方法就弄出来了，并没有像husiyi那样，先取其中的分成两部分扩，然后再扩全长的。
其中有的500bp左右的一轮，一次就得到了正确的，730bp的一次最好是有一个克隆只有一个碱基置换突变。常见的是单个碱基的缺失（连续缺失几个的不常见），单个碱基的置换突变。多送几个去测序，可以提供更多的校正突变的可能方案。
我觉得出现突变可能跟合成基因的长度有一定正比关系，合成短一点的容易，突变可能发生的会少，所以如husiyi那样，然后用overlap
得到全长，也有优势。但是我建议合成800bp一下的，可以像我这样，一次做，如果合成超过1000bp,还是用husiyi的方法可能会保险些。但是一定要仔细对照测序图（以图上的峰为准）来最终确定正确与否，有好几次，我都遇到过图上有的没有读出来或者读多了。
zybysh：你好！
你做了酶切的阴性对照（有条件也做一下阳性对照）没有？就是不含你的目的基因的酵母发酵液。用菌液（含有菌体）和离心后的上清检测酶活相差甚远（有多大？）菌液（含有菌体）做酶切，起作用的还是培养液中的酶呀，离心不会使分泌到上清中的酶损失的。菌液（含有菌体）做酶切胞的产物也不大可能参与作用。所以我有点不明白，建议你最好能做一下进一步确证，直到纯化出目的蛋白拿出最终的表达证据。
我参与做过一个优化对比的（一种基因工程抗原），最高表达株发酵后，上清用Elisa检测，估计产量增加了30倍左右。
关于优化基因，虽然成功的例子很多，但我还是有些疑惑，那就是全优化合成，会不会遇上新密码子序列造成的核酸一级结构改变引起的高级结构改变后，造成复制，转录，翻译过程中的困难，因为毕竟经过自然进化后的天然基因序列的还是合理的。所以我也赞成，研究了基因某些密码子的在不同生物中的偏好性后，局部优化，也未尝不是个更好的办法。然而在现有的条件下，研究这些规律很复杂的东西，估计也很少有人涉足。所以，只有靠做，实践来检验。
我想请教一下，我用GS115表达生长激素，已经做了3个多月了，一直没有表达，看见有的帖子说GS115表达不出来的蛋白，用KM71表达就可以了，使这样子吗？另外BMGY和BMMY培养基的PH值对蛋白的诱导表达有影响吗？我以前培养基中加入了PH值为6的磷酸钾缓冲液，但是蛋白也没有表达，我需要把PH值调到几阿？希望有经验的大侠给点帮助阿。
我当时做表达的时候，确定是用GS115表达不出来的时候用KM71表达就成功了，但降解的很厉害。
我建议你做一个pH值梯度，以确定一个合适的值进行诱导表达，还有就是诱导表达的温度，也进行一下考查，适当降低温度进行诱导也可能改变实验的结果。
大家好，我也做GS115和载体pPIC9K，菌落PCR没有问题，不用特殊处理，挑取菌落溶于水10微升，取其中的5微升做模板可以得到条带。基本证明转化成功。
但是在G418筛选时，只有表达蛋白小的在1mg/L上筛选得到，大的蛋白所有的G418浓度上都没有。
小蛋白在做SDS时上清中出现了条带，但是只有一条带，也有诱导时间的差异，不知道能否说明表达了。
但是大蛋白上清中没有任何条带，沉淀中有和目的蛋白大小相似的条带，但是没有随着诱导时间延长没有差异，是不是GS115本身的蛋白呢？
说明下两个目的蛋白应该都是膜蛋白，是否可以在上清中表达呢？
大蛋白的情况说明了什么呢？是否这个菌株不适合呢？
请大家务必帮帮忙，正在对这个结果进行分析，因为要毕业了，论文中只能分析原因了。谢谢大家了。
膜蛋白,就是说有跨膜区了,那样子当然不能分泌了,都结合在细胞膜上了,应该把扩膜区去掉,才有可能分泌到上清里面!!
想请教一个比较弱智的问题。毕赤酵母表达时用的BMGY和BMMY培养基的PH值怎么调啊？是只调磷酸缓冲液的PH值还是调整个培养基的PH值？如果是后者，那是否要过滤除菌，因为培养基里的生物素等成分不能高压。我试过调整个溶液的PH值，结果PH7及大于7时都出现了沉淀。还有我表达蛋白的等电点为6.25，我调PH的范围应该是多少？希望能给予指点。
只调磷酸缓冲液的PH值。另一个方法，用氨水调，
大家好！我做毕赤酵母表达作了3个月了，是什么结果都没有得到。卡在了酵母转化子的检测上面。PCR做不出来，就尝试了直接诱导表达几个转化子。
蛋白胶结果菌体的带型很淡，基本上没法辨认。上清我用3倍体积丙酮沉淀，500微升上清的蛋白全部点样，在116KD处有一条明显的带，没有加甲醇诱导的对照很淡，加甲醇的很浓。而且做得9K转化子也有。
我的目的带应该是90KD，用的sal 1为点线性化，载体是9K.酵母菌GS115 。
有些怀疑那个上清里的116KD蛋白是醇氧化酶，但是从NCBI上面查的是663 AA，那估计也是70KD左右吧。
哪位高手知道这个116KD的蛋白是什么啊？
我们互相探讨一下啊。9K-GSII5在没甲醇诱导前考马检测已经有蛋白表达了。在60KD位置有浓带，与我的目的带70KD位置很近。你说的醇氧化酶可能70KD左右，我通过expasy的pI/Mw预测是6.67/74770.77，看来有必要用一些其它检测方法了。
巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解机理及其控制策略
1 巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解机理
在外源蛋白的表达过程中，宿主菌毕赤酵母的胞内和胞外均有一定量的蛋白酶的表达，因此，不论是胞内表达亦或是分泌表达，大多数外源蛋白均面临着被降解的问题，这也是影响表达量的一个重要因素，同时，还增加了纯化目的蛋白的难度。近年来，蛋白酶的研究是P.pastoris表达系统一个重点和热点。越来越多的蛋白酶的遗传背景和生理生化性质得到深入的研究[52;
53]。P.pastoris能根据细胞生长环境（碳源的改变以及细胞或细胞器的胁迫）来调整自身酶系，以合成与降解不同的蛋白和细胞器，液泡是蛋白质降解最主要的场所[54]，另一降解场所是细胞基质蛋白酶体中。但是，对于外源蛋白来说，其降解常在表达和分离纯化的第一步，主要是由培养基中胞外蛋白酶，细胞外膜结合蛋白酶（cell-bound
proteases）[55]和细胞自噬或裂解释放的胞内蛋白酶降解的[5]。胞内蛋白酶主要涉及降解蛋白质前体产生活性蛋白；切除转运出膜后的蛋白质信号肽；使调控蛋白失活；降解变异或不需要的蛋白质；提供营养，前体和能量。胞外蛋白酶分泌较少，主要降解部分蛋白质提供氨基酸和多肽等营养[22]。
根据蛋白酶的分泌和作用地点，P.pastoris的胞内蛋白酶可以分为三种类别，即液泡蛋白酶（vacuolar
proteases），细胞基质蛋白酶体（the cytosolic proteosome）以及分泌途径的蛋白酶（proteases
located along the secretory pathway）[52; 56]。
表1.2　毕赤酵母液泡蛋白酶和分泌途径蛋白酶[57]
Table 1.2 Proteases of Pichia pastoris vacuole and secretory
pathway[57]
Enzyme & &Type
& &Zymogen
Vacuole & &PrA
& &Aspartic
& &Metallo-( Zn2+)
& &Unknown
& &Metallo-( Zn2+)
& &Metallo-(Co2+)
& &Unknown
Secretory pathway signal peptidase &
&Kex2 protease &
carboxypeptidase &
& &Unknown,predict
& &Yeast aspartyl
protease ш &
&Aspartic &
&Unknown,predict yes
酵母液泡位于基质中，一方面是维持胞内pH和盐离子平衡，储藏盐离子的功能；另一方面，由于液泡中含有大量的非特异性的水解酶，较宽底物范围的内生和异源蛋白酶，液泡是降解蛋白甚至细胞器的一个重要场所，大约80％的蛋白在液泡中降解[57]。
在P.pastoris生长和表达外源蛋白过程中，由于碳源从葡萄糖或甘油到甲醇的改变，甲醇代谢酶系（AOX,FAD,DHAS等）和过氧化氢体逐步积累，同时，相应的蛋白酶也产生了。由于细胞器胁迫的影响，过氧化氢体一部分在基质中自噬降解，大部分过氧化氢体转运到液泡中得到降解[58]。
P.pastoris中位于与细胞膜结合的胞内蛋白酶类可分为蛋白质水解酶（内切酶）和多肽外切酶，由蛋白酶，羧肽酶，氨肽酶类组成[53]。所有的蛋白酶都是由其蛋白酶前体经过酶切活化而成，按照其作用活性位点又分为4类，丝氨酸类蛋白酶、金属蛋白酶、半胱氨酸类蛋白酶和天冬氨酸类蛋白酶。丝氨酸类蛋白酶最适pH值比较高，又叫碱性蛋白酶，而天冬氨酸类蛋白酶需要低的pH范围，又叫酸性蛋白酶[22]。主要的液泡内蛋白酶有以下几种：蛋白酶A（proteinaseA，PrA），蛋白酶B（proteinase
B，PrB），羧肽酶Y（carboxypeptidases Y，CpY），羧肽酶S（carboxypeptidases
S，CpS），氨肽酶I （aminopeptidases I，ApI），氨肽酶Co（aminopeptidase
Co，ApCo），二肽氨肽酶B（Dipeptidyl aminopeptidase
B，DPAP-B）。蛋白酶A，分子量约42kDa，是天冬氨酸类蛋白酶，由基因PEP4表达[59]，其前体能自身催化而形成成熟的蛋白酶，并催化羧肽酶Y前体和蛋白酶B前体形成羧肽酶Y和蛋白酶B；蛋白酶B，分子量约32kDa，丝氨酸类蛋白酶，由基因PRB1表达[60]，对基因PRB1克隆和测序发现是一个很大阅读框，编码一个最少69
kDa的前提[60]，其前体有50％的自身催化成蛋白酶B，另一部分由蛋白酶A催化；蛋白酶A和蛋白酶B是液泡中最基本的蛋白酶，是其他蛋白质水解酶的激活剂。羧肽酶Y，是丝氨酸类蛋白酶，由基因
其生物合成，液泡内分拣和CPY的加工成熟目前研究很清楚[61-63]。PRCl基因编码的羧肽酶Y前体包含一个N-端信号肽，一个含90个氨基酸的前肽和一个含421个氨基酸的酶活区域[64]。羧肽酶Y前体经过高尔基体后切除糖链得到一个69kDa的中间体，然后在液泡中切除前肽形成61
kDa成熟的羧肽酶Y。羧肽酶Y前体（67kDa）没有生物活性，必须在蛋白酶B作用下或蛋白酶A与蛋白酶B共同作用才能形成成熟的羧肽酶Y。羧肽酶S，是一个由基因CPSI编码，依赖于金属离子的羧肽酶，分子量73～77kDa[56].，其合成与膜和内质网相关。氨肽酶I，由基因LAP4编码，是一个含有12个亚基分子量为640
kDa的金属多肽[65]，氨肽酶Co是一个分子量为100kDa
的Co2+金属多肽[66],其机理目前不清楚。二肽氨肽酶B，由基因DAP2
编码的膜接合液泡蛋白酶，在传递到液泡前没有蛋白酶活性[56; 67]。
酵母液泡中的各种蛋白酶量会随着发酵过程中营养条件的改变发生变化，如发酵过程中的饥饿胁迫、碳源改变、热和pH变化及有毒有害产物的形成等。分泌到胞外的重组蛋白降解有可能是由于蛋白酶的过表达而部分分泌到胞外所致和高密度培养时细胞自溶造成膜破裂而释放出蛋白酶两种因素引起。在Sinha的研究中发现当P.
pastoris从甘油生长阶段转为以甲醇为碳源诱导表达阶段时，培养基中的各种蛋白酶量明显增加，远高于一直以甘油作为碳源的实验对照组[68]。
基质蛋白酶体，又称蛋白体，多蛋白酶复合体，多催化功能蛋白酶，存在于真核细胞内，主要完成蛋白酶水解途径的中间过程，其中20S的蛋白酶体，位于所有真核生物的细胞核和细胞间质中，是一个分子量为700
kDa 圆柱形颗粒，由14个不同的亚基折叠缠绕而成。26S蛋白酶体是一个巨型蛋白酶复合物，分子量高达1700 kDa，主要降解依赖
ATP的泛醌类蛋白质，它是由2个19S 蛋白酶体连接到20S
蛋白酶体两端构成[69]，它们主要负责短周期的蛋白质的分拣和快速降解，包括某些对细胞有害的蛋白质。液泡和蛋白酶体降解的互作是调节细胞过程的一个重要方式，特别是对细胞胁迫的响应方面[53;
分泌途径的蛋白酶主要分布在高尔基体和细胞质膜上，其功能是去处去除蛋白酶前体上的多肽[52]，主要的蛋白酶有信号肽（Signal
peptidase），Kex2蛋白酶（Kex2 Endoproteas ），Kexl 羧肽酶（Kexl
carboxypeptidase）二肽氨肽酶A（ Dipeptidyl Aminopeptidase A，
DPAP-A），酵母天冬酰胺蛋白酶III （Yeast Aspartyl Protease III，Yap3
Protease)。信号肽是一个最少包含4个亚基的完整的膜蛋白[56]。Kex2蛋白酶，由基因KEX2编码，其功能是切除COOH-端的Lys-Arg
or Arg-Arg 键残基 [71]。Kexl 羧肽酶，由基因KEXl
编码，是一个特异性的丝氨酸类蛋白酶，二肽氨肽酶A，由基因STE13编码的膜蛋白，酵母天冬酰胺蛋白酶III，其功能是在Kex2蛋白酶的作用下，切除受体COOH-端α因子前体[72]。
在发酵过程中，由于高密度细胞的影响以及部分细胞的裂解，液泡中的蛋白酶常释放到培养基中，导致目的蛋白的降解。在发酵的过程中，随着外源蛋白在培养基中的浓度不断提高，蛋白水解酶浓度也随着升高，对外源蛋白产生降解作用。因此，防止蛋白水解酶的水解作用，提高外源蛋白的稳定性，减少外源蛋白的损失，也就相对地提高了外源蛋白的产量。
2 巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解控制策略
蛋白酶降解是酵母表达系统的共有一个缺陷，降解不仅能引起目的蛋白的产率下降，降解形成的片断还能造成分离纯化极大困难，特别是与目的蛋白分子量大小相差很小的降解产物，由于它们的理化性质接近，常规的分离方法很难将它们分离开来，导致产品收率大大下降，产品纯度低，蛋白的比活性降低。几乎所有在酵母中表达的重组蛋白都或多或少地存在表达蛋白降解问题，只是程度不同而已。而表达蛋白发生降解的不同程度往往是由于发酵培养条件和发酵控制方式不同所致。尽管降解程度有所不同，但引起蛋白降解的直接原因是酵母细胞自身存在的各种蛋白酶。
蛋白质的降解常引起目的蛋白产率的减少，生物活性的降低，并在分离纯化过程中降解产物由于类似的物化或亲和性质而造成产物污染[5]。P.
pastoris表达外源蛋白时的蛋白降解控制策略日益受到重视。为避免蛋白酶的降解，不同的策略得到应用，如2使用蛋白酶缺陷菌株（protease
deficient strains）, 对蛋白质结构进行修饰（modification of the protein
structure）, 添加蛋白酶抑制剂（addition of protease inhibitors）,改变培养基pH（
changing the pH of the culture medium）以及添加在培养基中补加，如酪蛋白水解物（Casamino
acids）、蛋白胨（yeast
peptone）等一些富含氨基酸和多肽的组分。归纳起来可以分为三种水平策略：培养水平(cultivation-level
strategies)，细胞水平( cellular-level strategies )和蛋白质水平策略(protein-level
strategies)[5]。
2.1 培养水平策略
提高分泌蛋白的稳定性可通过改变培养基的pH来加以改善。P. pastoris的pH适应范围比较广，可以在pH
2.8~7的范围内生长。不同的蛋白酶有不同的最佳pH作用范围，选择适当的发酵pH可以不影响细胞的生长，但可降低蛋白酶活性，减少目的蛋白的降解。P.
pastoris在pH 3.0条件下发酵重组水蛭素比pH 5.0下的降解少[73]。pH 6.0
最适人表皮生长因子[20]和白蛋白[74]的表达，在pH 3.0
最适人胰岛素样生长因子、CD4蛋白的V1亚基表达，而咖啡豆半乳糖苷酶在pH4~5不降解，pH高或低均降解，pH 3.0最严重[5;
低温能影响目的蛋白的产量，主要是由于温度较高时，重组蛋白不稳定，以及死细胞释放的蛋白酶的活性增强[76]。Li等[77]实验说明将培养温度从30℃降低到23℃时,毕赤酵母表达鲱鱼抗冻蛋白从5.3mg/L上升到18.0mg/L,
同时也发现活细胞率（cell viability）增加。Hong et al.通过降低发酵温度(从30℃降到
20℃)使表达的laccase活性增强[78]。Jahic et al.[79]应用温度限制流加发酵技术（a
temperature-limited fed-batch
technique，TLFB)获得了更高浓度的融合蛋白，同时细胞死亡率和蛋白酶活性都降低。
通过添加特异性蛋白酶抑制剂也可减少目的蛋白的降解[80]。Shi et al [81]利用毕赤酵母表达抗Mamestra
configurata
serpin单链抗体(scFv)时候，鉴定到存在三种蛋白酶类，即天冬氨酸型蛋白酶、半胱氨酸型蛋白酶及丝氨酸型蛋白酶。通过添加丝氨酸蛋白酶抑制剂，发现发酵液总蛋白酶活性下降53%，添加天冬氨酸蛋白酶抑制剂，总蛋白酶活性下降30%。不过，大规模表达外源蛋白时添加特异性蛋白酶抑制剂使生产成本大幅度上升[81]。另外，尽管特异性蛋白酶抑制剂可提高产物的稳定性，但必须注意的问题是蛋白酶抑制剂与培养基的结合能显著改变部分蛋白组成。例如加入5mM
EDTA到毕赤酵母发酵液培养时会引起一个分子量近50 kDa的蛋白分子在发酵液中的积累，该蛋白序列与S.cerevisiae
和Candida albilabs的exo-B-1,3-glucanase序列很接近[5]。
在培养基中补加一些富含氨基酸和多肽的组分，如酪蛋白水解物（Casamino acids）、蛋白胨（yeast
peptone）、胃蛋白酶水解物等，为蛋白水解酶提供过量的底物，以减少目的蛋白的降解[75]。加入Casamino
acid或YP到培养基中，进一步提高产物的稳定性。把培养基中的pH从5.2增加到6.0，则可显著提高分泌的rHSA产量，再加入YP又可提高其表达的产量[82]。通过添加1%
Casamino acids，mouse epidermal growth factor
(mEGF)表达量显著提高[30]。对于是加入Casamino acid 还是加入YP，通常认为最好加入Casamino
acid，因为YP的肽组成会影响产物的分析和提取。直接添加氨基酸也能有效防止目的蛋白被降解。Won-A Choi等[50]认为0.3M
L-Arg和L-Lys能够有效地防止目的蛋白被胞内蛋白酶酶解。
发酵时控制一定的比生长速率，或利用连续培养的发酵方式。细胞比生长速率同样可影响目的蛋白的降解。通过控制诱导相比生长速率为0.02&0.047h&1，即相应的甲醇浓度为3.09
g/L时候, 毕赤酵母表达水蛭素的降解可控制到最小程度[83]。
2.2 细胞水平策略
产物的稳定性也可通过改造毕赤酵母表达宿主的蛋白酶缺陷型菌株来提高。如SMD1168(his4,pep4)、SMD1165(his4,prb1)和SMD1163(his4,pep4,prb1)[84]。这些菌株在编码蛋白酶A(pep4)和/或蛋白酶B(PRB1)的基因中都有断裂，从而不能表达这些蛋白酶，并且影响其他蛋白酶的加工与成熟[34]。这些蛋白酶缺失的菌株在insulin-like
growth factor-I、ghilanten和laccase的表达中被证明是有效的[37;
85]。这主要是因为使用蛋白酶缺陷型菌株后重组蛋白的降解减少所致。不过也有很多构建的蛋白酶缺陷型菌株表达重组蛋白效率不高，所以使用蛋白酶缺陷型的策略要慎重考虑。另外，这些菌株活性差，生长慢且难转化，Cereghino
和Cregg推荐只有在其他方法不能奏效时才考虑使用[84]。
2.3 蛋白质水平策略
通过将外源蛋白和蛋白水解酶抑制剂共同表达来抑制蛋白酶活性，减少目的蛋白降解，这种策略特别对蛋白酶降解敏感的重组蛋白有效。可将目的蛋白与一种在毕赤酵母中稳定的蛋白伴侣融合表达，通过改变目的蛋白的性质来提高稳定性[86];也可尝试将目的蛋白连上一个过氧化物酶体靶向信号(peroxisomal
targetingsignal,
PTS)，使其被分拣转运入过氧化物酶体贮存起来，免受蛋白酶降解，还可减少对宿主细胞的毒害作用。
总之，为了最大限度减少蛋白质的降解，通过将以上策略进行优化，使用以上一种或者几种培养策略可以高效的获得目的蛋白。高效控制目的蛋白的降解还需要权衡多方面的优化策略，甚至包括调节溶解氧、氨、添加维生素，脂肪酸等来降低蛋白酶的活性[74;
88]。其目的是不仅要得到目的蛋白最大产率或产量，同时也应获得目的蛋白天然生物活性形式[81]。
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